חבילה של כלים אנליטיים מבוססים כדי לחקור את השינוי במצב מוצק של חומרים פעילים מבוססי ליפידים

Summary

פרסום זה מציג את היישום של עקיפת קרני רנטגן וקלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית כתקני זהב לחקר המצב המוצק של חומרים פעילים מבוססי שומנים (LBEs). הבנת השינוי במצב מוצק ב-LBEs והשפעתו על הביצועים של מוצרים פרמצבטיים הם גורם המפתח לייצור צורות מינון חזקות המבוססות על שומנים.

Abstract

חומרים פעילים מבוססי שומנים (LBEs) הם רעילים נמוכים, תואמים ביולוגית ומבוססים על טבעי, ויישומן תומך בקיימות של ייצור תרופות. עם זאת, האתגר העיקרי הוא מצבם המוצק הלא יציב, המשפיע על יציבות המוצר התרופתי. תכונות פיזיקליות קריטיות של שומנים לעיבודם - כגון טמפרטורת התכה וצמיגות, ריאולוגיה וכו ' - קשורות למבנה המולקולרי שלהם ולגבישיותם. תוספים, כמו גם מתח תרמי ומכני המעורב בתהליך הייצור, משפיעים על מצב מוצק של שומנים ובכך על הביצועים של מוצרים פרמצבטיים שלהם. לכן, הבנת השינוי במצב המוצק היא קריטית. בעבודה זו, השילוב של עקיפת קרני רנטגן אבקה וקלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית (DSC) מוצג כתקן הזהב לאפיון המצב המוצק של השומנים. עקיפת קרני רנטגן היא השיטה היעילה ביותר לסינון פולימורפיזם וצמיחת גבישים. הסידור הפולימורפי ואורך הלמלה מאופיינים באזורים הרחבים והקטנים-זוויתיים של עקיפת קרני רנטגן, בהתאמה. ניתן להשתמש באזור פיזור קרני הרנטגן בזווית קטנה (SAXS) כדי לחקור את צמיחת הגבישים. ניתן להצביע על מעבר פאזה והפרדה. DSC משמש לסינון ההתנהגות התרמית של שומנים, להערכת הטעות של תוספים ו/או חומרים פרמצבטיים פעילים (API) במטריצת השומנים, ולספק דיאגרמות פאזה. מוצגים ארבעה מקרי בוחן שבהם LBEs משמשים כחומר ציפוי או כמטריצת אנקפסולציה כדי לספק מערכות מולטי-חלקיקים מצופות שומנים וננו-חלקיקים של שומנים, בהתאמה. מצב מוצק השומנים והשינוי הפוטנציאלי שלו במהלך האחסון נחקרים ומתואמים לשינוי במהדורת ה- API. שיטות מיקרוסקופיות איכותיות כגון מיקרוסקופיית אור מקוטבת ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת הן כלים משלימים לחקר התגבשות ברמת המיקרו. יש להוסיף שיטות אנליטיות נוספות המבוססות על תהליך הייצור שנבחר. יש להבין היטב את יחסי המבנה-פונקציה-יכולת העיבוד כדי לתכנן מוצרים פרמצבטיים חזקים ויציבים מבוססי שומנים.

Introduction

ליפידים הם סוג של חומרים המכילים פחמימנים אליפטיים ארוכי שרשרת ונגזרותיהם. הם מכסים מגוון רחב של מבנים כימיים, כולל חומצות שומן, אצילגליצרולים, סטרולים ואסטרים של סטרול, שעווה, פוספוליפידים וספינגוליפידים¹. השימוש בליפידים כחומרים פעילים פרמצבטיים החל בשנת 1960 להטמעת תרופות במטריצת שעווה כדי לספק פורמולציות בשחרור מושהה². מאז, חומרים פעילים מבוססי שומנים (LBEs) זכו לתשומת לב רבה עבור יישומים מגוונים, כגון שחרור תרופות מותאמות, מיסוך טעם, אנקפסולציה של תרופות וזמינות ביולוגית משופרת של תרופות. ניתן ליישם LBEs במגוון רחב של צורות מינון פרמצבטיות באמצעות תהליכי ייצור רב-תכליתיים, כלומר, ציפוי נמס חם, ייבוש בהתזה, שחול שומנים מוצקים, הדפסה תלת-ממדית, טאבלטים והומוגניות בלחץ גבוה, בין היתר. צורות מינון כגון טבליות, יריעות מתפרקות דרך הפה, מערכות מולטי-חלקיקי, ננו-חלקיקים, כדורים וצורות מודפסות בתלת-ממד הן התוצאה ^2,3,4.

