Method Article
דלקת המוח האוטואימונית היא קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים של מערכת העצבים המרכזית. ניתן להשתמש בנוירונים בהיפוקמפוס כדי לגלות ולאפיין נוגדנים אלה. מאמר זה מספק פרוטוקול לתרבית תאים ראשונית ואימונוסטינינג כדי לקבוע נוגדנים עצמיים בסרום ובנוזל המוח והשדרה של חולים.
במהלך 15 השנים האחרונות, קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) אופיינה ומוגדרת כיום כ"דלקת מוח אוטואימונית" (AE). ישנן כיום 17 תסמונות AE ידועות, וכולן קשורות לנוגדנים כנגד פני התא העצבי או חלבונים סינפטיים. התסמונות הקליניות מורכבות ומשתנות בהתאם לסוג הנוגדן הקשור. הידועה ביותר מבין מחלות אלה היא אנטי-N-מתיל D-אספרטט קולטן (NMDAR) דלקת המוח, שהיא הפרעה נוירופסיכיאטרית בולטת הקשורה לליקויים חמורים בזיכרון ובהתנהגות. הנוגדנים הקשורים מגיבים עם תת-היחידה GluN1 של NMDAR בתחום N-terminal. הגישה הנפוצה ביותר לגילוי ואפיון של נוגדני AE כוללת את התרבות של נוירונים היפוקמפליים מנותקים, עובריים, מכרסמים. בתהליך אפיון הנוגדנים, נוירונים חיים בתרבית נחשפים לסרום או ל-CSF של המטופלים, וזיהוי תגובתיות מצביע על כך שדגימות הסרום או ה-CSF של המטופל מכילות נוגדנים נגד אנטיגנים של פני השטח העצביים. תרביות היפוקמפוס יכולות לשמש גם כדי לקבוע אם הנוגדנים בחולים הם פתוגניים פוטנציאליים על ידי בדיקה אם הם גורמים לשינויים מבניים או תפקודיים של הנוירונים. רמת ההצלחה של מחקרים אלה תלויה באיכות התרביות ובפרוטוקולים המשמשים להשגת וזיהוי תגובתיות דגימות המטופלים. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי לתרבית תאים ראשונית של נוירונים היפוקמפליים של חולדות עובריות בשילוב עם אימונוסטינינג כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים בסרום או CSF של חולים. דוגמה לאופן שבו ניתן לבחון את ההשפעות הפתוגניות הפוטנציאליות של נוגדני NMDAR באמצעות נוירונים בתרבית והדמיית סידן מוצגת גם כן.
דלקת מוח אוטואימונית (AE) היא קטגוריה שהתגלתה לאחרונה של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המתווכת על ידי נוגדנים המכוונים לפני השטח העצביים או חלבונים סינפטיים 1,2. המאפיינים הקליניים משתנים בהתאם לנוגדן, אך בדרך כלל כוללים פגיעה בזיכרון ובקוגניציה, שינוי בהתנהגות ובתסמינים פסיכיאטריים, תנועות לא תקינות, הפרעות בתפקוד השינה, ירידה ברמת ההכרה והתקפים. הפרעות אלה יכולות להשפיע על אנשים בכל הגילאים, עם סוגים מסוימים של AE המשפיעים בעיקר על ילדים ומבוגרים צעירים2.
במהלך 15 השנים האחרונות תוארו 17 תסמונות AE עם נוגדנים כנגד חלבונים ספציפיים על פני השטח העצביים/סינפטיים (טבלה 1). כמה דוגמאות למטרות העצביות כוללות את הקולטנים המעוררים הסינפטיים NMDAR3,4 ו- AMPAR5, הקולטן המעכב הסינפטי GABAbR6, החלבון המופרש העצבי LGI17, ומולקולת הידבקות התאים IgLON58. עבור רוב אלה AE, מחקרים הראו כי נוגדנים משבשים את המבנה או התפקוד של אנטיגן המטרה שלהם, תומך מאוד בתפקיד פתוגני. לדוגמה, בדלקת מוח אנטי-NMDAR, הנוגדנים מגיבים עם תחום N-terminal של תת-היחידה GluN1 של NMDAR, ומייצרים הפנמה סלקטיבית והפיכה של קולטנים אלה שמביאה לשינויים נוירופסיכיאטריים בולטים 4,9,10,11. לפיכך, זיהוי של כל אחד 17 נוגדנים ידועים בסרום או CSF של המטופל יכול לשמש גם כמבחן אבחון הקובע את האבחנה של AE מסוים.
