Wistar Albino Sıçanlarında Femur Osteotomi Modeli Geliştirme Protokolü

Özet

Burada, Wistar albino sıçanlarının femurunun şaftını iyatrojenik olarak kırmak ve nasır gelişimini takip etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu femur osteotomi modeli, araştırmacıların kırık iyileşme sürecini değerlendirmelerine ve bir ilacın kırık iyileşmesini nasıl etkileyebileceğini incelemelerine yardımcı olabilir.

Özet

Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir. Osteoanabolik ilaçlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak yüksek maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Amacımız, araştırmacıların femur şaftının kırılmasını takiben nasır oluşumunun gelişimini anlamalarına yardımcı olabilecek ve potansiyel bir ilacın kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek bir femur osteotomi kemirgen modeli geliştirmekti. Yetişkin erkek Wistar albino sıçanları, Kurumsal Hayvan Etik Kurulu izninden sonra kullanıldı. Kemirgenler anestezi altına alındı ve aseptik koşullar altında, açık osteotomi kullanılarak femurların şaftlarının ortada üçte birinde tam enine kırıklar oluşturuldu. Kırıklar intramedüller K-teller kullanılarak azaltıldı ve internal olarak sabitlendi ve sekonder kırık iyileşmesinin gerçekleşmesine izin verildi. Ameliyattan sonra 5 gün boyunca intraperitoneal analjezikler ve antibiyotikler verildi. Sıralı haftalık röntgenler nasır oluşumunu değerlendirdi. Sıçanlar radyolojik olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarına göre kurban edildi ve kırık nasır gelişimi radyolojik olarak ve immünohistokimya kullanılarak analiz edildi.

Giriş

Kemik, kemik oluşturan hücrelerden, osteoblastlardan ve kemik emici hücrelerden, osteoklastlardan oluşan yoğun bir bağ dokusudur. Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir¹. Kırık olduğunda, kırık bölgesinde osteoblastik ve osteoklastik aktivite kemik iyileşmesini belirleyen önemli faktörlerden bazılarıdır². Kırık iyileşmesi normal seyrinden saptığında, gecikmiş bir birleşme, malunion veya birleşmeme ile sonuçlanır. 9 ay boyunca kırığın birleşme başarısızlığı olduğunda, son 3 ay içinde onarımın ilerlemesi olmadan bir kırığın birleşmediği söylenir³. Tüm kırıkların yaklaşık %10-15'inde nonunion 4'e kadar ilerleyebilecek bir onarım gecikmesi^yaşanır. Tüm kırıklarda birleşmeme oranı %5-%10'dur ve tutulan kemiğe ve kırık bölgesine bağlı olarak değişir⁵.

Kırık kaynamamasının tedavisinde mevcut rejim cerrahi ve/veya tıbbi modaliteleri içermektedir. Şu anda, gecikmiş veya kırıkların birleşmemesi, kemik grefti gibi cerrahi stratejilerle aşılabilir. Bununla birlikte, kemik greftlemenin greft dokusunun mevcudiyeti, donör bölge ağrısı, morbidite ve enfeksiyon gibi sınırlamaları ve komplikasyonları vardır⁶. Tıbbi tedavi, kemik morfogenetik proteini (BMP) ve teriparatid (parathormon analogu) gibi osteoanabolik ilaçları içerir. Şu anda kullanılan osteoanabolik ajanlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak fahiş maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir⁷. Bu nedenle, kemik iyileşmesi için uygun maliyetli, cerrahi olmayan alternatifleri belirleme kapsamı vardır. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Kemik iyileşmesini arttırdığı bilinen bir ilaç in vitro olarak değerlendirilmeli ve umut verici bulunursa in vivo hayvan modeli çalışmaları için kullanılabilir. İlaç in vivo modelde kemik oluşumunu ve yeniden şekillenmesini teşvik ettiğini kanıtlarsa, bir sonraki aşamaya (yani klinik çalışmalara) geçebilir.

Hayvanlarda kırık iyileşmesini değerlendirmek, insan denemelerinden geçmeden önce kemik iyileşmesi için tanıtılan yeni bir ajanı değerlendirmek için ileriye doğru atılmış mantıklı bir adımdır. Kırık iyileşmesi ile ilgili in vivo hayvan modeli çalışmaları için, kemirgenler giderek daha popüler bir model haline gelmiştir⁸. Kemirgen modelleri, düşük işletme maliyetleri, sınırlı alan ihtiyacı ve kemik iyileşmesi için daha az zaman harcanması nedeniyle artan ilgi yaratmıştır⁹. Ek olarak, kemirgenler, kemik iyileşmesi ve yenilenmesinin moleküler mekanizmaları üzerine çalışmalara izin veren geniş bir antikor ve gen hedefleri spektrumuna sahiptir¹⁰. Bir fikir birliği toplantısı, çeşitli küçük hayvan kemik iyileştirme modellerini kapsamlı bir şekilde vurguladı ve kemik iyileşmesini etkileyen farklı parametrelere odaklandı, ayrıca birkaç küçük hayvan kırığı modeli ve implantı vurguladı¹¹.

