Cultures neuronales hippocampiques pour détecter et étudier de nouveaux anticorps pathogènes impliqués dans l’encéphalite auto-immune

Résumé

L’encéphalite auto-immune est une nouvelle catégorie de maladies du système nerveux central médiées par les anticorps. Les neurones de l’hippocampe peuvent être utilisés pour découvrir et caractériser ces anticorps. Cet article fournit un protocole pour la culture cellulaire primaire et l’immunomarquage afin de déterminer les autoanticorps dans le sérum et le liquide céphalorachidien des patients.

Résumé

Au cours des 15 dernières années, une nouvelle catégorie de maladies du système nerveux central (SNC) médiées par les anticorps a été caractérisée et est maintenant définie comme « encéphalite auto-immune » (EI). Il existe actuellement 17 syndromes d’EI connus, et tous sont associés à des anticorps contre la surface des cellules neuronales ou des protéines synaptiques. Les syndromes cliniques sont complexes et varient selon le type d’anticorps associé. La plus connue de ces maladies est l’encéphalite à anticorps anti-N-méthyl D-aspartate (NMDAR), qui est un trouble neuropsychiatrique important associé à de graves troubles de la mémoire et du comportement. Les anticorps associés réagissent avec la sous-unité GluN1 du NMDAR au niveau du domaine N-terminal. L’approche la plus fréquemment utilisée pour la découverte et la caractérisation des anticorps anti-EI comprend la culture de neurones dissociés, fœtaux et hippocampiques de rongeurs. Au cours du processus de caractérisation des anticorps, les neurones vivants en culture sont exposés au sérum ou au LCR des patients, et la détection de la réactivité indique que les échantillons de sérum ou de LCR du patient contiennent des anticorps contre les antigènes de surface neuronale. Les cultures hippocampiques peuvent également être utilisées pour déterminer si les anticorps chez les patients sont potentiellement pathogènes en examinant s’ils provoquent des altérations structurelles ou fonctionnelles des neurones. Le niveau de succès de ces études dépend de la qualité des cultures et des protocoles utilisés pour obtenir et détecter la réactivité des échantillons de patients. Cet article fournit un protocole optimisé pour la culture cellulaire primaire de neurones hippocampiques de rat fœtal combinée à l’immunomarquage pour déterminer la présence d’anticorps dans le sérum ou le LCR des patients. Un exemple de la façon d’examiner les effets pathogènes potentiels des anticorps NMDAR à l’aide de neurones en culture et de l’imagerie calcique est également présenté.

Introduction

L’encéphalite auto-immune (EI) est une catégorie récemment découverte de maladies du système nerveux central (SNC) médiées par des anticorps qui ciblent les protéines de surface neuronale ou synaptiques ^1,2. Les caractéristiques cliniques varient selon l’anticorps, mais comprennent généralement des troubles de la mémoire et de la cognition, une altération du comportement et des symptômes psychiatriques, des mouvements anormaux, un dysfonctionnement du sommeil, une diminution du niveau de conscience et des convulsions. Ces troubles peuvent toucher des personnes de tous âges, certains types d’EI touchant principalement les enfants et les jeunes adultes².

Au cours des 15 dernières années, 17 syndromes d’EI avec des anticorps dirigés contre des protéines neuronales spécifiques de surface/synaptiques ont été décrits (tableau 1). Quelques exemples de cibles neuronales comprennent les récepteurs excitateurs synaptiques NMDAR^3,4 et AMPAR⁵, le récepteur inhibiteur synaptique GABAbR^6, la protéine sécrétée par les neurones LGI1⁷ et la molécule d’adhésion cellulaire IgLON5⁸. Pour la plupart de ces EI, des études ont montré que les anticorps perturbent la structure ou la fonction de leur antigène cible, soutenant fortement un rôle pathogène. Par exemple, dans l’encéphalite anti-NMDAR, les anticorps réagissent avec le domaine N-terminal de la sous-unité GluN1 du NMDAR, produisant une internalisation sélective et réversible de ces récepteurs qui entraîne des altérations neuropsychiatriques importantes 4,9,10,11. Ainsi, l’identification de l’un des 17 anticorps connus dans le sérum ou le LCR d’un patient peut également être utilisée comme test de diagnostic qui établit le diagnostic d’un EI spécifique.

L’une des techniques les plus fréquemment utilisées pour l’identification et la caractérisation de ces anticorps comprend l’utilisation de cultures de neurones dissociés, fœtaux et rongeurs de l’hippocampe. Ces cultures sont utiles pour plusieurs raisons : le cerveau embryonnaire est facile à dissocier et contient un faible niveau de cellules gliales, principale source de contamination dans les cultures neuronales¹² ; la population cellulaire de l’hippocampe est relativement homogène par rapport à la plupart des autres régions du SNC, les cellules pyramidales représentant la grande majorité^13,14; les cultures sont préparées à partir d’embryons à un stade avancé lorsque la génération de neurones pyramidaux est terminée mais que les cellules granulaires ne se sont pas encore développées, ce qui ajoute encore à l’homogénéité de la culture; Lorsqu’ils sont cultivés, les neurones pyramidaux expriment la plupart de leurs principales caractéristiques phénotypiques, sont capables de former des dendrites bien développées et d’établir des réseaux synaptiques connectés qui peuvent être utilisés pour des recherches structurelles et électrophysiologiques^12,13; Comme les anticorps ne peuvent pas pénétrer dans les neurones vivants, l’utilisation de cultures vivantes permet d’identifier des cibles antigéniques qui résident à la surface de la cellule; et l’immunoprécipitation du complexe anticorps-antigène à partir de cultures neuronales permet d’identifier l’antigène cible⁵.