אחת הטכניקות הנפוצות יותר לזיהוי ואפיון של נוגדנים אלה כוללת שימוש בתרביות של נוירונים היפוקמפליים מנותקים, עובריים, מכרסמים. תרביות אלה שימושיות מכמה סיבות: המוח העוברי קל לניתוק ומכיל רמה נמוכה של תאי גליה, המקור העיקרי לזיהום בתרביות נוירונים12; אוכלוסיית התאים בהיפוקמפוס הומוגנית יחסית בהשוואה לרוב האזורים האחרים של מערכת העצבים המרכזית, כאשר תאים פירמידליים מייצגים את הרוב המכריעשל 13,14; תרביות מוכנות מעוברים בשלב מאוחר כאשר הדור של נוירונים פירמידליים הושלם אך תאי גרגיר עדיין לא התפתחו, מה שמוסיף עוד יותר להומוגניות של התרבית; כאשר נוירונים פירמידליים מתורבתים, מבטאים את רוב התכונות הפנוטיפיות העיקריות שלהם, מסוגלים ליצור דנדריטים מפותחים היטב, ולהקים רשתות מחוברות סינפטיות שיכולות לשמש לחקירות מבניות ואלקטרופיזיולוגיות12,13; מכיוון שנוגדנים אינם יכולים לחדור לנוירונים חיים, השימוש בתרביות חיות מאפשר זיהוי של מטרות אנטיגניות השוכנות על פני התא; ומיצוי חיסוני של קומפלקס הנוגדן-אנטיגן מתרביות נוירונים מאפשר זיהוי של אנטיגן המטרה5.
הצלחת המחקרים המשתמשים בתרביות נוירונים תלויה מאוד באיכות התרביות ובפרוטוקולים המשמשים להערכת הפעילות החיסונית של סרום או נוזל המוח והשדרה של המטופל (CSF). משתנים שיכולים להשפיע על התרביות כוללים את ההליכים לבידוד ההיפוקמפוס לפני התפתחות התרבית, הדיסוציאציה של הרקמה, צפיפות הציפוי, משטח הצמיחה המשמש והרכב המדיה13,15,16. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי לתרבית תאים ראשוניים של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות עובריות בשילוב עם חיזוק חיסוני פלואורסצנטי שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים נגד אנטיגנים ידועים של AE ומטרות פוטנציאליות חדשות על פני השטח. הוא גם מספק דוגמה כיצד לבחון את ההשפעות הפתוגניות של נוגדני NMDAR על ידי טכניקות הדמיה של תאים חיים באמצעות נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית המבטאים מחוון סידן מקודד גנטית (GECI) ממשפחת GCaMP, GCaMP5G.