LBEs הם בעלי מעמד "כללי מוכר כבטוח", רעילות נמוכה, תאימות ביולוגית טובה וסובלנות משופרת של המטופלים. מקורם הטבעי וזמינותם הרחבה מאפשרים להם להעצים ייצור תרופות ירוק ובר קיימא. עם זאת, השימוש ב- LBEs נקשר לצורות מינון לא יציבות. שינויים בתכונות של מוצרים מבוססי שומנים לאחר אחסון דווחו באופן נרחב. המצב המוצק של LBEs וקיומו של פולימורפיזם שומנים נחשבים לסיבות העיקריות לחוסר היציבות של צורות מינון מבוססות שומנים 5,6,7,8.

התכונות המכניות והפיזיקליות של השומנים קשורות קשר הדוק לתכונות ההתגבשות שלהם ולמבנה רשת הגבישים שלהם, המציגה היררכיות מובחנות של ארגון מבני. כאשר שומנים משמשים בייצור מוצרים פרמצבטיים, המבנה הגבישי מושפע מפרמטרים של תהליך המיושם, כגון טמפרטורה, ממיסים אורגניים, גזירה וכוחות מכניים, אשר בתורם משפיעים על הביצועים של המוצר התרופתי 5,7,9,10,11,12 . כדי להבין את הקשר הזה בין מבנה לתפקוד, חשוב לדעת את המימון של התגבשות שומנים ומבנה גבישי ושיטות אנליטיות לסנן אותם.

ברמה המולקולרית, היחידה הקטנה ביותר של גביש שומנים נקראת "תא יחידה". חזרה תלת-ממדית קבועה על תאי יחידה בונה את הסריגים הגבישיים, עם אינטראקציות מולקולריות חזקות יותר לצד הכיוונים הלטרליים שלהם מאשר אלה האורכיים, ומסבירה את הבנייה הרב-שכבתית של גבישי שומנים. האריזה החוזרת ונשנית של שרשראות פחמימנים נקראת תת-תא 1,12,13 (איור 1). Lamellae הם אריזה צידית של מולקולות שומנים. בחבילת הגבישים, הממשקים בין lamellae שונים עשויים מקבוצות קצה מתיל, בעוד שקבוצות הגליצרול הקוטבי ממוקמות בחלקים הפנימיים של lamella¹⁴. כדי להבדיל בין כל שרשרת של חומצות שומן בלמלה, נעשה שימוש במונח עלון, המייצג תת-שכבה המורכבת משרשראות בודדות של חומצות שומן. ניתן לסדר אצילגליצרולים באורך שרשרת עלונים כפול (2L) או משולש (3L)¹⁴. אנרגיית פני השטח של הלמלה מניעה אותם להיערם זה לזה באופן אפיטקסי, כדי לספק ננו-גבישיות. גורמי עיבוד שונים כגון טמפרטורת הקירור וקצב הקירור משפיעים על מספר הלמלות הערומות ובכך על עובי הגבישיות (~10-100 ננומטר). צבירה של גבישים מובילה להיווצרות של כדורוליטים בקנה מידה זעיר, וצבירה של כדורוליטים מספקת לרשת הגבישים של LBEs התנהגות מקרוסקופית מוגדרת¹³.

מעברי מצב מוצק מתחילים ברמה המולקולרית. המעבר הגיאומטרי מתת-תא אחד למשנהו נקרא פולימורפיזם. שלושה פולימורפים עיקריים של צורות α, β'-, ו-β נמצאים בדרך כלל באצילגליקרולים, מסודרים על פי יציבות מוגברת. הטיה של הלמלה ביחס לחבורות קצה מתרחשת במהלך מעברים פולימורפיים ^1,13. מעברים פולימורפיים בתיווך אחסון ונמסים נחווים על ידי LBEs. מעברי אחסון מתרחשים כאשר הצורה המטא-יציבה מאוחסנת מתחת לטמפרטורת ההיתוך שלה, ואילו מעברים בתיווך נמס מתרחשים כאשר הטמפרטורה עולה מעל נקודת ההיתוך של צורה מטא-יציבה המעוררת התכה והתגבשות רצופה של הצורה היציבה יותר.