Le succès des études utilisant des cultures neuronales dépend fortement de la qualité des cultures et des protocoles utilisés pour évaluer l’immunoréactivité du sérum ou du liquide céphalorachidien (LCR) d’un patient. Les variables qui peuvent affecter les cultures comprennent les procédures d’isolement de l’hippocampe avant le développement de la culture, la dissociation du tissu, la densité de placage, la surface de croissance utilisée et la composition du milieu^13,15,16. Cet article fournit un protocole optimisé pour la culture cellulaire primaire de neurones hippocampiques de rat fœtal combinée à une immunomarquation fluorescente qui peut être utilisée pour déterminer la présence d’anticorps contre des antigènes AE connus et des cibles de surface potentiellement nouvelles. Il fournit également un exemple de la façon d’examiner les effets pathogènes des anticorps NMDAR par des techniques d’imagerie de cellules vivantes utilisant des neurones hippocampiques en culture exprimant un indicateur de calcium génétiquement codé (GECI) de la famille GCaMP, GCaMP5G.

Protéine cible	Fonction protéique	Compartiment cellulaire	Syndrome principal
NMDAR	Ion Chanel	Protéine synaptique	Encéphalite anti-NMDAR
AMPAR	Ion Chanel	Protéine synaptique	Encéphalite limbique
GluK2	Ion Chanel	Protéine synaptique	Encéphalite
GABAaR	Ion Chanel	Protéine synaptique	Encéphalite
GABAbR	Récepteur métabotropique	Protéine synaptique	Encéphalite limbique
mGluR1	Récepteur métabotropique	Protéine synaptique	Encéphalite
mGluR2	Récepteur métabotropique	Protéine synaptique	Encéphalite
mGluR5	Récepteur métabotropique	Protéine synaptique	Encéphalite
D2R	Récepteur métabotropique	Protéine synaptique	Encéphalite des ganglions de la base
LGI1	Molécule d’adhésion	Protéine de surface cellulaire	Encéphalite limbique
CASPR2	Molécule d’adhésion	Protéine de surface cellulaire	Encéphalite limbique
IgLON5	Molécule d’adhésion	Protéine de surface cellulaire	Maladie anti-IgLON5
Neurexine-3α	Molécule d’adhésion	Protéine de surface cellulaire	Encéphalite
DNER (Tr)	Protéine transmembranaire	Protéine de surface cellulaire	Encéphalite
SEZ6L	Protéine transmembranaire	Protéine de surface cellulaire	Encéphalite
Amphiphysine	Molécule structurelle	Protéine de surface cellulaire	Encéphalite limbique
DPPX	Peptidase	Protéine de surface cellulaire	Encéphalite

Tableau 1 : Anticorps dirigés contre la surface des cellules neuronales et les protéines synaptiques.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d’éthique local de l’Université de Barcelone conformément à la réglementation européenne (2010/63/UE) sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire. Le consentement éclairé écrit des patients a été obtenu et l’étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel local pour l’utilisation d’échantillons humains (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).

Remarque : Il y a trois parties dans le protocole actuel. Le premier est pour établir les cultures neuronales, le second est pour la détection d’anticorps de surface à l’aide de cultures vivantes de neurones, et le troisième est de déterminer la pathogénicité de ces anticorps.

PARTIE 1 : Mise en place de cultures neuronales dissociées, fœtales et rongeurs hippocampiques

1. Étapes préparatoires

1. Revêtement Poly-L-Lysine des surfaces de placage (3 jours avant la dissection)
   1. Préparer le tampon de borate en ajoutant 2,38 g d’acide borique et 1,27 g de borax à 500 mL d’eau distillée et en agitant pendant 15 minutes jusqu’à dissolution. Sous une hotte, stériliser la solution tampon en la filtrant (taille des pores de 0,2 μm), étiqueter et conserver à température ambiante (RT).
      REMARQUE: Cette solution est stable et peut être utilisée pendant 6 mois.
      ATTENTION : Lors de la préparation du tampon de borate, portez l’équipement de protection individuelle recommandé.
   2. Préparer la solution mère de Poly-L-Lysine (PLL) (100 mg/mL) en ajoutant 1 g de LPL à 10 mL d’eau distillée et en agitant jusqu’à dissolution. Préparer 500 μL aliquotes de solution mère de PLL. Pour atteindre une concentration finale de 1 mg/mL, ajouter 500 μL de LPL aliquote à 50 mL de tampon de borate et agiter jusqu’à dissolution et stériliser la solution par filtration (taille des pores de 0,2 μm).
      REMARQUE: Cette solution est stable et peut être utilisée pendant 6 mois.
   3. Préparez les surfaces pour le revêtement. Utilisez des lamelles de couverture de 12 mm de diamètre pour les procédures d’immunomarquage et des boîtes à fond de verre pour les études qui comprendront l’imagerie de neurones vivants. Si vous utilisez des lamelles de couverture, autoclaver puis placer cinq lamelles de couverture dans chaque plat (3,5 cm de diamètre).
      REMARQUE: L’épaisseur de la lamelle de couverture affecte la qualité et l’intensité du signal des images acquises. La plupart des objectifs de microscope sont conçus pour les lamelles de couverture #1.5. Choisissez les lamelles de couverture appropriées en fonction de la configuration et des techniques d’imagerie.
   4. Sous une hotte, ajouter 1,5 ml de solution de LPL à chaque plat (plat à fond de verre ou plat de 3,5 cm avec cinq lamelles de couverture). Assurez-vous que tous les feuillets de couverture sont immergés et stockés à RT pendant 24 h.
   5. 2 jours avant la dissection, aspirer la solution de LPL et laver à l’eau stérile exempte d’endotoxines, en s’assurant que les lamelles de couverture sont immergées. Gardez de l’eau dans la vaisselle et conservez à TA pendant 24 h.
   6. 1 jour avant la dissection, aspirer l’eau et la remplacer par des milieux de culture NB + B27 (voir ci-dessous), et placer les plats dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
2. Préparation des milieux de culture et de la solution mère (1 jour avant la dissection)
   1. Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) : À 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L) sans L-glutamine et rouge de phénol, ajouter 50 mL de sérum de cheval, 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 10 mL de L-glutamine (200 mM), 10 mL de pyruvate de sodium (100 mM), 10 mL de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL). Filtrer (taille des pores de 0,2 μm) et conserver dans des aliquotes de 5 mL à 4 oC avec un bouchon hermétiquement fermé.
      REMARQUE: Cette solution est stable et peut être utilisée pendant 1 mois.
   2. Milieu neurobasal (NB) supplémenté en B27 (NB + B27) : À 50 mL de milieu NB sans rouge de phénol, ajouter 1 mL de supplément B27.
   3. Milieu Hibernate-E supplémenté en B27 (Hibernate + B27): À 50 mL de milieu Hibernate-E, ajouter 1 mL de supplément B27.
   4. Solution physiologique extracellulaire (EPS) : À 1 L d’eau stérile, ajouter ce qui suit aux concentrations finales spécifiées : NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glucose (20 mM) et CaCl 2 (₂ mM). Remuer jusqu’à dissolution et ajuster le pH à 7,4 en ajoutant du NaOH (0,5 M) ou du HCl (0,5 M). Sous le capot, stériliser par filtration (taille des pores de 0,2 μm) et conserver à 4 oC.
3. Équipement et autres matériaux de laboratoire (jour de la dissection)
   1. Réglez un bain-marie à 37 °C. Chauffer les aliquotes suivantes : 50 mL de HBSS et 5 mL de DMEM.
   2. Stériliser les outils suivants en les immergeant dans un bécher contenant de l’éthanol absolu (figure 1B) : pinces, pinces courbes, ciseaux, pinces à courbure fine, pinces droites fines, ciseaux chirurgicaux, pinces à angle fin et ciseaux à ressort de précision.
      REMARQUE : Pour protéger les outils, placez un matériau souple (p. ex., des lingettes de précision scientifique) au fond du bécher.
   3. Remplissez deux plateaux de glace et placez les éléments suivants.
      1. Bac à glace 1 (Figure 1C) : Placer des outils chirurgicaux dans le bécher avec de l’éthanol absolu, un bécher avec HBSS pour rincer les outils chirurgicaux, un plat de 10 cm avec HBSS pour placer les embryons, un plat de 6 cm avec HBSS pour placer les têtes des embryons, et un plat de 6 cm avec Hibernate + B27 pour placer le cerveau des embryons.
      2. Bac à glace 2 : Placer une partie aliquote de 1 mL de trypsine à 2,5 % et un plat de 3,5 cm avec Hibernate + B27 pour l’hippocampe disséqué.
         NOTE: Le temps nécessaire à cette procédure dépend de l’expérience de l’investigateur et du nombre d’embryons à disséquer. Par conséquent, la glace doit rester gelée pendant le temps nécessaire. Les plateaux en polystyrène sont recommandés à cet effet.