חלבון מטרה | תפקוד חלבונים | תא תא | תסמונת ראשית |
NMDAR | יון שאנל | חלבון סינפטי | דלקת המוח נגד NMDAR |
אמפאר | יון שאנל | חלבון סינפטי | דלקת המוח הלימבית |
גלוק2 | יון שאנל | חלבון סינפטי | דלקת המוח |
GABAaR | יון שאנל | חלבון סינפטי | דלקת המוח |
GABAbR | קולטן מטאבוטרופי | חלבון סינפטי | דלקת המוח הלימבית |
mGluR1 | קולטן מטאבוטרופי | חלבון סינפטי | דלקת המוח |
mGluR2 | קולטן מטאבוטרופי | חלבון סינפטי | דלקת המוח |
mGluR5 | קולטן מטאבוטרופי | חלבון סינפטי | דלקת המוח |
D2R | קולטן מטאבוטרופי | חלבון סינפטי | דלקת המוח של הגרעינים הבסיסיים |
LGI1 | מולקולת הידבקות | חלבון פני התא | דלקת המוח הלימבית |
CASPR2 | מולקולת הידבקות | חלבון פני התא | דלקת המוח הלימבית |
איגלון5 | מולקולת הידבקות | חלבון פני התא | מחלת אנטי-IgLON5 |
נוריקסין-3α | מולקולת הידבקות | חלבון פני התא | דלקת המוח |
DNER (Tr) | חלבון טרנסממברנה | חלבון פני התא | דלקת המוח |
SEZ6L | חלבון טרנסממברנה | חלבון פני התא | דלקת המוח |
אמפיפיסין | מולקולה מבנית | חלבון פני התא | דלקת המוח הלימבית |
DPPX | פפטידאז | חלבון פני התא | דלקת המוח |
טבלה 1: נוגדנים לפני השטח של התא העצבי ולחלבונים סינפטיים.
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת ברצלונה בעקבות התקנות האירופיות (2010/63/UE) לגבי שימוש וטיפול בחיות ניסוי. התקבלה הסכמה מדעת בכתב ממטופלים, והמחקר אושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית לשימוש בדגימות אנושיות (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).
הערה: ישנם שלושה חלקים בפרוטוקול הנוכחי. הראשון הוא להקמת תרבויות נוירונים, השני הוא לזיהוי של נוגדנים פני השטח באמצעות תרביות חיות של נוירונים, והשלישי הוא לקבוע את הפתוגניות של נוגדנים אלה.
חלק 1: הקמת תרביות עצביות היפוקמפוס מנותקות, עובריות, מכרסמים
1. שלבי הכנה
2. דיסקציה וזריעה (איור 1)
חלק 2: שימוש בתרביות נוירונים בהיפוקמפוס לזיהוי נוגדנים בחלבוני פני השטח של התא העצבי
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מדגים כיצד תרביות היפוקמפוס משמשות לזיהוי נוגדנים נגד NMDAR בסרום ו / או CSF של חולים עם דלקת מוח אנטי NMDAR. אימונוסטינינג פלואורסצנטי משמש כדי לדמיין את תגובתיות הנוירונים החיים, אך ניתן להשתמש גם בשיטות הדמיה אחרות. בקרה מתאימה לניסוי זה תהיה סרום או CSF מאדם בריא. בעת שימוש בדגימות אנושיות, יש לזכור כי ייתכן שיידרש אישור מוועדת האתיקה המוסדית.
3. חיסון פלואורסצנטי חי
חלק 3: הדגמה של השפעות פתוגניות נוגדנים באמצעות הדמיית סידן
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מדגים כיצד לקבוע אם לנוגדנים בחולים יש השפעה תפקודית על התרביות, מה שמרמז על פתוגניות. על מנת להגדיל את משמעות ההשפעות, נעשה שימוש במאגר של CSF משמונה חולים. פעילות הסידן של התרביות החיות נרשמה על גירוי כימי (NMDA + גליצין) באמצעות מחוון סידן פלואורסצנטי GECI (GCaMP5G). מחקרים אלה דורשים מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם תא תא שיכול לשמור על התנאים הפיזיולוגיים הנדרשים של הנוירונים.