יתר על כן, הפרדת פאזות וצמיחת גבישים יכולה להתרחש גם כן. הפרדת פאזות מונעת על ידי התגבשות רב-פאזית ראשונית וצמיחה של שלב אחד או יותר. אינטראקציות בין חלקיקים לחלקיקים, כולל סינטר, אינטראקציות מולקולריות, תכונות מיקרו-מבניות ורכיבים זרים, יכולות גם הן לגרום לצמיחת גביש ^1,5.

לניטור מעברי המצב המוצק של LBEs והשפעתם על הביצועים של צורות מינון יש חשיבות משמעותית. בין היתר, קלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית (DSC) ודיפרקציה של קרני רנטגן, במיוחד פיזור קרני רנטגן קטן ורחב זווית בו זמנית (SWAXS), הם שני תקני זהב להערכת מצב מוצק שומנים.

DSC משמש בדרך כלל למדידת השינויים האנתלפיים של החומר המעניין הקשור לזרימת החום כפונקציה של זמן וטמפרטורה. השיטה נמצאת בשימוש נרחב לסינון התנהגות תרמית של שומנים, כגון מסלולים אפשריים של התכה והתגבשות, טמפרטורה מתאימה ואנתלפיה של צורות פולימורפיות שונות, כמו גם שברים קלים ועיקריים של הרכבי שומנים. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי לתאר את ההטרוגניות, שלבים מרובים ופולימורפיזם שומנים ^5,7,13.

טכניקות עקיפה של קרני רנטגן הן השיטות החזקות ביותר לקביעת מבנה במצב מוצק. בעל ננו-מבנה מסודר עם למלה חוזרת ונשנית, ניתן לחקור את השתקפות קרן הרנטגן מגבישי שומנים באמצעות חוק בראג:

d = λ/2sinθ (משוואה 1)

כאשר λ הוא אורך גל קרני הרנטגן של 1.542 Å, θ הוא זווית הדיפרקציה של הקרן המפוזרת, ו-d הוא הריווח הבין-מישורי של שכבות חוזרות, המוגדר כאורך למלה בליפידים. האזור בעל הזווית הקטנה של הרנטגן יכול לשמש באופן מושלם כדי לזהות את תבנית הריווח הארוך ולחשב את אורך הלמלה (d). ככל שהמרחק החוזר d גדול יותר, כך זווית הפיזור קטנה יותר (1-15°, אזור בעל זווית קטנה) מכיוון ש-d הוא ביחס הפוך לחטא θ. ניתן לאפיין את סידור תת-התא של השומנים כתבנית הריווח הקצר באזור רחב הזווית של עקיפת קרני הרנטגן. ניתן להשתמש הן בתבניות הריווח הארוכות והן בתבניות הריווח הקצרות של השומנים (אורך למלה וסידור תת-התא) כדי לציין את הטרנספורמציה הפולימורפית המונוטרופית. לדוגמה, ניתן לשנות את צורת α (משושה) לצורת β (טריקליניקה) עקב שינוי בזווית ההטיה של השרשראות, עם שינויים באורך הלמלה (תבנית ריווח ארוך, באזור הזווית הקטנה, 1-15°) ובמצב אריזת החתך (תבנית ריווח קצר, באזור הזווית הרחבה, 16-25°) (איור 2).

המידע המתקבל מאזור SAXS יכול לשמש גם כדי לחקור את גדילת הגביש על ידי מדידת עוביו (D) באמצעות משוואת שרר¹⁵:

D = Kλ/FWHMcosθ (משוואה 2)