2. Dissection et ensemencement (figure 1)

1. Isolement hippocampique
   REMARQUE: Les rates gravides avec des embryons à E18 sont euthanasiées immédiatement avant le début du protocole conformément au comité d’éthique local de l’Université de Barcelone, conformément à la réglementation européenne (2010/63 / UE) sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire. Dans ce protocole, l’inhalation de dioxyde de carbone (CO₂) a été utilisée comme méthode d’euthanasie.
   1. Disséquez le rat au niveau du péritoine abdominal à l’aide de pinces et de ciseaux. Extrayez l’utérus avec les embryons E18 et placez-le dans un plat de 10 cm qui a été refroidi sur de la glace.
      NOTE: Il est important d’éviter les poils de rat qui se fixent aux embryons. Il est recommandé d’utiliser de grandes quantités d’éthanol à 70% pour stériliser l’abdomen. À partir de cette étape, travaillez à l’intérieur de la hotte sur le bac à glace 1.
   2. Ouvrez les sacs embryonnaires et transférez les embryons dans la boîte de 10 cm avec HBSS, en vous assurant que les embryons sont complètement immergés.
   3. Retirez la tête de l’embryon avec des ciseaux et placez-la dans le plat de 6 cm avec HBSS. Répétez ce processus avec tous les embryons.
      REMARQUE: Pour éviter la contamination, tous les tissus, à l’exception des têtes d’embryons, doivent être jetés dans un récipient muni d’un bouchon à vis.
   4. Tenez la tête de l’embryon avec une pince finement incurvée et percez les orbites avec une paire de pinces droites fines, en entrant à un angle de 45°, puis relâchez les pinces finement incurvées.
      REMARQUE: Les forceps ne doivent pas traverser le cerveau, il est donc important de maintenir l’angle lors de l’entrée.
   5. Disséquez la peau et le crâne avec les ciseaux chirurgicaux, en commençant par l’os occipital jusqu’à l’os frontal. Retirez le cerveau avec une paire de pinces finement incurvées et placez-le dans le plat de 6 cm avec Hibernate + B27. Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les cerveaux soient récupérés.
   6. Séparez sagittiquement les télencéphales avec la pince droite fine.
      NOTE: A partir de cette étape, la dissection de l’hippocampe est réalisée sous un stéréomicroscope. Il est recommandé d’utiliser des lampes articulées pour que la lumière éclaire la surface de dissection par les côtés. Il est également recommandé d’utiliser un fond noir car cela offre plus de contraste, permettant de mieux distinguer l’hippocampe.
   7. Préparez un plat de 10 cm en plaçant des gouttes d’Hibernate + B27 à des distances de 1 cm (p. ex., en cercle). Placez un télencéphale par goutte d’Hibernate + B27 et visualisez à travers la lunette de dissection (un grossissement objectif de 1,25x est recommandé).
   8. Pelez soigneusement les méninges et retirez le thalamus pour mieux visualiser l’hippocampe.
   9. Disséquez l’hippocampe avec les ciseaux à ressort de précision et placez-le dans le plat de 3,5 cm avec Hibernate + B27 dans le bac à glace 2. Répéter pour chaque télencéphale jusqu’à ce que tous les hippocampes soient collectés.
   10. Prélever soigneusement tous les hippocampes à l’aide d’une pipette Pasteur et les transférer dans un tube de 50 mL.
       NOTE: Prenez le volume minimum d’Hibernate + B27 lors de la collecte de l’hippocampe afin de ne pas diluer la trypsine.
2. Dissociation cellulaire
   1. Dissociation enzymatique de l’hippocampe
      1. Dans le tube de 50 mL contenant l’hippocampe, ajouter 1 mL de trypsine à 2,5 % et porter à un volume de 5 mL avec HBSS. Incuber pendant 15 min au bain-marie à 37 °C.
      2. Pour diluer la trypsine, ajouter 10 mL de HBSS préchauffé et incuber pendant 5 min au bain-marie à 37 °C.
      3. Transférer l’hippocampe qui apparaît maintenant sous forme de masse de mucus dans un tube de 50 mL avec une micropipette de 1 000 μL, ajouter 6 mL de HBSS préchauffé et incuber pendant 5 min au bain-marie à 37 °C.
   2. Dissociation mécanique de l’hippocampe
      1. Transférer la masse dans un tube de 2 mL à fond conique, en prenant le volume minimal. Ajouter 1 mL de média DMEM préchauffé. Homogénéiser la pastille avec une micropipette de 1 000 μL en aspirant doucement de haut en bas.
