一套成熟的分析工具，用于研究脂质赋形剂的固态变化

摘要

该出版物展示了X射线衍射和差示扫描量热法作为研究脂质赋形剂（LBEs）固态的金标准的应用。了解LBEs的固态变化及其对医药产品性能的影响是生产稳健的脂质剂型的关键因素。

摘要

脂质赋形剂 （LBE） 具有低毒、生物相容性和天然性，其应用支持制药生产的可持续性。然而，主要的挑战是它们的固态不稳定，影响了药品的稳定性。用于加工的脂质的关键物理性质（例如熔体温度和粘度，流变性等）与其分子结构和结晶度有关。添加剂以及制造过程中涉及的热应力和机械应力会影响脂质的固态，从而影响其药品的性能。因此，了解固态的变化至关重要。在这项工作中，引入了粉末X射线衍射和差示扫描量热法（DSC）的组合作为表征脂质固态的金标准。X射线衍射是筛选多晶型和晶体生长的最有效方法。X射线衍射的多晶型排列和薄片长度分别表征了广角和小角区域。小角X射线散射（SAXS）区域可以进一步用于研究晶体生长。可以指示相变和分离。DSC用于筛选脂质的热行为，估计脂质基质中添加剂和/或活性药物成分（API）的混溶性，并提供相图。介绍了四个案例研究，其中LBEs分别用作包衣材料或封装基质以提供脂质包覆的多颗粒系统和脂质纳米悬浮液。研究了脂质固态及其在储存过程中的潜在变化，并与API释放中的改变相关。定性显微镜方法，如偏振光显微镜和扫描电子显微镜是研究微观水平结晶的补充工具。应根据所选的制造工艺添加进一步的分析方法。应仔细了解结构-功能-加工性关系，以设计稳健稳定的脂质基药品。

引言

脂质是一类含有长链脂肪烃及其衍生物的材料。它们涵盖了广泛的化学结构，包括脂肪酸、酰基甘油、甾醇和甾醇酯、蜡、磷脂和鞘脂¹。脂质作为药用赋形剂的使用始于1960年，用于将药物包埋在蜡基质中以提供缓释制剂²。此后，脂质赋形剂（LBEs）在改良药物释放、掩味、药物包封和提高药物生物利用度等各种应用中受到广泛关注。LBEs可以通过多功能制造工艺应用于各种药物剂型，即热熔包衣，喷雾干燥，固体脂质挤出，3D打印，压片和高压均质等。片剂、口腔崩解膜、多颗粒系统、纳米和微粒、颗粒和 3D 打印形式等剂型的结果是²，^3，4。

LBE具有"一般公认的安全"状态，毒性低，生物相容性好，患者耐受性更高。它们的天然来源和广泛的可用性使它们能够为绿色和可持续的制药生产赋能。然而，LBE的使用与不稳定的剂型有关。储存后脂质基产品性质的改变已被广泛报道。LBEs的固态和脂质多态性的存在被认为是脂质基剂型⁵，⁶，^7，8不稳定的主要原因。

脂质的力学和物理性质与其结晶性质及其晶体网络结构密切相关，表现出不同的结构组织层次。当脂质用于药品制造时，晶体结构受所施加的工艺参数的影响，例如温度、有机溶剂、剪切力和机械力，进而影响药品的性能⁵，⁷，⁹，10，^11，12.要了解这种结构-功能关系，重要的是要了解脂质结晶的基础和晶体结构以及筛选它们的分析方法。

在分子水平上，脂质晶体的最小单位称为"晶胞"。晶胞的常规三维重复构建晶格，其横向比纵向具有更强的分子相互作用，这解释了脂质晶体的分层构造。烃链的重复横截面填料称为子电池1，^12，13（图1）。薄片是脂质分子的横向堆积。在晶体封装中，不同薄片之间的界面由甲基端基组成，而极性甘油基团位于薄片¹⁴的内部部分。为了区分薄片中的每个脂肪酸链，使用了术语小叶，它表示由单个脂肪酸链组成的亚层。酰基甘油可以排列成双（2L）或三（3L）小叶链长度¹⁴。薄片的表面能驱使它们外延地相互堆叠，以提供纳米微晶。不同的加工因素，如冷却温度和速率，影响堆叠薄片的数量，从而影响微晶厚度（~10-100nm）。微晶的聚集导致微尺度上球晶的形成，球晶的聚集为LBEs的晶体网络提供了明确的宏观行为¹³。