4. הדמיית סידן
הקמת תרביות עצביות היפוקמפוס מנותקות, עובריות, מכרסמים
הפרוטוקול המוצג כאן מבוסס על המחקרים המשפיעים על גידול תאי עצב שבוצעו על ידי בנקר וגוסלין15. הפרוטוקול שוכלל כדי להשיג תרביות נוירונים עם מורפולוגיה, צפיפות וטוהר אופטימליים לביצוע מחקרי זיהוי נוגדנים על פני השטח של תאי עצב. פרוטוקול הדיסקציה והזריעה מחולק לשלושה חלקים (איור 1A). החלק הראשון, בידוד ההיפוקמפוס, מורכב ממיצוי כירורגי של הרקמה החיה (איור 1A, פאנל שמאלי). כפי שעולה מהאיור, חולדות Wistar הרות עם עוברי E18 הן חומר המוצא העיקרי לתרבות מצליחה. ברגע שהמוח מופק מעוברי E18, המיקרו-כירורגיה מתבצעת תחת סטריאומיקרוסקופ. בעזרת כלים מתאימים (איור 1B) וטיפול מדויק, ניתן להפריד את ההיפוקמפוס משאר רקמת העצב. הנטייה של רקמות במדיה הספציפית מתוארת באיור 1C. החלק השני של הפרוטוקול מורכב מהדיסוציאציה של תאי ההיפוקמפוס. הוא מחולק לשני שלבים (איור 1A, פאנל אמצעי): דיסוציאציה אנזימטית ודיסוציאציה מכנית של ההיפוקמפוס, וכתוצאה מכך תאים בודדים, מנותקים. באמצעות מתודולוגיה זו ניתן להשיג תרביות תאים ללא אגרגטים של תאים, כפי שמיוצג באיור 2A-D. החלק השלישי של הפרוטוקול מורכב מזריעת התאים (איור 1A, פאנל ימני). חלק זה של הפרוטוקול הוא חיוני על מנת להתאים את הצפיפות וההומוגניות של התרבות העצבית בצלחת. ספירת התאים וזריעת 50,000 תאי עצב באזור של צלחת בגודל 3.5 ס"מ מספקת צפיפות אופטימלית לביצוע לא רק ניסויים כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים לחלבונים על פני השטח של התא העצבי (איור 3), אלא גם לנתח את הפתוגנטיות של נוגדנים אלה באמצעות הדמיית סידן (איור 4).
איור 1: פרוטוקול חזותי לתרביות ראשוניות של נוירונים בהיפוקמפוס. (A) תרשים זרימה המציג את שלושת חלקי הפרוטוקול להכנת תרביות תאים מנותקים של נוירונים בהיפוקמפוס מחולדות עובריות ב-E18. הפרוטוקול מחולק ל -1. בידוד בהיפוקמפוס, 2. דיסוציאציה של תאים, ו-3. זריעת תאים. (B) בחירת כלים מומלצים לבידוד בהיפוקמפוס המקובצים לשלוש קטגוריות: (1- מלקחיים, 2- מלקחיים מעוקלים, 3- מספריים) לאיסוף עוברים, (4- מלקחיים מעוקלים עדינים, 5- מלקחיים ישרים-עדינים, 6- מספריים כירורגיים) לחילוץ המוח, ו-(7- מלקחיים בזווית עדינה, 8- מספריים קפיציים מדויקים) לבידוד בהיפוקמפוס. (C) ייצוג סכמטי של מגש קרח 1 עם צלחות ומדיה הדרושים לבידוד ההיפוקמפוס. עוברים וראשים ממוקמים ב-HBSS, ואילו מוחות ממוקמים במצב שינה בינוני + B27. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרביות של נוירונים בהיפוקמפוס בגיל 18 div הן בוגרות, מחוברות זו לזו ומבטאות חלבונים מבניים ותפקודיים
בגדילה ובהתבגרות של תרביות עצביות, ניתן להעריך שני שלבים מובחנים: שלב הקיטוב של תא העצב (איור 2A,B) ושלב ההתפתחות והבנייה הדנדריטית של הרשת הסינפטית (איור 2C,D). תאים על צלילה אחת מתחלקים באופן שווה ונדבקו לצלחת, ומפתחים למלה סביב גוף התא עם נויריטים קלים שמתחילים להתרחב (איור 2A). לאחר כמה ימים בתרבית, הנוירוריטים משתרעים למרחק קצר. התאים מראים קיטוב משמעותי, אך יש צמיחה נטו קטנה (איור 2B). לאחר שלב זה, סינפטוגנזה בולטת, והנוירונים מתחילים להתחבר. הרשת העצבית ממשיכה לגדול ונעשית מורכבת יותר (איור 2C). בגיל 18, תאי העצב בוגרים ומחוברים זה לזה; הרשת העצבית בנויה (איור 2D). ברגע שעמודי השדרה הסינפטיים נוצרים ומחוברים, תאי העצב מקוטבים לחלוטין ומבטאים את כל החלבונים הפונקציונליים והמבניים. מבין החלבונים הרבים המתבטאים על-ידי תאי עצב בוגרים בתרבית, הקולטן העצבי NMDA (איור 2E) והחלבון הסינפטי PSD95 (איור 2F) נבחרו כאן כסמנים מייצגים. יתר על כן, אפשר לדמיין אקסונים באופן סלקטיבי על-ידי תיוג נוירופילמנט (NF) (איור 2G) והדמיה של דנדריטים על-ידי התמקדות בחלבון MAP2 (איור 2H).