         REMARQUE: Il est essentiel d’éviter de générer des bulles lors de l’aspiration car les bulles peuvent lyser les cellules.
      2. Répétez l’aspiration de haut en bas avec une pipette en verre pré-tirée (10x-20x), avec son embout en contact avec le fond conique du tube. Évitez de générer des bulles. A la fin de cette étape, le mélange doit être translucide.
      3. Une fois mélangé de manière homogène de manière à ce que le mélange soit translucide, transférer le mélange dans un tube contenant 4 ml de milieu DMEM à 37 °C et homogénéiser avec une pipette en verre en pipetant de haut en bas.
3. Ensemencement cellulaire
   1. Comptez les cellules. Le nombre de neurones dans la solution peut être compté selon les procédures de laboratoire standard.
      REMARQUE: Dans les expériences d’imagerie pour la détection des anticorps et l’activité calcique, une concentration de 50 000 cellules par boîte de 3,5 cm est optimale.
   2. En maintenant les cellules suspendues, prélever le volume calculé et plaquer dans des boîtes de 3,5 cm contenant des lamelles de couverture enduites de PLL ou dans des boîtes à fond de verre enduites de PLL.
   3. Répartir uniformément les cellules sur les plats en agitant doucement en mouvements croisés (d’avant en arrière, puis d’un côté à l’autre; répéter au besoin) et placer les plats dans l’incubateur de CO₂ (5%).
      NOTE: Il est important d’utiliser des mouvements croisés pour éviter que les cellules ne se déposent à la périphérie de la boîte.
   4. Chaque semaine, ajouter environ 1 mL de NB + B27, afin que la culture ne sèche pas.
      NOTE: Après 2 semaines (14 jours in vitro [div]), les neurones sont matures et expriment tous les facteurs à utiliser pour l’expérimentation. Le nombre moyen total de neurones obtenus à l’aide de ce protocole est d’environ 2,5 x 10⁶ neurones provenant d’une moyenne de 12 embryons E18 par rat gravide.

   
PARTIE 2: Utilisation de cultures neuronales hippocampiques pour la détection d’anticorps dans les protéines de surface des cellules neuronales

NOTE: Cette partie du protocole démontre comment les cultures hippocampiques sont utilisées pour identifier les anticorps anti-NMDAR dans le sérum et / ou le LCR des patients atteints d’encéphalite anti-NMDAR. L’immunomarquage fluorescent est utilisé pour visualiser la réactivité dans les neurones vivants, mais d’autres méthodes de visualisation pourraient également être utilisées. Un témoin approprié pour cette expérience serait le sérum ou le LCR d’un individu en bonne santé. Lorsque vous utilisez des échantillons humains, gardez à l’esprit que l’approbation du comité d’éthique de l’établissement peut être requise.

3. Immunomarquage fluorescent vivant

1. Utilisez 14 cellules div qui ont été cultivées sur des lamelles de couverture (50 000 cellules par boîte de 3,5 cm contenant cinq lamelles de couverture).
2. À l’intérieur de la hotte, rincer les lamelles de couverture avec NB préchauffé à 37 °C.
3. Ajouter l’échantillon qui, dans ce cas, contient des anticorps anti-NMDAR (utilisés comme anticorps primaires) dilués dans un milieu NB à 1:200 pour le sérum ou 1:2 pour le LCR et incuber 1 h à 37 °C (à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ (5%).
4. Rincer soigneusement avec PBS 3x à TA.
5. Ajouter la solution de fixation (4% de formaldéhyde dans PBS) et incuber à TA pendant 5 min.
   ATTENTION : Lorsque vous manipulez du formaldéhyde à 4 %, travaillez à l’intérieur de la hotte et portez l’équipement de protection individuelle recommandé.
6. Laver 3x avec PBS pendant 5 min chacun.
7. Ajouter l’anticorps secondaire Chèvre anti-humain AF488 à 1:1000 dilution et incuber à TA pendant 1 h.
   REMARQUE: Pendant l’incubation, protéger de l’exposition à la lumière en recouvrant de papier d’aluminium.
8. Laver 3x avec PBS pendant 5 min chacun. Rincer à l’eau distillée
9. Montez les lamelles de recouvrement avec un support de montage liquide (p. ex., support de montage anti-décoloration avec DAPI; environ 7 μL), aspirez tout liquide restant et rincez à l’eau distillée. Les neurones sont maintenant prêts pour l’imagerie par fluorescence.
   ATTENTION : Lorsque vous manipulez un support de montage, portez l’équipement de protection individuelle recommandé.