固态跃迁始于分子水平。从一个子单元到另一个子单元的几何过渡称为多态性。α-、β'-和β-形式的三种主要多晶型通常在酰基甘油中发现，根据增加的稳定性排序。薄片相对于端基的倾斜发生在多态性转变^1，13期间。LBE经历了存储和熔体介导的多态性转变。当亚稳形式储存在其熔融温度以下时，就会发生储存转变，而熔融介导的转变发生在温度上升到亚稳形式的熔点以上时，从而引发更稳定形式的熔化和连续结晶。

此外，还可能发生相分离和晶体生长。相分离由初始多相结晶和一相或多相生长驱动。颗粒-颗粒相互作用，包括烧结、分子相互作用、微观结构特征和外来成分，也可以触发晶体生长^1，5。

监测LBE的固态转变及其对剂型性能的影响非常重要。其中，差示扫描量热法（DSC）和X射线衍射，特别是同步小角和广角X射线散射（SWAXS），是评估脂质固态的两个黄金标准。

DSC通常用于测量与热流相关的目标材料的焓变化，作为时间和温度的函数。该方法广泛用于筛选脂质的热行为，例如可能的熔融和结晶途径，不同多晶型的相应温度和焓，以及脂质组合物的次要和主要部分。这些数据可用于描述异质性、多相和脂质多^态性5，^7，13。

X射线衍射技术是测定固态结构的最有力方法。具有具有重复薄片的有序纳米结构，可以使用布拉格定律研究脂质晶体的X射线束反射:

d = λ/2sinθ （公式 1）

其中λ是1.542 Å的X射线波长，θ是散射光束的衍射角，d是重复层的平面间距，定义为脂质中的薄片长度。X射线的小角度区域可以完美地用于检测长间距图案并计算薄片长度（d）。重复距离d越大，散射角越小（1-15°，小角度区域），因为d与sin θ成反比。脂质的亚细胞排列可以表征为X射线衍射广角区域中的短间距图案。脂质的长间距和短间距模式（薄片长度和亚细胞排列）都可用于指示单向性多态性转化。例如，由于链条倾斜角度的变化，α形（六角形）可以更改为β（三斜线），薄片长度（长间距图案，在小角度区域，1-15°）和横截面堆积模式（短间距图案，在广角区域，16-25°）（图2）。

从SAXS区域获得的信息可以通过Scherrer方程¹⁵测量其厚度（D）来进一步用于研究晶体生长:

D = Kλ/FWHMcosθ（公式 2）

其中，FWHM是在背景和峰值之间的一半高度处测量的衍射最大值的弧度宽度，通常称为半峰全宽（FWHM）;θ 是衍射角;λ是X射线波长（1.542 Å），K（谢勒常数）是一个无量纲数，提供有关晶体形状的信息（在没有详细形状信息的情况下，K = 0.9是一个很好的近似值）。请注意，Scherrer方程可用于估计高达约100nm的平均晶体尺寸，因为峰展宽与微晶尺寸成反比。因此，其应用可用于确定纳米片的厚度，并间接确定聚集薄片的数量。在药物制剂开发中使用这种公知的方法筛选脂质的晶体性质以及产品性能的相应不稳定性的例子可以在⁵，¹²，^16，17，18中找到。

通过成熟的分析技术监测每个发育阶段LBE的固态，为设计高性能制造工艺和稳定的脂质基药品提供了有效的策略。

本出版物介绍了LBEs的综合固态分析在监测固态变化及其与药物剂型中活性药物成分（API）释放曲线变化的相关性方面的关键应用。以基于热熔包覆脂质的API晶体的多颗粒体系和通过高压均质生产的纳米脂质悬浮液为例。本出版物的重点是粉末X射线衍射和DSC作为分析工具的应用。前两个示例分别显示了多晶型转变和晶体生长对包被样品API释放变化的影响。最后一个例子揭示了脂质的稳定固态与药物产品在脂质包被的多颗粒系统和纳米脂质悬浮液中的稳定性能之间的相关性。