איור 2: מהלך הזמן של ההבשלה של תרביות תאים מנותקים של נוירונים בהיפוקמפוס. (A-D) תמונות ניגודיות פאזה של נוירונים בהיפוקמפוס במהלך 18 הימים הראשונים של התרבית. (A) תאי עצב ב-1 צוללים עם ההצמדה למצע המצופה PLL. (B) הופעתם של נויריטים קטנים בתאי עצב ב-5 div. (C) נוירונים ב-11 div פיתחו נויריטים ארוכים שמתארכים ורוכשים מאפיינים אקסונאליים. (D) תאי עצב ב-18 div הם בוגרים ויצרו רשת עצבית. סרגל קנה מידה (A-D) = 40 מיקרומטר. (E-H) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות שצולמו על ידי מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית באמצעות סמנים סלקטיביים כדי להראות נוירונים בוגרים ב-18 div. תרביות נוירונים היו קבועות ומוכתמות בנוגדנים שמכתימים באופן סלקטיבי את הקולטן העצבי (E) (NMDAR), (F) סמן סינפטי (PSD95), (G) סמן אקסונאלי (נוירופילמנט, NF) ו-(H) סמן דנדריטי (MAP2). סרגל קנה מידה (E-H) = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
נוגדנים בדגימות מטופלים מגיבים עם אנטיגנים על פני השטח של התאים העצביים
הדגימות (סרום ו- CSF) המתקבלות מחולים הסובלים מדלקת המוח נגד NMDAR מכילות נוגדנים עצמיים המזהים את ה- NMDAR הקיים על פני השטח של נוירונים. הדגירה של התרביות עם דגימות המטופלים מייצרת אות פלואורסצנטי אינטנסיבי על פני התא ועל הדנדריטים (איור 3A,C). לעומת זאת, דגימות בקרה אינן מייצרות אות פלואורסצנטי כאשר הן ניתנות לתרביות העצביות (איור 3B,D). ממצאים אלה מראים כיצד ניתן להשתמש בתרביות כדי לסנן דגימות של מטופלים אחר נוגדנים, ויכולים להוביל לזיהוי נוגדנים חדשים המכוונים לפני השטח של התא העצבי.
דגימת CSF מהחולה מפחיתה את ריכוז הסידן התוך-תאי בתרביות המושרות על-ידי NMDA של נוירונים בהיפוקמפוס
כדי להעריך את השפעת הנוגדנים של המטופלים על הפעילות העצבית (לאחר טיפול של 24 שעות), נטרו באופן אופטי מעברי סידן תוך תאיים מהנוירונים בתרבית בזמן אמת על גירוי בתיווך NMDA. היישום של NMDA יוצר עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה, כפי שמעיד שינוי בפלואורסצנציה הירוקה התוך-תאית (איור 4A ווידאו משלים 1). תאי עצב שטופלו בדגימת CSF של הבקרה הראו הבדל גבוה יותר בעוצמת הפלואורסצנטיות (56%) כאשר הגירוי הופעל בהשוואה לתאים שטופלו בדגימת CSF של המטופל. ההבדלים בעוצמת הפלואורסצנציה נמדדו, ועקומות הגירוי בתיווך NMDA מהנתונים שחולצו מהסומא של התאים הושוו (איור 4B,C). עקומות הגירוי מראות כי היה זרם תוך-תאי של סידן בשני התרחישים, אך התרביות שטופלו ב-CSF (קו אפור) של המטופלים הראו תגובה נמוכה יותר מאשר התרביות שטופלו בביקורת (קו שחור). תוצאות אלה מראות כי הנוגדנים הנמצאים ב-CSF של המטופלים מפחיתים את הפעילות התאית עקב האינטראקציה של הנוגדנים עם ה-NMDAR, ובכך גורמים להשפעה פתוגנית.