Temel kırılma modelleri genel olarak açık veya kapalı modellere ayrılabilir. Kapalı kırık modelleri, kemik üzerinde üç veya dört noktalı bir bükme kuvveti kullanır ve geleneksel bir cerrahi yaklaşım gerektirmez. İnsanlarda uzun kemik kırıklarına benzeyen eğik veya spiral kırıklara yol açarlar, ancak kırık yerinin ve boyutlarının standardizasyonunun olmaması bunlarda kafa karıştırıcı bir faktör olarak hareket edebilir¹². Açık kırık modelleri, kemiğin osteotomisi için cerrahi erişim gerektirir, kırık bölgesinde daha tutarlı bir kırık paterni elde edilmesine yardımcı olur, ancak kapalı modellere kıyasla gecikmiş iyileşme ile ilişkilidir¹³. Kırık iyileşmesini incelemek için kullanılan kemik seçimi, boyutları ve erişilebilirlikleri nedeniyle esas olarak tibia ve femur olarak kalır. Kırık yerinin seçimi genellikle diyafiz veya metafizdir. Metafiz bölgesi, osteoporotik deneklerde kırık iyileşmesinin çalışıldığı durumlarda özel olarak seçilir, çünkü metafiz osteoporozdan daha fazla etkilenir¹⁴. İntramedüller pimler ve eksternal fiksatörler gibi çeşitli implantlar kırık ^11,15'i stabilize etmek için kullanılabilir.

Bu çalışmanın amacı, araştırmacıların sadece femur kırığını takiben nasır gelişimini anlamalarına yardımcı olmakla kalmayıp, aynı zamanda potansiyel bir ilacın hareket ettiği mekanizmayı anlayarak kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek basit ve takip edilmesi kolay bir kemirgen modeli geliştirmekti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan deneyleri, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi (IAEC), AIIMS, Yeni Delhi, Hindistan'dan (286/IAEC-1/2021) etik onay alındıktan sonra yapılmıştır.

1. Preoperatif prosedür

1. Ev erkek Wistar albino sıçanları, her biri 150-200 g ağırlığında, ayrı ayrı kafeslerde bir Merkezi Hayvan Tesisi'nde (CAF) 6-8 haftalıktır. Bu, birden fazla sıçan kafesleri paylaştığında cerrahi / kırık bölgesi yaralanması olmamasını sağlar.
2. Sıçanları% 50 ±% 5 bağıl neme sahip nem kontrollü bir ortamda 23 ° C ± 2 ° C sıcaklıkta tutun, 12 saatlik karanlık / açık döngüye maruz bırakın ve gıdaya (standart yarı sentetik diyet) ad libitum erişimi verin: pelet diyeti (kuru) ve su. Standart yarı sentetik diyetin bileşimi aşağıdaki gibidir: kavrulmuş Bengal gram unu (% 60), buğday unu (% 22), kazein (% 4), yağsız süt tozu (% 5), rafine yağ (% 4), nişasta ile tuz karışımı (% 4.8) ve nişasta ile vitamin kolin karışımı (% 0.2).
3. Sıçanları ameliyattan önce en az 48 saatlik bir süre boyunca iklimlendirin.
4. Her sıçanı dijital bir tartım terazisinde tartın ve ağırlığı not edin.
5. Cerrahi işleme başlamadan 15 dakika önce sıçanlara intraperitoneal (IP) sefuroksim (100 mg / kg vücut ağırlığı), tramadol (25 mg / kg vücut ağırlığı) ve ketamin (75 mg / kg vücut ağırlığı) ile ksilazin (10 mg / kg vücut ağırlığı) kombinasyonu enjeksiyonları uygulayın. Göz kuruluğunu önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
6. Saçları sağ alt ekstremiteden, yan bölgeden diz eklemine kadar, topikal bir epilasyon kremi uygulamasıyla çıkarın.
   NOT: Farklı parametrelerin temel analizi için her sıçanın kuyruk damarından kan (0,5 mL) toplanabilir. Ameliyattan sonra her 2 haftada bir tekrar kan toplanabilir.