研究方案

1. 差示扫描量热法

1. 仪器准备
   1. 使用配备内冷器、自动进样器和软件的差示扫描量热仪进行仪器控制和数据分析。
   2. 打开氮气供应并将压力设置在 0.2–0.5 bar 之间，然后打开 DSC 仪器和自动进样器的电源。
   3. 打开软件并通过单击激活待机模式 是 按钮。允许设备平衡至少一小时
   4. 用氮气吹扫炉子，单击"新方法"图标并转到"方法定义"。激活概览窗口中的温度调制选项。 转到 标题 选项卡，然后单击"示例"选择方法。
   5. 转到"温度程序"选项卡，选择"清除 2 MFC"和"保护性 MFC"，均以 50 mL/min 的速度进行。
   6. 插入以下测量方法:待机在20°C，从20°C以5K/min加热循环至脂质熔融温度以上，在此温度下等温保持5分钟，冷却循环至0°C，5K/min至-20°C，最终紧急复位温度高于程序最高温度10°C， 最终待机温度为20°C。
   7. 转到校准选项卡并选择适当的温度和灵敏度文件。保存方法
2. 样品制备和测量
   1. 称取每个样品的3-4毫克到铝坩埚中。记录装入每个坩埚的确切重量，并用带孔的盖子密封铝制坩埚。
   2. 将坩埚放入自动进样器托盘中，并在软件中激活自动进样器模式，并为每个样品加载相关方法。
   3. 在样品盘视图窗口中填写每个样品的样品位置、样品名称和重量，以及参考坩埚的位置，然后开始测量。
3. 数据分析
   1. 使用软件打开原始数据进行数据分析，并通过单击"X时间/ X温度"按钮绘制温度与热流的关系
   2. 在弹出的窗口中，单击"隐藏等温段"。在屏幕左侧，仅选择要分析的曲线（例如，取消单击"其他"数据）。
   3. 检查脂质的热行为，分别作为以热量形式吸收或释放能量的吸热和放热事件作为温度的函数。
   4. 单击曲线，然后单击评估和面积，将融合焓计算为吸热曲线下的面积。
   5. 通过在峰值的开始和终点前后移动垂直线大约 2 到 3 摄氏度来选择积分边界。
   6. 为峰积分选择线性基线。曲线和基线之间的面积与焓的变化成正比。单击"应用"以完成计算。同样，将结晶焓计算为放热曲线下的面积
   7. 通过单击要分析的曲线，然后单击评估和开始来确定熔化温度（To）的开始。
   8. 通过将垂直线移动到曲线的最直部分来选择量化边界。这通常在峰值前后的5-10°C左右。然后，通过单击要分析的曲线来确定熔化温度，然后单击评估和峰值。获得的值是峰值最大值。

2. 小角和广角 X 射线散射 （SWAXS）

1. 仪器准备
   1. 使用X射线散射系统，将点聚焦相机固定在密封管X射线发生器上，并配备控制单元和相关软件。
   2. 使用50 kV和1 mA的cooper（λ = 1.54 Å）作为X射线源和两个线性定位的敏感探测器，以覆盖小角和广角X射线散射区域。
   3. 确保安全要求以防止 X 射线暴露。
   4. 打开控制单元、真空泵、气阀以及动力和安全控制系统上的冷却水系统。
   5. 在 10–20 mL/min 的气体流量下打开检测器的电压控制和吹扫阀。
   6. 打开 X 射线管和待机选项并等待大约 10 分钟。关闭待机模式并将 X 射线管通电至全功率 （>50kV） 并等待至少 30 分钟。
   7. 启动控制软件，然后单击重置TPF。选择Tugsten过滤器并设置位置。转到位置以固定钨过滤器的位置
2. 样品制备和测量
   1. 确保样品以细粉形式提供。如有必要，在低温下轻轻研磨样品以提供细粉。
   2. 将样品填充到外径约为 2 mm 的特殊玻璃毛细管中，避免毛细管中的任何空气滞留。用蜡密封玻璃毛细管，然后小心地将其放入毛细管支架中。
   3. 打开电机进行样品旋转并关闭真空阀，直到压力低于 5 mbar。
   4. 在软件中，通过选择位置分辨率 1024 来修复测量设置。将曝光时间固定为 1200 秒。
   5. 通过单击点击设置能量限制工具，然后单击能量和分辨率，然后单击重新启动。将能量限制设置为400-900之间的合适范围。
   6. 打开安全快门并开始测量。确保测量窗口每秒最多显示 80 个计数。如果未给出，请调整过滤器位置。
3. 数据分析
   1. 将数据导出为 p00 文件。数据包括透射和吸收强度与通道数和衍射角的关系。
   2. 将用于评估的数据传输到统计软件，并使用钨滤光片测量的散射质量对强度进行归一化，从而校正数据。
   3. 创建归一化强度与衍射角 [（2Θ） 2xtheta] 两倍的图。
   4. 使用"屏幕阅读器"功能查找SAXS和WAXS区域的衍射峰。
   5. 应用布拉格方程分别计算WAXS和SAXS区域的短d间距和长d间距的最大衍射峰。
   6. 计算SAXS区域的峰位置的比率，以找出脂质的晶体对称性（例如，层状，六角形，立方体）。
   7. 使用SAXS区域的主衍射峰来量化微晶厚度（D）。通过经典最小二乘 法将 峰拟合到高斯函数中，并通过单击"分析"、"峰和基线"、"峰值分析器"、"打开"对话框获得FWHM。
   8. 在弹出的窗口中，选择选项"Fit Peaks Pro"。选择y = 0的恒定基线，选择SAXS区域的主衍射峰，然后单击"拟合控制"以选择峰拟合参数。
   9. 选择高桑普函数。将参数y_0、xc_1和A_1设置为固定，并从拟合中获取 FWHM。使用谢勒方程计算微晶厚度。