איור 3: נוגדנים של מטופלים מגיבים עם פני השטח של תרביות עצביות . (A,E) סרום ו-CSF מחולים עם דלקת המוח נגד NMDAR מגיבים עם פני התא של נוירונים חיים בהיפוקמפוס של חולדה, (B,F) ואילו הסרום וה-CSF של נבדקי הביקורת לא מראים תגובתיות. סרגל קנה מידה (A,B,E,F) = 20 μm. תמונת הגדלה גבוהה יותר של דנדריט (63x) המציגה את תבנית פני השטח האופיינית של תגובתיות עבור (C,G) הסרום של המטופל ו-CSF ו-(D,H) שלילית עבור בקרות. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: נוגדנים של מטופלים מפחיתים את זרם הסידן בתאי עצב של חולדות המבטאים GCaMP5G. (A) מתן תמיסת גירוי (NMDA [100 μM] + גליצין [1 μM]) בתרביות של נוירונים עורר זרם סידן, כפי שצוין על ידי הגדלת פלואורסצנטיות ירוקה תוך תאית (שיא הגירוי), בהשוואה לתמונה שצולמה לפני הגירוי (טרום גירוי). לאחר 120 שניות, עוצמת הפלואורסצנציה יורדת ומתייצבת (לאחר הגירוי). תרביות שטופלו ב-CSF של המטופלים הראו ירידה משמעותית (56%) בעלייה בסידן בתיווך NMDA בהשוואה ל-CSF של הביקורת. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) תרשים של אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים המייצגים את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן (180 שניות) עבור התרביות שטופלו ב-CSF (קו שחור) של הבקרה ו-CSF (קו אפור) של המטופלים על גירוי NMDA (חץ כחול). n(CSF של בקרות) = 20 תאים; n (CSF של המטופלים) = 28 תאים. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. (C) חלקות תיבה מציגות את האחוזון החציוני, ה-25 וה-75. שפם מציין את ערכי המינימום והמקסימום. הערכת המשמעות בוצעה על ידי ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA; p < 0.0001) ומבחני Mann-Whitney U (p < 0.0001). ערך של p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
סרטון משלים 1: סרטון המציג שני נוירונים בהיפוקמפוס המבטאים GCaMP5G זה לצד זה: נוירון שטופל ב-CSF של Control (משמאל) לעומת נוירון שטופל ב-CSF של המטופלים (מימין). היישום של NMDAR (גירוי) יוצר עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה התוך-תאית בשני המקרים, אך עם רמה גבוהה משמעותית בנוירון המטופל ב- CSF של הבקרה לעומת זה שטופל ב- CSF של המטופלים. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ונערכו באמצעות ImageJ החלת טבלת בדיקת המידע (LUT) Fire. 1700 מסגרות (170 שניות); מואץ 5 פעמים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
התחום ההולך וגדל של אוטואימוניות בתיווך נוגדנים פתח חלון הזדמנויות לזיהוי נוגדנים עצמיים עצביים שניתן להשתמש בהם כדי לשפר את האבחון והטיפול בחולים. תרבויות של נוירונים בהיפוקמפוס הן כלי חיוני לזיהוי נוגדנים; לכן, חשוב לבצע פרוטוקול סטנדרטי כדי לקבל תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. השלבים החשובים ביותר שיש לקחת בחשבון, מגבלות ופתרון בעיות, נדונים כאן.