   

PARTIE 3 : Démonstration des effets pathogènes des anticorps par imagerie calcique

NOTE: Cette partie du protocole montre comment déterminer si les anticorps chez les patients ont un effet fonctionnel sur les cultures, ce qui suggérerait une pathogénicité. Afin d’augmenter l’importance des effets, un pool de LCR provenant de huit patients a été utilisé. L’activité calcique des cultures vivantes a été enregistrée lors de la stimulation chimique (NMDA + glycine) à l’aide de l’indicateur de calcium de fluorescence GECI (GCaMP5G). Ces études nécessitent un microscope à fluorescence inversée avec une chambre cellulaire capable de maintenir les conditions physiologiques requises des neurones.

4. Imagerie calcique

1. Utiliser 14 à 18 cellules div qui ont été cultivées sur des lamelles de couverture (50 000 cellules par boîte de 3,5 cm avec cinq lamelles de couverture)
2. 1 semaine avant l’imagerie, ajouter le vecteur viral pAAV2-CAG-GCaMP5G à 2,5 x 10¹⁰ GC/mL aux cellules et incuber pendant 5 à 7 jours.
   REMARQUE : Ce vecteur AAV préemballé du sérotype 2, disponible dans le commerce, surexprime l’indicateur de calcium génétiquement codé GCaMP5G sous un promoteur CAG.
3. 1 jour avant l’imagerie, ajouter l’échantillon du patient (dans cet exemple, un pool de LCR dilué 1:25 dans NB + B27) et incuber pendant 24 h. Toujours filtrer les échantillons humains (taille des pores de 0,2 μm) avant utilisation pour éviter toute contamination.
   REMARQUE : Pour ces études, le LCR témoin de sujets sains doit être effectué en parallèle.
4. Le jour de l’imagerie, préparez l’installation d’imagerie et réglez la chambre de la cellule du microscope à 37 °C, remplissez la voie avec de l’eau distillée et infusez avec 5% de CO₂ pour maintenir les conditions physiologiques cellulaires.
5. Dans la hotte, laver les cellules de l’étape 3 avec 3 mL de PSE préchauffé à 37 °C
6. Couvrir les cellules avec 2,45 mL d’EPS et les transférer dans la chambre cellulaire du microscope. Ajouter NBQX (10 μM) pour bloquer les récepteurs AMPA et KA afin de visualiser exclusivement la réponse du récepteur NMDA.
7. Dans le microscope à fluorescence inversée équipé d’une lampe au mercure et d’un cube filtrant FITC, acquérir un film de 2 min avec des images enregistrées toutes les 100 ms (activité spontanée).
   REMARQUE: Un objectif d’air NA 0.75 20x a été utilisé et des images (512 x 512 pixels, niveaux de gris 16 bits) ont été prises toutes les 100 ms avec une caméra sCMOS.
8. Acquérir le deuxième film de 4 min avec des images enregistrées toutes les 100 ms. Peu de temps après le début de l’acquisition, ajouter une solution de stimulation (NMDA [100 μM] + glycine [1 μM]) au plat.
   REMARQUE: L’ajout de média dans l’antenne générera des turbulences qui pourraient perturber les conditions d’imagerie (mise au point, intensité de fluorescence et / ou signal de fond non spécifique). N’ajoutez pas plus de 50 μL de solution dans la capsule remplie de 2,5 mL pour diminuer la probabilité de telles altérations.
9. À l’aide d’un logiciel de traitement d’images (ImageJ a été utilisé ici), extraire le signal de fluorescence au fil du temps, obtenu lors de la stimulation, à partir des cultures incubées avec le patient et contrôler des échantillons de LCR.
   REMARQUE: Les sondes GCaMP, lorsqu’elles se lient aux ions calcium libres, subissent un changement conformationnel qui les rend plus brillantes. Par conséquent, l’augmentation de l’intensité de fluorescence est en corrélation avec un afflux de calcium dû à la dépolarisation neuronale.
10. Déterminez les régions d’intérêt (ROI) à analyser. Segmentez manuellement les somas des neurones et ajoutez les ROI au gestionnaire de ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Enregistrez le retour sur investissement à partir du menu ROI Manager (Plus > Enregistrer).
11. Définissez les mesures (Analyser > Définir les mesures) et sélectionnez la valeur de gris moyenne. Extrayez le profil d’intensité de fluorescence moyenne des somas cellulaires en cliquant sur Plus > Multimesure, puis enregistrez le tableau généré sous forme de feuille de calcul .xls.
12. Effectuer des analyses statistiques pour comparer la fluorescence entre les groupes (LCR des patients vs LCR du contrôle).

Résultats

Mise en place de cultures neuronales dissociées, fœtales et hippocampiques de rongeurs
Le protocole présenté ici est basé sur les études influentes sur la culture de cellules nerveuses réalisées par Banker et Goslin¹⁵. Le protocole a été affiné pour obtenir des cultures neuronales avec une morphologie, une densité et une pureté optimales pour effectuer des études de détection d’anticorps de surface neuronaux. Le protocole de dissection et d’ensemencement est divisé en trois parties (figure 1A). La première partie, l’isolement hippocampique, consiste en l’extraction chirurgicale du tissu vivant (Figure 1A, panneau de gauche). Comme l’indique la figure, les rates Wistar gravides avec des embryons E18 sont le matériau de départ clé pour une culture réussie. Une fois le cerveau extrait des embryons E18, la microchirurgie est réalisée au stéréomicroscope. Avec des outils appropriés (Figure 1B) et une manipulation précise, il est possible de séparer l’hippocampe du reste du tissu nerveux. La disposition des tissus dans les milieux spécifiques est illustrée à la figure 1C. La deuxième partie du protocole consiste en la dissociation des cellules de l’hippocampe. Il est subdivisé en deux étapes (Figure 1A, panneau central) : la dissociation enzymatique et la dissociation mécanique de l’hippocampe, qui aboutissent à des cellules uniques, intactes et dissociées. En utilisant cette méthodologie, il est possible d’obtenir des cultures cellulaires sans agrégats cellulaires, comme représenté à la figure 2A-D. La troisième partie du protocole consiste en l’ensemencement cellulaire (Figure 1A, panneau de droite). Cette partie du protocole est cruciale afin d’ajuster la densité et l’homogénéité de la culture neuronale dans la plaque. Le comptage des cellules et l’ensemencement de 50 000 neurones dans une surface d’une boîte de 3,5 cm fournissent une densité optimale pour réaliser non seulement des expériences visant à déterminer la présence d’anticorps dirigés contre les protéines de surface des cellules neuronales (Figure 3) mais aussi à analyser la pathogénicité de ces anticorps avec imagerie calcique (Figure 4).

Figure 1 : Protocole visuel pour les cultures primaires de neurones de l’hippocampe. (A) Organigramme montrant les trois parties du protocole pour la préparation de cultures de cellules dissociées de neurones hippocampiques à partir de rats embryonnaires à E18. Le protocole est divisé en 1. Isolement hippocampique, 2. Dissociation cellulaire, et 3. Ensemencement cellulaire. (B) Sélection d’outils recommandés pour l’isolement hippocampique regroupés en trois catégories: (1- Pinces à courbes, 2- Pinces incurvées, 3- Ciseaux) pour la collecte d’embryons, (4- Pinces à courbure fine, 5- Pinces droites fines, 6- Ciseaux chirurgicaux) pour l’extraction du cerveau, et (7- Pinces à angle fin, 8- Ciseaux à ressort de précision) pour l’isolement de l’hippocampe. (C) Représentation schématique du bac à glace 1 avec les plaques et les supports nécessaires à l’isolement de l’hippocampe. Les embryons et les têtes sont placés dans HBSS, tandis que les cerveaux sont placés dans le milieu hiberné + B27. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les cultures de neurones hippocampiques à 18 div sont matures, interconnectées et expriment des protéines structurelles et fonctionnelles
Dans la croissance et la maturation des cultures neuronales, deux phases différenciées peuvent être appréciées : la phase de polarisation du neurone (Figure 2A,B) et la phase de développement dendritique et de construction du réseau synaptique (Figure 2C,D). Les cellules sur 1 div sont réparties uniformément et ont adhéré à la plaque, développant une lamelle autour du corps cellulaire avec des neurites mineurs commençant à s’étendre (Figure 2A). Après quelques jours en culture, les neurites s’étendent sur une courte distance. Les cellules présentent une polarisation significative, mais il y a peu de croissance nette (Figure 2B). Après cette étape, la synaptogenèse est importante et les neurones commencent à s’interconnecter. Le réseau neuronal ne cesse de croître et devient plus complexe (Figure 2C). À 18 div, les neurones sont matures et interconnectés; le réseau neuronal est construit (Figure 2D). Une fois que les épines synaptiques sont formées et connectées, les neurones sont entièrement polarisés et expriment toutes les protéines fonctionnelles et structurelles. Parmi les nombreuses protéines exprimées par les neurones matures en culture, le récepteur neuronal NMDA (Figure 2E) et la protéine synaptique PSD95 (Figure 2F) ont été choisis ici comme marqueurs représentatifs. De plus, il est possible de visualiser sélectivement les axones en marquant les neurofilaments (NF) (Figure 2G) et de visualiser les dendrites en ciblant la protéine MAP2 (Figure 2H).
Figure 2 : Évolution temporelle de la maturation des cultures cellulaires dissociées de neurones hippocampiques. (A-D) Images à contraste de phase des neurones de l’hippocampe au cours des 18 premiers jours de culture. (A) Neurones à 1 div lors de leur fixation au substrat recouvert de PLL. (B) L’émergence de petits neurones dans les neurones à 5 div. (C) Les neurones à 11 div ont développé de longs neurites qui s’allongent et acquièrent des caractéristiques axonales. (D) Les neurones à 18 div sont matures et ont formé un réseau neuronal. Barre d’échelle (A-D) = 40 μm. (E-H) Images fluorescentes représentatives prises par microscopie confocale à balayage laser à l’aide de marqueurs sélectifs pour montrer les neurones matures à 18 div. Les cultures neuronales ont été fixées et immunocolorées avec des anticorps qui colorent sélectivement (E) le récepteur neuronal (NMDAR), (F) le marqueur synaptique (PSD95), (G) le marqueur axonal (neurofilament, NF) et (H) le marqueur dendritique (MAP2). Barre d’échelle (E-H) = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les anticorps dans les échantillons de patients réagissent avec les antigènes de surface des cellules neuronales
Les échantillons (sérum et LCR) obtenus de patients atteints d’encéphalite anti-NMDAR contiennent des autoanticorps qui reconnaissent le NMDAR présent à la surface des neurones. L’incubation des cultures avec les échantillons du patient produit un signal de fluorescence intense à la surface des cellules et des dendrites (Figure 3A,C). En revanche, les échantillons témoins ne produisent aucun signal de fluorescence lorsqu’ils sont administrés aux cultures neuronales (Figure 3B,D). Ces résultats montrent comment les cultures peuvent être utilisées pour dépister les échantillons de patients pour les anticorps et peuvent conduire à l’identification de nouveaux anticorps qui ciblent la surface des cellules neuronales. 

L’échantillon de LCR du patient diminue la concentration intracellulaire de calcium dans les cultures de neurones hippocampiques induites par le NMDA
Pour évaluer l’effet des anticorps des patients sur l’activité neuronale (après 24 heures de traitement), les transitoires calciques intracellulaires ont été surveillés optiquement à partir des neurones en culture en temps réel lors d’une stimulation médiée par NMDA. L’application de NMDA génère une augmentation de l’intensité de fluorescence, comme indiqué par un changement dans la fluorescence verte intracellulaire (Figure 4A et Vidéo supplémentaire 1). Les neurones traités avec l’échantillon témoin de LCR ont montré une différence plus élevée dans l’intensité de fluorescence (56%) lorsque le stimulateur a été appliqué par rapport aux cellules traitées avec l’échantillon de LCR du patient. Les différences d’intensité de fluorescence ont été mesurées et les courbes de stimulation médiées par NMDA à partir des données extraites du soma des cellules ont été comparées (Figure 4B,C). Les courbes de stimulation montrent qu’il y a eu un afflux intracellulaire de calcium dans les deux scénarios, mais les cultures traitées avec le LCR des patients (ligne grise) ont montré une réponse inférieure à celle des cultures traitées témoins (ligne noire). Ces résultats démontrent que les anticorps présents dans le LCR des patients diminuent l’activité cellulaire en raison de l’interaction des anticorps avec le NMDAR, et provoquent ainsi un effet pathogène.

Figure 3 : Les anticorps des patients réagissent avec la surface des cultures neuronales. (A,E) Le sérum et le LCR des patients atteints d’encéphalite anti-NMDAR réagissent avec la surface cellulaire des neurones vivants de l’hippocampe du rat (B, F), tandis que le sérum et le LCR des sujets témoins ne montrent aucune réactivité. Barre d’échelle (A,B,E,F) = 20 μm. Image à plus fort grossissement d’une dendrite (63x) montrant le schéma de surface typique de réactivité pour (C, G) le sérum du patient et le LCR et (D,H) négatif pour les témoins. Les images ont été prises par microscopie confocale à balayage laser. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les anticorps des patients réduisent l’afflux de calcium dans les neurones de rat exprimant GCaMP5G. (A) L’administration d’une solution de stimulation (NMDA [100 μM] + glycine [1 μM]) dans des cultures de neurones a déclenché un afflux de calcium, comme indiqué par l’augmentation de la fluorescence verte intracellulaire (pic de stimulation), par rapport à l’image prise avant la stimulation (pré-stimulation). Après 120 s, l’intensité de fluorescence diminue et se stabilise (post-stimulation). Les cultures traitées avec le LCR des patients ont montré une réduction significative (56%) de l’augmentation du calcium médiée par le NMDA par rapport au LCR du contrôle. Les images ont été prises par microscopie à fluorescence. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Un graphique de l’une des trois expériences indépendantes représentant l’intensité de fluorescence dans le temps (180 s) pour les cultures traitées avec le LCR du contrôle (ligne noire) et le LCR des patients (ligne grise) lors de la stimulation NMDA (flèche bleue). n(LCR des témoins) = 20 cellules; n(LCR des patients) = 28 cellules. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. (C) Les diagrammes encadrés montrent les percentiles médian, 25e et 75e. Les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales. L’évaluation de la signification a été réalisée par analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA; p < 0,0001) et les tests U de Mann-Whitney (p < 0,0001). Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo montrant deux neurones de l’hippocampe exprimant GCaMP5G côte à côte : neurone traité avec le LCR du contrôle (à gauche) vs neurone traité avec le LCR des patients (à droite). L’application de NMDAR (stimulation) génère une augmentation de l’intensité de la fluorescence intracellulaire dans les deux cas, mais avec un niveau significativement plus élevé dans le neurone traité avec le LCR du témoin par rapport à celui traité avec le LCR des patients. Les images ont été prises par microscopie à fluorescence et éditées avec ImageJ appliquant la table de correspondance (LUT) Fire. 1700 cadres (170 s); accéléré 5 fois. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le domaine croissant de l’auto-immunité médiée par les anticorps a ouvert une fenêtre d’opportunité pour l’identification d’autoanticorps neuronaux qui peuvent être utilisés pour améliorer le diagnostic et le traitement des patients. Les cultures de neurones hippocampiques sont un outil essentiel pour l’identification des anticorps; Par conséquent, il est important d’effectuer un protocole standardisé pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les étapes les plus importantes à prendre en compte, les limitations et le dépannage sont abordés ici.

Les étapes critiques de ce protocole peuvent être regroupées en trois catégories selon qu’elles affectent la pureté, l’homogénéité ou la viabilité des neurones de l’hippocampe.

Pureté - Pour obtenir des cultures cellulaires primaires optimales, l’investigateur doit être confiant, formé et capable de travailler rapidement, en particulier pour minimiser le temps de la dissection. Même si les neurones pyramidaux sont le type cellulaire principal, l’hippocampe contient une variété d’interneurones¹⁴. Pour générer des cultures avec un minimum de cellules gliales, l’hippocampe doit être extrait avec le minimum de tissu environnant. L’utilisation d’un fond noir lors de la dissection permet d’identifier les limites de l’hippocampe sous le stéréomicroscope. En outre, il convient de tenir compte du fait que des densités cellulaires plus faibles entraînent moins de soutien paracrine et rendent plus difficile le maintien de la culture¹³. Il est donc important de garder cet équilibre à l’esprit. Ceci est important dans les études d’imagerie qui utilisent un faible nombre de cellules (50 000 neurones par boîte de 3,5 cm). Pour pouvoir avoir plus de temps pour l’extraction de l’hippocampe, des milieux d’hibernation qui préservent le tissu doivent être utilisés¹⁷. Travailler avec des outils chirurgicaux adéquats est également essentiel. Les outils de haute précision sont délicats, de sorte que la reproductibilité de la technique doit être assurée en les protégeant soigneusement.

Homogénéité - Pour développer une culture sans agrégats cellulaires, la dissociation mécanique des cellules a été améliorée en combinant l’utilisation d’une pipette en verre pré-tirée avec une pipette standard de 1 000 μL.

Viabilité - Dans ce protocole, aucun antibiotique n’a été ajouté car ils influencent l’excitabilité neuronale et modifient les propriétés électrophysiologiques des neurones cultivés¹⁸. Par conséquent, la contamination est très probable si les normes de stérilité les plus élevées ne sont pas maintenues. La température est également un facteur clé. Garder les tissus froids pendant l’isolement de l’hippocampe ralentit le métabolisme et diminue la dégradation cellulaire. Le tissu a donc été maintenu sur la glace jusqu’au processus de dissociation cellulaire. De plus, il est crucial de trouver le bon équilibre lors de la dissociation cellulaire enzymatique qui désagrège les cellules sans lyse cellulaire marquée. Dans ce protocole, les moments d’incubation avec la trypsine et les étapes de lavage ultérieures ont été optimisés pour obtenir des cellules individuelles avec suffisamment d’espace pour permettre la création d’un réseau neuronal approprié.

Des étapes critiques sont également trouvées dans les enregistrements fluorescents d’immunomarquage vivant et d’activité calcique des cultures neuronales. Pour effectuer une immunocoloration vivante réussie pour déterminer la présence d’anticorps dirigés contre les protéines de surface cellulaire dans les échantillons de patients, il faut éviter la perméabilisation des cellules qui permettrait aux anticorps d’accéder aux protéines intracellulaires. De plus, en fonction du titre des anticorps, le temps d’incubation et la dilution de l’échantillon doivent être ajustés en conséquence (p. ex., des anticorps à titre très élevé peuvent donner une coloration de fond qui rend l’interprétation des résultats difficile). Lors de l’évaluation de la pathogénicité des autoanticorps avec imagerie calcique, il faut utiliser un milieu optimal pour les mesures de l’activité cellulaire (par exemple, la suppression de Mg²⁺ dans le milieu de culture est importante pour une bonne performance). De plus, pour l’imagerie par fluorescence, les milieux avec des indicateurs de pH tels que le rouge de phénol doivent être évités car ils introduisent un signal de fond non spécifique.

Il existe deux limites principales à l’utilisation des cultures neuronales hippocampiques. Premièrement, par rapport aux lignées cellulaires stables, les cultures primaires doivent être générées en continu, ce qui implique l’utilisation régulière d’animaux de laboratoire. Les lignées de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) pourraient remplacer la nécessité d’utiliser des modèles animaux, mais les protocoles de différenciation des CSPi ne sont toujours pas optimaux. Deuxièmement, les neurones dérivés de l’iPSC n’expriment pas tout le spectre des protéines de surface et, par conséquent, si elles sont utilisées, l’absence de réactivité n’implique pas nécessairement la négativité de l’échantillon¹⁹.

Il existe trois méthodes pour dépister la présence d’autoanticorps dans le sérum ou le LCR des patients suspectés d’avoir des EI : le test tissulaire (TBA) utilisant du tissu cérébral de rat, le test cellulaire (CBA) utilisant des cellules HEK transfectées pour exprimer des protéines neuronales, et l’application rapportée ici utilisant des cultures vivantes de neurones hippocampiques¹⁹. L’importance de la méthode des neurones hippocampiques en culture réside dans sa capacité à différencier la réactivité avec des antigènes de surface et intracellulaires qui ne peuvent pas être facilement distingués par TBA. En outre, les cultures neuronales primaires, contrairement à l’ACB dans les cellules transfectées HEK, ne sont pas limitées par le répertoire des protéines transfectées. De plus, les neurones hippocampiques en culture peuvent être utilisés pour identifier de nouveaux anticorps et leurs antigènes cibles lorsqu’ils sont combinés à l’immunoprécipitation et à la spectrométrie de masse et, par conséquent, élargir le spectre des anticorps identifiables. Enfin, il permet d’évaluer les effets pathogènes des autoanticorps par des méthodes d’imagerie en direct qui peuvent surveiller les altérations de l’activité cellulaire. En conclusion, l’identification de nouveaux autoanticorps permet à terme l’initiation d’immunothérapies spécifiques pour améliorer les résultats pour les patients.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-020
12 mm round coverslips	Fisher	NC9708845
20x NA 0.75 S Fluor air objective	Nikon	CFI Super Fluor 20X
3.5 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-90
6 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-94
B27 supplement	Gibco	17504-044
Beaker 100 mL	Pirex	-
Borax	Sigma-Aldrich	B9876
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B0252
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
Curved forceps	FST	11009-13
D-Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red	Capricorn	DMEM-HXRXA
Female Wistar rat (18-days pregnant)	Janvier	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S181B-500
Fine-angled forceps	FST	11251-35
Fine-curved forceps	FST	11272-30
Fine-straight forceps	FST	11251-23
FITC filter cube	Nikon	Standard Series
Forceps	FST	11000-12
Goat anti-Human AF488	Invitrogen	A11013
HBSS	Capricorn	HBSS-1A
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hibernate-E medium	Gibco	A12476-01
Horse Serum (HS)	Thermofisher	26050088
Human anti-NMDAR antibody (CSF)	Patient Sample	-
Human anti-NMDAR antibody (Serum)	Patient Sample	-
ImageJ/Fiji	NIH	v1.50i
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
KCl	Sigma-Aldrich	44675
L-Glutamine	Biowest	X0550-100
Mercury lamp	Nikon	C-HGFI
Microscope cell chamber	Custom-build	-
NaCl	Sigma-Aldrich	S9887
NBQX	Tocris	373
Neurobasal without phenol red	Gibco	12348-017
NMDA	Sigma-Aldrich	M3262
pAAV2-CAG-GCaMP5G	VectorBiolabs	-
Paraformaldehyde 4%	Thermo scientific	J199943-K2
Penicillin-Streptomycin	Biowest	L0022-100
Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023
Poly-L-Lysine (PLL)	Peptide international	OKK-35056
Polystyrene ice tray	-	-	re-used cap of a polysterene box
Precision spring-scissors	FST	15000-08
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media)	Molecular Probes	P36941
Scissors	FST	14068-12
Sodium pyruvate	Biowest	L0642-100
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Surgery scissors	FST	14081-09
Trypsin 2.5%	Gibco	15090046
Water, sterile endotoxine free	Sigma-Aldrich	W3500