כאשר, FWHM הוא הרוחב ברדיאנים של מקסימום עקיפה הנמדד בגובה של חצי כיוון בין הרקע לשיא, הידוע בדרך כלל כרוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM); θ היא זווית עקיפה; λ הוא אורך הגל של קרני הרנטגן (1.542 Å) ו- K (קבוע שרר) הוא מספר חסר ממדים המספק מידע על צורת הגביש (במקרה של היעדר מידע צורה מפורט K = 0.9 הוא קירוב טוב). שים לב שניתן להשתמש במשוואת שרר כדי להעריך גדלים גבישיים ממוצעים של עד כ-100 ננומטר מכיוון שהרחבת השיא היא ביחס הפוך לגודל הגבישי. לכן, היישום שלה שימושי לקביעת עובי של ננו-טסיות, ובעקיפין, את מספר lamellae מצטבר. דוגמאות לשימוש בגישה ידועה זו לסינון התכונות הגבישיות של שומנים בפיתוח פורמולציה פרמצבטית וחוסר היציבות המקביל בביצועי המוצר ניתן למצוא ב^- 5,12,16,17,18.

ניטור המצב המוצק של LBEs בכל שלב התפתחותי באמצעות טכניקות אנליטיות מבוססות היטב מספק אסטרטגיה יעילה לתכנון תהליכי ייצור בעלי ביצועים גבוהים ומוצרים פרמצבטיים יציבים מבוססי שומנים.

פרסום זה מציג את היישום הקריטי של ניתוח מקיף של מצב מוצק של LBEs לניטור השינויים במצב מוצק והמתאם שלו לשינוי בפרופיל השחרור של חומר תרופתי פעיל (API) מצורת המינון הפרמצבטי. מערכות מולטי-חלקיקים המבוססות על גבישי API מצופים שומנים באמצעות ציפוי נמס חם, ותרחיפים ננו-ליפידים המיוצרים באמצעות הומוגניזציה בלחץ גבוה נלקחים כמקרי בוחן. המוקד של פרסום זה הוא היישום של עקיפת רנטגן אבקה ו- DSC ככלים אנליטיים. שתי הדוגמאות הראשונות מראות את ההשפעה של טרנספורמציה פולימורפית וצמיחת גבישים, בהתאמה, על השינוי בשחרור API מדגימות מצופות. הדוגמה האחרונה חושפת את המתאם בין המצב המוצק היציב של השומנים לבין הביצועים היציבים של המוצר התרופתי במערכות מולטי-חלקיקים מצופות ליפידים ובמתלי ננו-ליפידים.

Protocol

1. קלורימטריה לסריקה דיפרנציאלית (DSC)

1. הכנת כלי נגינה
   1. השתמש בקלורימטר סריקה דיפרנציאלי המצויד באינטרקולר, דוגם אוטומטי ובתוכנה לבקרת מכשירים וניתוח נתונים.
   2. הפעל את אספקת גז החנקן והגדר את הלחץ בין 0.2-0.5 בר והפעל את מכשיר ה- DSC ואת מחליף הדגימה האוטומטי.
   3. פתח את התוכנה והפעל את מצב ההמתנה על ידי לחיצה על כפתור כן . אפשר שיווי משקל של המכשיר למשך שעה אחת לפחות
   4. נקה את הכבשן עם חנקן, לחץ על הסמל שיטה חדשה ועבור אל הגדרת שיטה. הפעל את האפשרות אפנון טמפרטורה בחלון הסקירה.  עבור אל הכרטיסייה כותרת ובחר את השיטה על ידי לחיצה על "מדגם".
   5. עבור אל הכרטיסייה תוכנית טמפרטורה, בחר טיהור 2 MFC ועל מגן MFC, שניהם ב 50 מ"ל / דקה.
   6. הוסף את שיטת המדידה הבאה: המתנה ב- 20 ° C, מחזור חימום ב- 5 K / min מ- 20 ° C עד מעל טמפרטורת ההמסה של השומנים, החזקה איזותרמית בטמפרטורה זו למשך 5 דקות, מחזור קירור ל- 0 ° C ב- 5 K / min עד - 20 ° C, טמפרטורת איפוס חירום סופית בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס מעל הטמפרטורה הגבוהה ביותר של התוכנית, וטמפרטורת המתנה סופית ב-20 מעלות צלזיוס.
   7. עבור אל הכרטיסייה כיול ובחר את קובץ הטמפרטורה והרגישות המתאים. שמור את השיטה
2. הכנה ומדידה של דגימות
   1. שוקלים 3-4 מ"ג מכל דגימה לכור היתוך מאלומיניום. רשמו את המשקל המדויק המועמס על כל כור היתוך ואטמו את כור ההיתוך מאלומיניום באמצעות מכסה מנוקב.
   2. הנח את כור ההיתוך במגש הדגימה האוטומטית והפעל את מצב הדגימה האוטומטית בתוכנה ובשיטה הקשורה לטעינה עבור כל דגימה.
   3. מלא את מיקום המדגם, שם הדגימה והמשקל של כל דגימה, ואת מיקום כור ההיתוך בחלון תצוגת מגש הדגימה והתחל את המדידות.
3. ניתוח נתונים
   1. פתח את הנתונים הגולמיים באמצעות התוכנה לניתוח נתונים והתווה את הטמפרטורה לעומת זרימת החום, על ידי לחיצה על הכפתור "X-time / X-temperature"
   2. בחלון המקפץ, לחץ על "הסתר מקטעים איזותרמיים". בצד שמאל של המסך, בחר רק את העקומות שיש לנתח (לדוגמה, בטל את הלחיצה על הנתונים "נוספים").
   3. בדוק את ההתנהגות התרמית של שומנים כאירועים אנדותרמיים ואקסותרמיים של אנרגיה נספגת או משוחררת בצורה של חום, בהתאמה, כפונקציה של טמפרטורה.
   4. לחץ על העקומה, ואחריה הערכה ושטח, כדי לחשב את האנתלפיה של היתוך כשטח שמתחת לעקומת האנדותרמיות.
   5. בחר את גבולות האינטגרציה על-ידי הזזת הקווים האנכיים סביב 2 עד 3 מעלות צלזיוס לפני ואחרי תחילת ונקודת הקצה של השיא.
   6. בחר קו בסיס ליניארי לשילוב השיא. השטח שבין העקומה לקו הבסיס פרופורציונלי לשינוי באנתלפיה. לחץ על החל כדי לסיים את החישוב. באופן דומה, חשב את האנתלפיה של ההתגבשות כשטח שמתחת לעקומת האקסותרמיות
   7. קבע את תחילת טמפרטורת ההיתוך (אל) על ידי לחיצה על העקומה שיש לנתח ולאחר מכן על הערכה ותחילה.
   8. בחר את גבולות הכימות על-ידי הזזת הקווים האנכיים לחלק הישר ביותר של העקומה. זה בדרך כלל סביב 5-10 מעלות צלזיוס לפני ואחרי השיא. לאחר מכן, קבע את טמפרטורת ההיתוך על ידי לחיצה על העקומה שיש לנתח, ואחריה הערכה ושיא. הערך המתקבל הוא מקסימום השיא.

2. פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה ורחבה (SWAXS)

1. הכנת כלי נגינה
   1. השתמש במערכת פיזור רנטגן, המחברת מצלמה ממוקדת נקודה המקובעת למחולל רנטגן עם צינור אטום ומצוידת ביחידת בקרה ובתוכנות נלוות.
   2. השתמש בקופר (λ = 1.54 Å) ב- 50 kV ו- 1 mA כמקור קרני רנטגן ושני גלאים רגישים הממוקמים ליניארית כדי לכסות אזורי פיזור קרני רנטגן קטנים ורחבים.
   3. ודא דרישות בטיחות כדי להגן מפני חשיפה לקרני רנטגן.
   4. הפעל את מערכת מי הקירור ביחידת הבקרה, במשאבת הוואקום, בשסתומי הגז ובמערכת בקרת החשמל והבטיחות.
   5. הפעל את בקרת המתח ושסתומי הטיהור של הגלאים בזרימת גז בין 10-20 מ"ל/דקה.
   6. הפעל את צינור הרנטגן ואת אפשרות ההמתנה והמתן כ-10 דקות. כבה את מצב ההמתנה והפעל את צינור הרנטגן בעוצמה מלאה (>50kV) והמתן לפחות 30 דקות.
   7. הפעל את תוכנת הבקרה ולחץ על איפוס TPF. בחר מסנן Tugsten והגדר מיקום. עבור אל מיקום כדי לתקן את המיקום של מסנן טונגסטן
2. הכנה ומדידה של דגימות
   1. ודא שהדגימות זמינות כאבקה עדינה. במידת הצורך, טחנו את הדגימות בעדינות בטמפרטורות נמוכות כדי לספק אבקה דקה.
   2. ממלאים את הדגימות בנימי זכוכית מיוחדים בקוטר חיצוני של כ-2 מ"מ, ונמנעים מכל לכידת אוויר בנימים. אטמו את נימי הזכוכית בשעווה והניחו אותה בזהירות לתוך מחזיק הנימים.
   3. הפעל את המנוע לסיבוב דגימה וסגור את שסתום הוואקום עד שהלחץ יהיה מתחת ל -5 mbar.
   4. בתוכנה, תקן את הגדרת המדידות על ידי בחירת רזולוציית מיקום של 1024. תקן את זמן החשיפה ל- 1200 שניות.
   5. הגדר את מגבלות האנרגיה על ידי לחיצה על הקשה על כלים, לאחר מכן לחץ על אנרגיה ורזולוציה, ולחץ על הפעלה מחדש. הגדר את מגבלות האנרגיה לטווח מתאים בין 400-900.
   6. פתחו את תריס הבטיחות והתחילו במדידות. ודא שחלון המדידה מציג מקסימום של 80 ספירות לשנייה. אם זה לא ניתן, התאם את מיקום המסנן.
3. ניתוח נתונים
   1. ייצא את הנתונים כקבצי p00. הנתונים מורכבים מעוצמת השידור והקליטה לעומת מספר הערוץ וזווית הדיפרקציה.
   2. העבר את הנתונים להערכה לתוכנה סטטיסטית ותקן את הנתונים על ידי נרמול העוצמות באמצעות מסת הפיזור שנמדדה באמצעות מסנן טונגסטן.
   3. צור עלילה בעוצמה מנורמלת לעומת זווית עקיפה של פי שניים [(2Θ) 2xtheta].
   4. השתמש בפונקציה של "קורא מסך" כדי למצוא פסגות עקיפה באזורי SAXS ו- WAXS.
   5. החל את משוואת בראג כדי לחשב את שיאי הדיפרקציה בעוצמה מרבית לריווח d קצר וארוך עבור אזורי WAXS ו- SAXS, בהתאמה.
   6. חשב את היחסים של מיקום השיא של אזור SAXS כדי לגלות את הסימטריה הגבישית של השומנים (למשל, למלר, משושה, מעוקב).
   7. השתמש בשיא הדיפרקציה הראשי של אזור SAXS כדי לכמת את עובי הגבישיות (D). התאם את הפסגה לפונקציה של גאוס באמצעות ריבועים קלאסיים וקבל את ה- FWHM על ידי לחיצה על אנליזה, פסגות וקווי בסיס, מנתח שיא, תיבת דו-שיח פתוחה.
   8. בחלון המקפץ, בחר באפשרות "התאם פסגות פרו". בחר קו בסיס קבוע עם y = 0, ובחר את שיא הדיפרקציה הראשי של אזור SAXS ולחץ על "התאם שליטה" כדי לבחור את הפרמטרים של התאמת שיא.
   9. בחר את הפונקציה GaussAmp. הגדר את הפרמטרים y_0, xc_1 ו- A_1 כקבועים וקבל את ה- FWHM מההתאמה. השתמש במשוואת שרר כדי לחשב את עובי הגבישיות.

3. בדיקות פירוק

1. שחרור API ממערכות מולטי-חלקיקים מצופות
   1. השתמש במנגנון USP 2 (משוט) למחקרי פירוק.
   2. ממלאים את כלי בדיקת הפירוק בחיץ פוספט pH 6.8, ומחממים ל 37 מעלות צלזיוס.
   3. שקלו משולשים של דגימות של חלקיקים מצופים המקבילים למנה אחת של API, והכניסו את הדגימות לכלי בדיקה לפירוק.
   4. הפעל את ההנעה במהירות של 100 סל"ד.
   5. הגדר את הדוגם האוטומטי לקחת דגימות של 1 מ"ל בנקודות הדגימה הבאות: 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, 8 שעות, 10 שעות, 12 שעות, 18 שעות ו- 24 שעות.
   6. נתח את הדגימות בשיטת HPLC מתאימה ^5,7,17.
   7. נתח את הנתונים על-ידי התוויית מהדורת ה- API המצטברת לעומת הזמן.
   8. בצע את הניסויים עבור דגימות מאוחסנות לטווח ארוך (25 ° C, 60% לחות יחסית) ומואצת (40 ° C ו 70% לחות יחסית).
2. שחרור API מננו-חלקיקי ליפידים מוצקים (SLN)
   1. הכינו נוזל ריאות מדומה (SLF) על ידי ערבוב של 0.02% (w/w) של דיפלמיטואילפוספטידילכולין במלח הפוספט של דולבקו (D-PBS), עם ההרכב הבא: KCl (2.683 mM), KH 2 PO 4 (1.47 mM), NaCl (136.893 mM), Na₂HPO_4· 2H2 O (8.058 mM), CaCl_2· 2H2 O (0.884 mM), ו- MgCl_2· 6H₂O (0.492 mM). מחממים אותו מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש בקלטות דיאליזה עם שקית קרום תאית של חתך מבוקר של 7,000 Da במשולש עבור כל דגימה.
   3. הקצה קלטת דיאליזה אחת לכל זמן דגימה: 0.5 שעות, 1.5 שעות, 3 שעות, 5 שעות, 7 שעות ו-24 שעות. הרטיבו את קלטות הדיאליזה למשך 2 דקות על ידי טבילתן ב-SLF. לאחר מכן, ייבשו בזהירות את פני השטח שלהם עם מגבות נייר רכות.
   4. להזריק 3 מ"ל של הדגימה (ליפיד-ננו-מוסט), שווה ערך ל-600 מיקרוגרם דקסמתזון, לכל קלטת.
   5. לטבול כל קלטת ב-200 מ"ל של SLF ב-37°C (תנאי כיור) ולהתסיס את המערכת ב-125 סל"ד.
   6. קח דגימות של 200 מ"ג מתוך הקלטת באמצעות מזרק בכל זמן דגימה שנקבע.
   7. קבע את תוכן ה- API באמצעות שיטת HPLC-MS^{שפותחה 18}.
   8. חשב את ה- API ששוחרר מ- SLN לפי איזון מסה, לפי¹⁸, בקצרה כהפרש בין הסכום הכולל של API ב- SLN לבין הסכום הנותר של API לאחר הדגימה.
   9. חזור על התהליך עבור דוגמאות מאוחסנות.

תוצאות

מתאם בין מעבר פולימורפי של שחרור שומנים ו-API בגבישי API מצופים שומנים:
גבישי API המצופים בגליצרול מונוסטארט נמדדים באמצעות DSC ורנטגן מיד לאחר הציפוי ולאחר 3 חודשי אחסון בתנאים מואצים (40 °C, לחות יחסית של 75%)⁷. גליצריל מונוסטארט היא מערכת רב-פאזית המכילה 40%-55% מונוגליצר...

Discussion

עקיפת קרני רנטגן אבקה ו- DSC תוארו בכתב יד זה כתקני זהב לניתוח מצב מוצק של LBEs. עקיפת קרני רנטגן אבקה יש את היתרון יוצא מן הכלל של עיבוד המדידות באתרו, עם מניפולציה מינימלית של מצב מוצק של דגימות במהלך המדידות. יתר על כן, נימים מלאים זהים ניתן לאחסן בתנאים שונים לאחר מדידות ראשוניות כדי לחק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	223506
Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K	Fisher Scientific Inco, USA
Control software of x-ray system	HECUS dedicated house equipment
Control unit of x-ray system	HECUS dedicated house equipment
Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids	Netzsch, Germany
Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany).	Netzsch, Germany
Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)	Sigma-Aldrich	850355P
Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH	Erweka GmbH, Langen, Germany
Dynasan 116	IOI OLEO		Tripalmitin
Geleol	Gattefosse		Glyceryl monosterarate
KCl	Sigma-Aldrich	529552
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Kolliphor P 188	BASF Chem Trade		Poloxamer 188
MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	S9763
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1	Netzsch, Germany	6.239.2-64.51.00
Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software	OriginLab, Northampton, MA
Proteous Analysis Software	Netzsch, Germany
Tween 65			Polysorbate 65
Witepsol PMF 1683	IOI OLEO		Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified)
Witepsol PMF 282	IOI OLEO		Diglycerol ester of stearic acid
X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors	HECUS dedicated house equipment