ניתן לקבץ את השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה לשלוש קטגוריות, תלוי אם הם משפיעים על הטוהר, על ההומוגניות או על הכדאיות של הנוירונים בהיפוקמפוס.
טוהר - כדי להשיג תרביות תאים ראשוניות אופטימליות, על החוקר להיות בטוח בעצמו, מאומן ומסוגל לעבוד במהירות, במיוחד כדי למזער את זמן הנתיחה. גם אם תאי עצב פירמידליים הם סוג התא העיקרי, ההיפוקמפוס מכיל מגוון של אינטרנורונים14. כדי ליצור תרביות עם תאי גליה מינימליים, יש לחלץ את ההיפוקמפוס עם הרקמה המינימלית שמסביב. השימוש ברקע שחור במהלך הדיסקציה מסייע לזהות את גבולות ההיפוקמפוס תחת הסטריאומיקרוסקופ. בנוסף, יש לקחת בחשבון כי צפיפות תאים נמוכה יותר לגרום פחות תמיכה paracrine ולעשות את זה יותר קשה לשמור על התרבית13. לכן, חשוב לזכור את האיזון הזה. זה חשוב במחקרי הדמיה המשתמשים במספר נמוך של תאים (50,000 נוירונים לכל צלחת של 3.5 ס"מ). כדי להיות מסוגל לקבל זמן נוסף עבור מיצוי ההיפוקמפוס, מדיה Hibernate המשמר את הרקמהיש להשתמש 17. עבודה עם כלי ניתוח נאותים היא גם חיונית. כלים ברמת דיוק גבוהה הם עדינים, ולכן יש להבטיח את יכולת השחזור של הטכניקה על ידי הגנה קפדנית עליהם.
הומוגניות - כדי לפתח תרבית ללא אגרגטים של תאים, הדיסוציאציה המכנית של התא שודרגה על ידי שילוב של פיפטות זכוכית משוכות מראש עם פיפטה סטנדרטית של 1,000 μL.
כדאיות - בפרוטוקול זה לא נוספו אנטיביוטיקה מכיוון שהם משפיעים על ההתרגשות העצבית ומשנים את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירונים בתרבית18. לכן, זיהום סביר מאוד אם הסטנדרטים הגבוהים ביותר של סטריליות אינם נשמרים. הטמפרטורה היא גם גורם מפתח. שמירה על הרקמה קרה במהלך בידוד ההיפוקמפוס מאטה את חילוף החומרים ומפחיתה את השפלת התאים. הרקמה הוחזקה, אם כן, על קרח עד לתהליך הדיסוציאציה של התא. יתר על כן, חיוני למצוא את האיזון הנכון במהלך דיסוציאציה אנזימטית של תאים המפרקים את התאים ללא תזה של תאים מסומנים. בפרוטוקול זה, תזמוני הדגירה עם טריפסין ושלבי הכביסה הבאים עברו אופטימיזציה כדי להשיג תאים בודדים עם מספיק מקום כדי לאפשר יצירת רשת עצבית מתאימה.
צעדים קריטיים נמצאים גם ברישומי פעילות חיסונית חיה פלואורסצנטית ובפעילות סידן מתרביות הנוירונים. כדי לבצע בדיקות חיסוניות חיות מוצלחות לקביעת נוכחות נוגדנים לחלבונים על פני התא בדגימות של מטופלים, יש להימנע מחדירה של התאים שתאפשר לנוגדנים גישה לחלבונים תוך-תאיים. בנוסף, בהתבסס על titer של הנוגדנים, זמן הדגירה ודילול הדגימה צריכים להיות מותאמים בהתאם (למשל, נוגדני טיטר גבוהים מאוד יכולים לתת כתם רקע שמקשה על פירוש התוצאות). בעת ביצוע הערכת הפתוגניות של הנוגדנים העצמיים עם הדמיית סידן, יש להשתמש במדיה אופטימלית למדידות פעילות תאית (למשל, דיכוי Mg2+ במדיום התרבית חשוב לביצועים טובים). יתר על כן, עבור הדמיה פלואורסצנטית, יש להימנע ממדיה עם מחווני pH כגון פנול אדום מכיוון שהיא מציגה אות רקע לא ספציפי.