3. 溶出度测试

1. 包衣多颗粒系统中的API释放
   1. 使用 USP 仪器 2（桨）进行溶出度研究。
   2. 用磷酸盐缓冲液pH 6.8填充溶出度测试容器，并加热至37°C。
   3. 称量相当于单剂量API的包被颗粒样品一式三份，并将样品放入溶出度测试容器中。
   4. 以 100 rpm 的速度启动桨。
   5. 将自动进样器设置为在以下采样点采集 1 mL 的样品:30 分钟、60 分钟、90 分钟、2 小时、4 小时、6 小时、8 小时、10 小时、12 小时、18 小时和 24 小时。
   6. 通过合适的HPLC方法⁵，^7，17分析样品。
   7. 通过绘制累积 API 版本与时间的关系来分析数据。
   8. 在长期（25°C，60%相对湿度）和加速（40°C和70%相对湿度）下对储存的样品进行实验。
2. 从固体脂质纳米颗粒 （SLN） 中释放 API
   1. 通过在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）中混合0.02%（w / w）的二棕榈酰磷脂酰胆碱来制备模拟肺液（SLF），其组成如下:KCl（2.683 mM），KH 2 PO 4（1.47 mM），NaCl（136.893 mM），Na₂HPO_4·2H₂O （8.058 mM）， 氯化钙_2·2H₂O （0.884 mM），和 MgCl_2·6H₂O （0.492 mM）。在37°C下预热。
   2. 使用带有纤维素膜袋的透析盒，每个样品一式三份，受控截止值为7，000 Da。
   3. 为每个采样时间分配一个透析盒:0.5小时，1.5小时，3小时，5小时，7小时和24小时。通过将透析盒浸入SLF中，将透析盒水合2分钟。然后，用柔软的纸巾小心地擦干它们的表面。
   4. 将 3 mL 样品（脂质纳米悬浮液），相当于 600 μg 地塞米松注入每个盒中。
   5. 将每个盒浸入 37 °C（下沉条件）的 200 mL SLF 中，并以 125 rpm 的速度搅拌系统。
   6. 在每个确定的采样时间使用注射器从盒内取200mg样品。
   7. 使用开发的HPLC-MS方法¹⁸测定API含量。
   8. 根据¹⁸，通过质量平衡计算SLN释放的API，简要为SLN中API总量与采样后剩余API量的差额。
   9. 对存储的样品重复该过程。

结果

脂质多态转变与脂质包被API晶体中API释放的相关性:
涂有甘油单硬脂酸酯的API晶体在包被后直接通过DSC和X射线 进行 测量，并在加速条件（40°C，75%相对湿度）下储存3个月后^7。单硬脂酸甘油酯是一种多相系统，含有40%-55%的甘油单酯、30%-45%的甘油二酯和5%-15%的甘油酯，主要是三硬脂酸¹⁹。据报道，单硬脂酸²⁰ 的亚α、α、β?...

讨论

粉末X射线衍射和DSC在本手稿中被描述为LBE固态分析的金标准。粉末X射线衍射具有原 位处理测量的突出优势，在测量过程中对样品的固态操作最少。此外，相同填充的毛细管可以在初始测量后在不同条件下储存，以研究储存过程中的固态变化。在这项工作中，我们专注于X射线的广角和小角区域，使我们能够提供尺寸高达约100 nm的结构数据。

Ultra SAXS （USAXS） 可用于跟?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	223506
Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K	Fisher Scientific Inco, USA
Control software of x-ray system	HECUS dedicated house equipment
Control unit of x-ray system	HECUS dedicated house equipment
Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids	Netzsch, Germany
Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany).	Netzsch, Germany
Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)	Sigma-Aldrich	850355P
Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH	Erweka GmbH, Langen, Germany
Dynasan 116	IOI OLEO		Tripalmitin
Geleol	Gattefosse		Glyceryl monosterarate
KCl	Sigma-Aldrich	529552
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Kolliphor P 188	BASF Chem Trade		Poloxamer 188
MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	S9763
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1	Netzsch, Germany	6.239.2-64.51.00
Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software	OriginLab, Northampton, MA
Proteous Analysis Software	Netzsch, Germany
Tween 65			Polysorbate 65
Witepsol PMF 1683	IOI OLEO		Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified)
Witepsol PMF 282	IOI OLEO		Diglycerol ester of stearic acid
X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors	HECUS dedicated house equipment