2. Açık osteotomi yoluyla tam transvers kırık oluşturmak için cerrahi prosedür

NOT: İşlemi gerçekleştirmek için ameliyat masası ve optimum ortam sıcaklığı (26 °C) ile belirlenmiş bir ameliyathane kullanın.

1. Balmumu bloğunu (2,5 cm derinliğe kadar balmumu içeren 30 cm x 30 cm x 4 cm'lik alüminyum tepsi) ameliyat masasına yerleştirin ve steril örtülerle örtün. Balmumu bloğu, ameliyat sırasında hayvanın pozisyonunda herhangi bir değişikliği önler.
2. Anestezinin başlangıcını onaylayın (ayak parmağı sıkışma kaybını kontrol ederek). Anestezi uygulanan sıçanı sol lateral pozisyonda steril bir örtü üzerine yerleştirin. Bir asistandan sağ alt ekstremiteyi (diz ve kalça) uzatmada tutmasını isteyin. Femuru desteklemek için sağ bacağın altında steril sert bir destek (mermer blok) bulundurun. Cerrahi bölgeyi alkol ve betadin ile temizleyin.
3. Kesi bölgesine (sağ uyluğun lateral yönü) lokal anestezi (0.25 mL% 1 lignokain) enjekte edin, başka bir steril örtüde bir delik açın ve ameliyat için sıçanın sadece sağ bacağını maruz bırakın.
4. Sağ uyluğun lateral tarafına 1 cm'lik dikey bir deri kesisi verin ve 15 numaralı cerrahi bıçakla ihtiyaca göre uzatın.
5. Metzenbaum makası kullanarak derin fasyayı ayırarak vastus lateralis kasını açığa çıkarın. Vastus lateralis'i, femur şaftına ulaşılana kadar arter forseps kullanarak kas lifleri doğrultusunda bölün.
6. Kemiği, periosteal asansörü kullanarak ona bağlı kaslardan kurtarın.
7. Vazovagal refleksi önlemek için periost içine ve çevresine lokal anestezi (0.2 mL% 1 lignokain) enjekte edin.
8. No.15 cerrahi bıçağı kullanarak femur şaftının orta üçte birinde bir girinti oluşturun ve yapılan girintiye bir keski yerleştirerek (keski kaymasın diye) ve keskiye bir çekiçle hafifçe dokunarak şaftın orta-üçte birinde kemiği kırın (tam kırık). Temiz bir kırılma sağlamak için kemiği kırarken kemiği desteklemek için steril sert desteği (mermer blok) kullanın.
   NOT: Steril sert destek genellikle altındaki kaslarda önemli bir yaralanmaya neden olmaz.
9. Pille çalışan bir elektrikli matkap yardımıyla tutulan steril bir K-teli (1,0 mm) kullanarak kırığı dahili olarak sabitleyin. K-telini kırık bölgesinden distal fragmanın medüller kanalına geçirin. Ardından, pille çalışan elektrikli matkabı kullanarak K-telini femur distal ucundan delin.
   NOT: Kullanmadan önce elektrikli matkabın yüzeyini alkolle dezenfekte edin. K-teli sabitlendikten sonra eldivenleri değiştirin.
10. Kırığı indirgedikten sonra, K-telini distal uçtan proksimal parçanın kanalına doğru trokanterik bölgede satın alınana kadar ilerletin. Bir tel kesici kullanarak deriden çıkıntı yapan K-telinin distal kısmını kesin.
11. Pense kullanarak K-telinin ucunu yaklaşık 90 ° 'ye bükün ve pim bölgesi pansumanı için betadin'e batırılmış bir gazlı bez bandajı kullanın. K-teli, kırığı azaltılmış bir konumda tutmak için intramedüller bir atel görevi görür.
12. 3-0 naylon dikiş kullanarak cildi kapatmadan önce tam hemostaz sağlayın. Herhangi bir kanamayı durdurmak için steril gazlı bez veya arter forseps kullanarak kanama bölgesine baskı uygulayın.
13. Yarayı betadin ile temizleyin ve steril gazlı bez ve mikrogözenek yapışkan bant ile örtün.

3. Postoperatif bakım

1. Sıçanları kafeslerine geri döndürün, normal ambulasyona izin verin ve işlemden sonraki 5 gün boyunca intraperitoneal olarak antibiyotikler (enjeksiyon sefuroksim 100 mg / kg) ve analjezikler (enjeksiyon tramadol 25 mg / kg / gün) feda edilene kadar standart bir yarı sentetik diyet vermeye devam edin.
   NOT: Sıçanlar, belirli bir ilacı test etmek için tedavi ve kontrol gruplarına ayrılabilir. İlaç suda çözünürse, gavage yoluyla oral olarak verilebilir. Kullanılacak ilacın dozunu hesaplamak için bireysel hayvanların ağırlığı not edilebilir. Hayvan gruplarının homojenliğini sağlamak için dahil etme ve dışlama kriterleri takip edilebilir.
2. Hayvanları ameliyat öncesi döneme benzer koşullar altında bireysel kafeslerde barındırın. Ameliyat sonrası ağrı, yara enfeksiyonu, dikişlerin kayması veya herhangi bir karın şişmesi veya rahatsızlığı belirtisi aramak için her gün cerrahi bölgeyi kontrol edin.
3. Kemik iyileşmesini haftada bir kez kırık bölgenin röntgeni ile değerlendirin.

4. Radyolojik prosedür

1. X-ışınından önce, sıçanları intraperitoneal ketamin (50 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (5 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile uyuşturun.
2. Aşağıdaki maruz kalma ayarlarıyla kırık uzuvun röntgenini çekmek için diz eklemi yarı esnek tutulurken, sıçanın kalça eklemini bükülmüş ve kaçırılmış bir pozisyonda tutun: Ref. kVp ≈ 62; Referans mAS = 6.4; ve otomatik pozlama ayarları (Referans mA=160).
   NOT: X-ışınları başlangıçta (ameliyattan 1 gün sonra) ve daha sonra kurban edilene veya 5 haftaya kadar haftada bir kez alındı.

5. Hayvan ötenazisi ve nasır alımı

1. Sıçanları, sırasıyla yumuşak ve sert köprüleme nasırlarının radyolojik görünümüne dayanarak, daha önce belirlenmiş iki zaman noktasında, aşırı dozda karbondioksit (1 dakika boyunca 7-8 L / dak akış hızında% 100 CO₂ uygulayın, ardından 4-5 dakikalık bir bekleme süresi uygulayın) feda edin.
2. Cildi femura paralel olarak kesin ve nasır dokusuna zarar vermemek için üstteki kasları dikkatlice ayırın.
3. Kalça eklemi ve nasır dokusu arasındaki kemiği çekiç ve keski kullanarak kırın. Benzer şekilde, nasır ve diz eklemi arasındaki kemiği kırın. K-telini çıkarın ve kan pıhtılarını ve yumuşak dokuyu çıkarmak için kemik parçasını tuzlu suda temizleyin.
4. Nasırı hemen% 10 nötr tamponlu formalin (numune başına 20 mL) içeren etiketli bir kaba aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 3 gün boyunca saklayın.

6. Kemik ve nasır dokusunun kireçlenmesi

1. Nasır dokusunu formalinden alın ve kemik dokusunun dekalsifikasyonu için% 20 ETDA çözeltisinde, pH 7'de RT'de tutun.
2. Yaklaşık 3 hafta boyunca her 2 günde bir taze EDTA solüsyonunu değiştirin ve nasır dokusunu rahatsız etmeden kemiği bir iğneyle dürterek kemik dekalsifikasyonunu kontrol edin. Optimal dekalsifikasyon, kemik dokusunun normal kumlu hissinin kaybı ile gösterilir.
3. Tamamen kireçlenmeden sonra, nasırın sagital bölümünü kesin ve nasır dokusunun parafin bloklarını hazırlayın. Histopatolojik¹⁶ ve diğer karşılaştırmalı analizler¹⁷ için nasır dokusunun 4 μm kalınlığındaki kesitlerini kesin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışma Wistar albino sıçanlarında femur osteotomi modeli geliştirmek amacıyla yapılmıştır. Bu model, kemik iyileşmesini ve umut verici bir osteoanabolik ilacın kemik iyileşmesinde osteojenik etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Standart cerrahi önlemler ve protokoller takip edildi. İşlem için steril önlükler, perdeler ve cerrahi ekipmanlar kullanıldı (Şekil 1). Ekipman (Tablo 1) ameliyattan 48 saat önce sterilize edildi. Hayvanların h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yöntem, Wistar albino sıçanlarında kırık osteotomi modeli geliştirmek için gereken ayrıntıları açıkça açıklamaktadır. Bu model, umut verici bir osteoanabolik ilacın kırık iyileşmesindeki osteojenik etkisini değerlendirmek ve kemik iyileşmesinin inceliklerini anlamak için kullanılabilir. Bu yöntemin göze çarpan özelliği, basit olması ve çok fazla zamana veya sofistike ekipmana ihtiyaç duymamasıdır. Bu yöntemde, deneyler için kemirgen modeli olarak yetişkin erkek Wistar albino sıç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2