ישנן שתי מגבלות עיקריות של השימוש בתרביות נוירונים בהיפוקמפוס. ראשית, בהשוואה לקווי תאים יציבים, תרביות ראשוניות חייבות להיווצר ברציפות, וזה מרמז על שימוש בחיות מעבדה באופן קבוע. קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) יכולים להחליף את הצורך בשימוש במודלים של בעלי חיים, אך פרוטוקולי ההתמיינות עבור iPSC עדיין אינם אופטימליים. שנית, נוירונים שמקורם ב- iPSC אינם מבטאים את הספקטרום המלא של חלבוני פני השטח, ולכן, אם נעשה בהם שימוש, היעדר תגובתיות אינו מרמז בהכרח על השליליות של המדגם19.
ישנן שלוש שיטות לסינון נוכחות של נוגדנים עצמיים בסרום או ב-CSF של חולים החשודים כבעלי AE: בדיקה מבוססת רקמה (TBA) באמצעות רקמת מוח של חולדה, בדיקה מבוססת תאים (CBA) באמצעות תאי HEK שעברו טרנספקציה כדי לבטא חלבונים עצביים, והיישום המדווח כאן באמצעות תרביות חיות של נוירונים בהיפוקמפוס19. החשיבות של שיטת נוירוני ההיפוקמפוס בתרבית טמונה ביכולתה להבדיל בין תגובתיות לבין אנטיגנים על פני השטח ואנטיגנים תוך-תאיים שאינם ניתנים להבחנה בקלות על-ידי TBA. חוץ מזה, תרביות נוירונים ראשוניות, בניגוד ל-CBA בתאי HEK שעברו טרנספקציה, אינן מוגבלות על ידי הרפרטואר של חלבונים שעברו טרנספקציה. בנוסף, ניתן להשתמש בנוירונים מתורבתים בהיפוקמפוס כדי לזהות נוגדנים חדשים ואת אנטיגני המטרה שלהם בשילוב עם מיצוי חיסוני וספקטרומטריית מסה, ולכן להרחיב את הספקטרום של נוגדנים הניתנים לזיהוי. לבסוף, הוא מאפשר להעריך את ההשפעות הפתוגניות של הנוגדנים העצמיים על ידי שיטות הדמיה חיות שיכולות לעקוב אחר שינויים בפעילות התאית. לסיכום, זיהוי נוגדנים עצמיים חדשים מאפשר בסופו של דבר ייזום של אימונותרפיות ספציפיות לשיפור תוצאות המטופלים.
למחברים אין ניגודי עניינים.
אנו מודים למרצ'ה ריבאס, מריה מרסל, גוסטבו קסטרו, ג'ורדי קורטס, אלינה הירשמן ואנחל סנדובל (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) ומרסדס אלבה, מריה רדוסביץ', דויד סוטו, חאווייר גאסול, מאר גואספ ולידיה סבאטר (IDIBAPS, בית החולים קליניק, אוניברסיטת ברצלונה) על התמיכה הטכנית שלהם ועל מתן ריאגנטים, וג'וזפ דלמאו ומירנה ר. רוזנפלד (IDIBAPS, Hospital Clínic, אוניברסיטת ברצלונה) על הסקירה הביקורתית שלהם על כתב היד וההדרכה. מחקר זה מומן על ידי מכון סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) ומומן במשותף על ידי האיחוד האירופי, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - תוכנית Severo Ochoa למרכזי מצוינות במו"פ (CEX2019-000910-S, P.L-A.); תוכנית CERCA ולייזרלאב-אירופה (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); ופונדו סושיאל יורופו (PRE2020-095721, M.C.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | - | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved