JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

השילוב של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר ו-RT-qPCR מיקרופלואידי מספק ספציפיות אנטומית וביוטכנית במדידת השעתוק בתאי עצב בודדים ובגליה. יישום שיטות יצירתיות עם הגישה הביולוגית של המערכת למחלות פסיכיאטריות עשוי להוביל לפריצות דרך בהבנה ובטיפול כגון השערת נוגד התגמול של דלקת עצבית בהתמכרות.

Abstract

שיעורים הולכים וגדלים של התנהגות התמכרות הניעו חוקרים בתחום בריאות הנפש וקלינאים כאחד להבין את ההתמכרות וההחלמה. התרחקות זו מתגמול ומהתחלה מחייבת נקודות מבט חדשות, פרדיגמות והשערות יחד עם הרחבת השיטות המיושמות לחקר התמכרות. כאן אנו מספקים דוגמה: גישה ביולוגית מערכתית לחקר אנטי-פרסיה המשלבת מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) ותגובות שרשרת פולימראז כמותיות של שעתוק מיקרופלואידי בתפוקה גבוהה (RT-qPCR). דינמיקה של רשת ביטוי גנים נמדדה וזוהה גורם מפתח לדיסרגולציה נוירו-ויסצרלית בגמילה מאלכוהול ואופיואידים, דלקת עצבית. שילוב זה של טכנולוגיות מספק ספציפיות אנטומית ופנוטיפית ברזולוציה של תא בודד עם רגישות לתפוקה גבוהה ומדדי ביטוי גנים ספציפיים המניבים הן מערכי נתונים מחוללי השערות והן אפשרויות מכניסטיות המייצרות הזדמנויות לתובנות וטיפולים חדשניים.

Introduction

התמכרות נותרה אתגר הולך וגדל בעולם המפותח 1,2. למרות ההתקדמות המדעית והקלינית הגדולה, שיעורי ההתמכרות ממשיכים לעלות בעוד היעילות של טיפולים מבוססים נשארת יציבה במקרה הטוב 3,4,5. עם זאת, ההתקדמות בביוטכנולוגיה ובגישות מדעיות הובילה לשיטות והשערות חדשניות כדי לחקור עוד יותר את הפתופיזיולוגיה של התלות בחומרים 6,7,8. ואכן, ההתפתחויות האחרונות מצביעות על כך שמושגים חדשים ופרדיגמות טיפוליות עשויים להוביל לפריצות דרך בעלות השלכות חברתיות, כלכליות ופוליטיות 9,10,11,12.

חקרנו את האנטי-פרסה בגמילה מאלכוהול ותלות באופיואידים13,14,15,16. השיטות הן מרכזיות בפרדיגמה זו17,18. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) יכולה לבחור תאים בודדים עם ספציפיות אנטומית גבוהה. פונקציונליות זו היא חלק בלתי נפרד מהשערת האנטי-פרסה של דלקת עצבית, שכן ניתן לאסוף ולנתח גם גליה וגם נוירונים מאותו תת-גרעין עצבי באותה חיה 13,14,15,16,19. לאחר מכן ניתן למדוד חלק רלוונטי של תעתיק של תאים נבחרים באמצעות תגובות שרשרת פולימראז כמותיות של שעתוק מיקרופלואידי בתפוקה גבוהה (RT-qPCR) המספקות מערכי נתונים בממדים גבוהים לניתוח חישובי המניבים תובנות על רשתות פונקציונליות20,21.

מדידת תת-קבוצה של תעתיק בתאי עצב וגליה בגרעין מוח מסוים מייצרת מערך נתונים חזק הן במספר הדגימה והן בגנים שנמדדו והוא רגיש וספציפי. כלים אלה הם אופטימליים לגישת מדעי המוח של המערכת למחלות פסיכיאטריות מכיוון שגליה, בעיקר אסטרוציטים ומיקרוגליה, הדגימו תפקיד מרכזי במחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות בעשור האחרון22,23. הגישה שלנו יכולה למדוד את התגובה האקספרסיבית של גליה ותאי עצב במקביל על פני קולטנים וליגנדים רבים המעורבים באיתות פרקריני מקומי. ואכן, ניתן להסיק איתות ממערכי נתונים אלה באמצעות שיטות כמותיות שונות כגון לוגיקה מטושטשת24. יתר על כן, זיהוי תת-פנוטיפים תאיים בתאי עצב או בגליה ותפקודם יכולים לספק תובנה לגבי האופן שבו תאי מוח בגרעינים מסוימים מתארגנים, מגיבים ומווסתים דיסרגולציה ברמת התא הבודד. ניתן למדל את הדינמיקה של מערכת פונקציונלית זו גם באמצעות ניסויי סדרות זמן16. לבסוף, מודלים של בעלי חיים יכולים להיות מעוותים מבחינה אנטומית או פרמקולוגית כדי לתת תנאי מכניסטי לגישה של מערכת זו.

ניסוי מייצג:
להלן, אנו מספקים דוגמה ליישום של שיטות אלה. מחקר זה בחן את ביטוי הגנים העצביים והמיקרוגליה של חולדות בגרעין הבודד (NTS) בתגובה לתלות באלכוהול ולגמילה16 לאחר מכן. קבוצות חולדות כללו 1) שליטה, 2) תלוי אתנול (EtOH), 3) 8 שעות נסיגה (Wd), 4) 32 שעות Wd, ו-5) 176 h Wd (איור 1A). לאחר עריפה מהירה, גזעי המוח הופרדו מהמוח הקדמי והוקפאו, ופרוסות הוכתמו עבור נוירונים חיוביים לטירוזין הידרוקסילאז (TH +) ומיקרוגליה (איור 1B). LCM שימש לאיסוף תאי עצב TH+ ו-TH ומיקרוגליה. כל התאים היו מה-NTS ונותחו כדגימות של מאגרי 10 תאים. ארבעה מערכים דינמיים של 96 x 96 מיקרופלואידיים RT-qPCR הופעלו על פלטפורמת RT-qPCR שמדדה 65 גנים (איור 1B-C). הנתונים נורמלו בשיטתt -ΔΔC ונותחו באמצעות R, ובחירת תאים בודדים אומתה באמצעות סמנים מולקולריים (איור 1D-E). האימות הטכני אומת עוד יותר על-ידי משכפלים טכניים שנותחו בתוך אצווה אחת ועל פני אצוות (איור 2 ואיור 3). תאי עצב TH+ ו-TH מאורגנים בתת-פנוטיפים שונים עם אשכולות גנים דלקתיים דומים, אך אשכולות קולטן (R) של חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA) שונים (איור 4 ואיור 5). תת-פנוטיפים שהיו בעלי ביטוי מוגבר של אשכולות גנים דלקתיים היו מיוצגים יתר על המידה ב-32 שעות Wd ואילו ביטוי קולטן GABA (GABAR) נותר נמוך בגמילה ממושכת מאלכוהול (176 שעות Wd). עבודה זו תורמת להשערה האנטי-פרסית של תלות באלכוהול ובאופיואידים, אשר משערת כי משוב מיירט מהקרביים בגמילה תורם לדיסרגולציה של גרעינים עצביים קרביים-רגשיים (כלומר, NTS ואמיגדלה) וכתוצאה מכך להמשך אוטונומי ורגשי חמור יותר, התורם לתלות בחומרים (איור 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת תומאס ג'פרסון. הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת תומאס ג'פרסון IACUC.

1. מודל בעלי חיים

  1. זכר הבית Sprague Dawley (>120 גרם, הרלן, אינדיאנפוליס, IN, ארה"ב) שלישיית חולדות בנפרד עם גישה חופשית לאתנול-צ'או (2 חולדות) או תערובת קונטרול-צ'או (חולדה אחת).
    הערה: ניסוי מייצג זה השתמש בפרוטוקול ליבר-דה-קרלי כדי לחקור את הנוירוביולוגיה של גמילה מאלכוהול25,26. שלישיות חולדות מורכבות מקבוצה של שלוש חולדות כדי לקבל את אותו מספר קלוריות, אך בסופו של דבר הן מגיעות לזרועות שונות של המחקר בעת הקרבה. שלוש הזרועות למחקר זה הן: 1) שליטה, 2) תלוי אתנול (EtOH), ו-3) נסיגה (Wd) (איור 1A). ישנם חמישה מצבים בסך הכל במחקר זה, שכן ישנן שלוש נקודות זמן לגמילה מאלכוהול (איור 1A).
    1. כל יומיים, מדדו את תערובת האתנול-צ'או הנצרכת על ידי חולדת ה-Wd והחליפו את הכמות הנצרכת באותה כמות של תערובת אתנול למזין חולדות EtOH. הוסיפו את הכמות הקלורית המקבילה של תערובת הבקרה למזין של חולדת הבקרה.
      הערה: צריכת האתנול היומית הממוצעת היא בסביבות 12-16 גרם/ק"ג לאחר 3 שבועות26.
    2. לאחר צריכה ותלות יציבה של אתנול לטווח ארוך (>5 שבועות), לגרום לגמילה חריפה מאלכוהול בחולדה על ידי ריקון מיכל המזון שלה ומילויו בתערובת בקרה. בצעו זאת באופן כזה שכל שלוש החולדות מוקרבות באותה נקודת זמן צירקדית21.
    3. בנקודת הזמן שנבחרה מראש, הקריבו את כל שלוש החולדות בשלישייה באותה נקודת זמן (קונטרול, EtOH ו-Wd).

2. קציר דגימות

  1. קציר המוח באותה נקודת זמן צירקדית עבור כל שלישיית חולדות בנקודת זמן Wd נכונה (8 שעות, 32 שעות, 176 שעות).
    1. הכינו מתנול ואמבט קרח יבש לקירור מהיר של רקמות טריות כדי לשמור על שלמות הרנ"א. מניחים בצד.
    2. שים את החולדה במיכל איזופלורן (5% בחמצן) במשך ~ 30 שניות או עד שיתרחש אובדן הכרה, כפי שצוין על ידי קצב הנשימה המופחת והיעדר פעילות מוטורית. הכניסו את ראש החולדה לגיליוטינה מושחזת כראוי כדי לערוף אותה במהירות.
    3. פתח את גולגולת החיה כדי לנתח את המוח באמצעות מלקחיים. הסר את המוח הקטן מהמוח הטרי עם סכין גילוח ידנית על ידי חיתוך גס והשלך אותו. על ידי חתך רוחבי, פורסים את גזע המוח מהמוח הקדמי.
      הערה: ניתן להשתמש בסכין גילוח ידנית עוד יותר כדי לחתוך את המוח הקדמי או את גזע המוח להמיספרה השמאלית והימנית בהתאם לתכנון הניסוי. לדוגמה, כדי לאמת ממצאים מחצי כדור אחד בשיטות שונות, לחקור סטייה שמאלה-ימינה, או להגדיל את מספר הדגימה.
    4. הוסף טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) בינונית לעומק של כ-3-4 ס"מ בתבנית הטמעת הרקמה, כך שניתן יהיה לטבול את דגימת הרקמה במלואה. הניחו את הרקמה, המוח הקדמי ו/או גזע המוח, בתבנית ההטבעה של הרקמה והוסיפו עוד O.C.T. כדי לכסות באופן מלא את דגימת הרקמה.
    5. הוסיפו את תבנית ההטבעה של רקמת הפלסטיק המכילה את דגימת הרקמה (המוח הקדמי של החולדה) לאמבטיית הקירור של קרח יבש ומתנול כדי להקפיא מיד את דגימת הרקמה. אפשרו לדגימת הרקמה בתבנית ההטבעה להישאר באמבט הקירור עד להשלמת איסוף הרקמות אך לא יותר מ-15 דקות.
      הערה: יש להיזהר כדי למנוע ממתנול להישפך לתוך מיכל הרקמות.
    6. אחסן במהירות דגימות רקמה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: RT-qPCR מיקרופלואידי מודד ביטוי גנים על ידי הגברה ומדידה של תעתיקי mRNA. תעתיקים אלה אינם יציבים יחסית, ולכן ננקטים צעדים רבים בתהליך זה כדי לשמור על הדגימה קרה ככל האפשר כדי למנוע השפלה של mRNA.

3. קריוקציה

הערה: גרעיני עצב של חולדה הם בערך 10 מיקרומטר. לפיכך, 10 מיקרומטר הוא עובי הפרוסה האופטימלי עבור מודל זה חיה. עובי הפרוסה מותאם בהתאם למודל החיה של המחקר.

  1. מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס, הוציאו את תבנית הטמעת הרקמות המכילה גזע מוח קפוא והפשירו את הדגימה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט למשך 5-10 דקות. בצעו הפשרה זו בהקפאה ל-20°C- פעם אחת בלבד לשימור mRNA.
  2. בעזרת סכין גילוח ידני, חותכים אנכית את פינות תבנית ההטבעה מפלסטיק. הסר את גזע המוח המוטבע ב- O.C.T. מעובש ההטבעה של רקמת הפלסטיק. על הצ'אק של cryostat שנקבע ב -20 °C (70 °F), להשתמש נוזל O.C.T. בטמפרטורת החדר כדבק כדי להרכיב את גזע המוח בכיוון rostral כדי caudal עבור cryosection coronal.
  3. חותכים 10 מיקרומטר קריונאסקים קורונלים בכיוון רוסטרלי לכיוון קאודלי מגזע המוח של החולדה עד שמגיעים למקטעים המכילים את אזור העניין (NTS). הגובה והרוחב של קרציות אלה הם ~ 200 מ"מ בהתבסס על מידות תבנית ההטבעה מפלסטיק.
  4. אסוף את 10 המיקרומטר קריוסקסוקציה של רקמת גזע המוח הכוללת את ה- NTS, או אזור עניין אחר המבוסס על המחקר, על ידי הפשרה על שקופיות זכוכית רגילה בטמפרטורת החדר. במהירות, הניחו את המגלשות האלה עם החלקים במחבת מתכת מקררת שנמצאת על גבי קרח יבש. בהקדם האפשרי, הכניסו שקופיות זכוכית המכילות קריומוסקציה למקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון.
    הערה: שקופית זכוכית אחת יכולה להתאים למספר הקרנות של 10 מיקרומטר מכיוון שהרוחב והגובה הם ~ 200 מ"מ. לפיכך, אותה שקופית יכולה להכיל קרציות המוכתמות עבור סוגי תאים שונים.
    1. כאשר מספר מקטעים נמצאים בשקופית, ודא שהם מופרדים על-ידי 100 מ"מ של שטח ריק. כדי ליצור גבול בין הקריוסקסוציות, השתמש בעט הידרופובי. זה מאפשר פתרונות נוגדנים שונים כדי להכתים עבור סוגי תאים שונים על אותה שקופית זכוכית. שמרו על 20 מ"מ של מקום לקריותרקציה מקצה מגלשת הזכוכית.

4. צביעה אימונופלואורסצנטית של תאים בודדים

  1. השתמש בפרוטוקול אימונופלואורסצנציה מהירה על קריוסקסציה של המוח כדי לסמן את סוגי תאי המוח הרצויים (נוירונים, מיקרוגליה, אסטרוציטים וכו ') לאיסוף באמצעות LCM.
    הערה: פרוטוקול צביעת האימונוהיסטוכימיה המשמש לניסויים אלה תוכנן להיות מהיר כדי למנוע התדרדרות עודפת של mRNA במהלך תהליך זה.
    1. מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הוציאו שקופיות זכוכית המכילות 10 מיקרומטר קריוסקסוקציה של גזע מוח של חולדה המכילה NTS. יש לטבול שקופיות במשך 30 שניות באמבט אתנול של 75% כדי לתקן רקמה קריוכירורגית. הסר נוזלים עודפים.
    2. על רקמת גזע המוח הקבועה בקריוסאציה, יש למרוח אלבומין בסרום בקר (BSA) במלח פוספט (PBS) למשך 30 שניות לחסימת קשירה לא ממוקדת של נוגדנים. לאחר מכן, לשטוף עם PBS.
    3. החל כמות מספקת של תמיסת נוגדנים ראשונית כדי לכסות את הרקמה המוקפדת (כעת קבועה וחסומה). לדגור את קטע הרקמה בתמיסת נוגדנים ראשונית למשך 2 דקות. לשטוף את הרקמה עם 2% BSA פתרון פעם אחת. תמיסת הנוגדנים הראשונית מכילה 96% מתמיסת BSA-PBS לחסימה, 3% נוגדן ראשוני ומעכב RNase 1%. נוגדן ראשוני דולל ביחס של 1:25.
      הערה: בניסוי מייצג זה, נוגדנים ראשוניים מורכבים מנוגדן anti-NeuN ונוגדן anti-Cd11β. תאי העצב חולקו עוד יותר לתת-קבוצות TH+ ו-TH, כך שתמיסות נוגדנים ראשוניות להכתמה עצבית הכילו 93% מתמיסת BSA PBS, 3% נוגדן אנטי-NeuN, 3% נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז ו-1% RNase Out.
    4. החל כמות מספקת של נוגדן משני (1:200) פתרון כדי לכסות את רקמת גזע המוח. תנו לתמיסת הנוגדנים המשנית לשטוף את הרקמה. לאחר 3 דקות, לשטוף את הרקמה עם 2% BSA פתרון פעם אחת.
      הערה: התמיסה המכילה את הנוגדן המשני הורכבה מ-196.5 μL של 2% BSA, 1 μL של תג פלואורסצנטי נגד עכברים עזים 555 ננומטר עבור סוג התא, 1 μL חמור נגד ארנב Alexa 488 ננומטר עבור מכתים TH, 2.5 μL RNase מעכב, ו-1.3 μL של DAPI (1:10000).

5. סדרת אתנול וקסילן סטנדרטית להתייבשות רקמות

  1. הניחו מגלשות זכוכית שעליהן מונחת רקמת הקריוקציה המוכתמת באמבט אתנול 75% למשך 30 שניות, ולאחר מכן הניחו באמבט אתנול 95% למשך 30 שניות, אמבט אתנול 100% למשך 30 שניות, ולבסוף 100% אתנול הן למשך 30 שניות (במיכל שני).
  2. לאחר השלמת סדרת התייבשות אתנול, לשפוך שתי אמבטיות 100% xylene טריות. לאחר מכן, הניחו את מגלשות הזכוכית באמבט הקסילן הראשון למשך דקה אחת. הסירו במהירות והכניסו את המגלשות לאמבטיית הקסילן הטרייה השנייה למשך 4 דקות.
  3. מוציאים מקסילן שקופיות זכוכית המכילות קריוסקסוציות של רקמות מוכתמות ומיובשות ומניחים במיכל חשוך אך מאוורר למשך 5 דקות לייבוש באוויר. לאחר הייבוש באוויר, יש להניח את מגלשות הזכוכית במייבש למשך 5 דקות לייבוש סופי.

6. בחר תאים בודדים באמצעות מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM)

  1. הכנס שקופית זכוכית המכילה קריומוסקים של רקמות מוכתמות, קבועות ומיובשות למחזיק הדגימה של מיקרוסקופ LCM. השתמש בציוני דרך אנטומיים כדי לאתר את האזור המעניין שממנו יתבצע איסוף התאים (NTS בדוגמה מייצגת זו).
  2. הפעל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצא סוגי תאים מוכתמים מעניינים. ודא שהגרעין של התא הרצוי נמצא באזור העניין ומבודד מגרעינים של תאים אחרים במרחק >3 מ"מ. זהה וסמן תא אחד (אם הניסוי הוא חד-תאי אמיתי) או תאים מרובים (אם הניסוי דורש דגימות של תאים בודדים [כלומר, בקנה מידה של תא יחיד] כפי שהוכח בניסוי מייצג זה) כדי לאסוף באמצעות תוכנת LCM.
    הערה: דגימות המורכבות ממאגרים של 10 תאים שימשו בניסוי מייצג זה. זה נעשה כדי להקטין את השתנות ביטוי הגנים בין דגימות ולהגדיל את מספר התאים הבודדים שנותחו, אם כי זה עדיין נשאר ניסוי בקנה מידה של תא בודד. ניסויים אמיתיים בתא בודד ניתן להשלים בשיטה זו20,27. בנוסף, ניתן לבחור גם מקטעי רקמה גדולים יותר21.
  3. לאחר בחירת התאים הרצויים, השתמש בזרוע הרובוטית LCM, הנח את כובע ה- LCM על אזור העניין בקריוזקציה המסומנת.
  4. כייל את העוצמה והמיקוד של לייזר האינפרא-אדום (IR) באמצעות צילומי בדיקה.
    הערה: הדבר נעשה עבור כל דגימה. כיול צריך להתבצע על קטע של הכובע שאינו ישירות מעל הרקמה כדי לא לבחור בטעות רקמה שאינה ניסיונית.
    1. כדי לכייל את העוצמה, התאם את משך הזמן, החוזק והגודל של צילום הלייזר IR כך שזריקה רק תמיס את דבק המכסה מספיק כדי לבחור גרעין תאי יחיד והיא גם חזקה מספיק כדי להמיס את המכסה לקריותרציה בשקופית. ערכים אלה יהיו שונים עבור כל תקרה.
    2. כיול מיקוד על-ידי מיקום כוונת הלייזר בדיוק במקום שבו הלייזר המיס את המכסה.
  5. אסוף את התאים שזוהו על ידי הפעלת לייזר אינפרא אדום LCM כדי להמיס את המכסה על הרקמה המוקפדת מעל תאים אלה. ודא שרק תאים נבחרים הוסרו מפרוסת הרקמה על ידי שימוש בזרוע הרובוט כדי לאתר את המכסה לאזור בקרת האיכות (QC) במיקרוסקופ LCM. כדי להסיר תאים עודפים על הפקק, השתמש בלייזר אולטרה סגול (UV) כדי להעלים את החומר הגנטי של התאים הנוספים.
  6. הקלט ספציפיות אנטומית באמצעות מצלמת התוכנה LCM. צלם תמונה של הרקמה המוקפדת שממנה הוסרו התאים.
  7. השתמש באטלס אנטומי (אטלס של המוח הקדמי של החולדה בדוגמה זו) כדי לקבוע את המרחק של פרוסת רקמה זו מברגמה ולרשום מידע זה כמרחק Z28. קבע את המיקום במישור X ו/או Y מהתמונה כדי להתאים באופן מלא את התא שנבחר.
  8. עם ידיים עם כפפות, הסר את מכסה ה- LCM מאזור ה- QC. לאחר מכן, הדקו את התקן חילוץ הדגימה למכסה LCM. השתמש בפיפטה כדי להחיל מאגר ליזה של 5.5 μL על התאים שנבחרו. זה נקרא עכשיו המדגם.
    הערה: תמיסת חיץ Lysis מורכבת ממאגר resuspension של 5 μL יחד עם 0.5 μL של משפר ליזה.
  9. הכנס צינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 0.5 מ"ל להתקן חילוץ הדגימה המחובר למכסה LCM. מניחים סידור זה על פלטה חמה של 75 מעלות צלזיוס כאשר מאגר הדגימה והתזה קרוב יותר לצלחת. תנו לדוגמה להתחמם במשך 15 דקות.
  10. השתמש בצנטריפוגה במהירות נמוכה ב- 0.01-0.02 x g כדי לסובב את מאגר הדגימה והתזה כלפי מטה לתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה בגודל 0.5 מ"ל. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד ל-qPCR מיקרופלואידי.

7. הפעל שבב qPCR על RT-qPCR מיקרופלואידי בפלטפורמה

  1. כדי למדוד ביטוי גנים עבור דגימות חד-תאיות, בצע הגברה מוקדמת של mRNA כמתואר להלן.
    הערה: הפרוטוקול אינו כולל מיצוי mRNA מכיוון שהדגימות הן תאים בודדים המכילים כמות נמוכה מאוד של RNA (10 pg), אשר יאבדו במהלך שלב בידוד ה-mRNA. התאים הבודדים שוכבים וממשיכים ישירות לתעתיק הפוך כדי למזער את אובדן הדגימה.
    1. צור מאגר פריימרים על ידי הוספת ראשוני הגנים mRNA qPCR (קדימה ואחורה) עבור כל גן הנבדק לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. ודא שהריכוז הסופי של כל פריימר הוא 500 ננומטר. פריימרים בניסוי לדוגמה זה מפורטים בטבלה משלימה 116.
    2. פיפטה 1 μL של 5x cDNA תגובה לערבב לתוך כל באר של צלחת PCR 96 באר.
    3. תנו לדגימות חד-תאיות להפשיר לזמן קצר (2-3 דקות) על ידי הוצאתן מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ותנו להן לשבת בטמפרטורת החדר. השתמש בצנטריפוגה במהירות נמוכה ב- 0.01-0.02 x g כדי לסובב את הדגימות עבור 20-30 שניות.
      הערה: מספר הדגימה והסוג שיש להכניס לכל באר נקבעים לפני תחילת שלב זה.
    4. לוחית ה-PCR בעלת 96 הבארות כוללת כעת את תערובת התגובה cDNA ודגימת תא בודד שנוספה לכל באר. הכניסו את הצלחת הזו לתרמוציקלר למשך 1.5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את תערובת התגובה של cDNA. סובבו את התכולה באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה ברזולוציה של 1,300 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והניחו את צלחת ה-PCR על קרח רטוב.
    5. לתוך כל באר בצלחת PCR, פיפטה 0.12 μL של T4 גן 32 חלבון, 0.73 μL של מאגר תרחיף DNA, ו 0.15 μL של 10x cDNA סינתזה מאסטר תערובת. הפעל את צלחת ה- PCR באמצעות הפרוטוקול הבא בתרמוציקלר: 25 ° C למשך 5 דקות, 50 ° C למשך 30 דקות, 55 ° C למשך 25 דקות, 60 ° C למשך 5 דקות, 70 ° C למשך 10 דקות, והחזקה סופית ב- 4 ° C.
      הערה: חלבון גן T4 32 (חלבון קושר DNA חד-גדילי (ssDNA) ) נדרש לשכפול ותיקון בקטריופאג' T4. החלבון T4 Gene 32 שימש בשלב השעתוק ההפוך של הפרוטוקול כדי לשפר את התפוקה והיעילות של שעתוק הפוך ולהגדיל את תפוקת מוצר ה-PCR.
    6. לתוך כל באר בצלחת PCR, פיפטה 7.5 μL של תערובת מאסטר פולימראז Taq. לאחר מכן, בכל באר, פיפטה 1.5 μL של מאגר פריימר נוצר בשלב 7.1.1. הפעל את לוחית ה- PCR דרך שלב ההגברה הליניארי הבא בתרמוציקלר: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 22 מחזורים של: 96 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
    7. לתוך כל באר בצלחת PCR, פיפטה 1.2 μL של exonuclease I, 4.2 μL של מאגר תרחיף DNA ו 0.6 μL של 10x exonuclease I חיץ תגובה. הפעל את צלחת ה- PCR באמצעות הפרוטוקול הבא בתרמוציקלר: 37 ° C למשך 30 דקות, 80 ° C למשך 15 דקות.
      הערה: אקסונוקלאז מזרז את הסרת הנוקלאוטידים מדנ"א חד-גדילי ליניארי בכיוון 3' עד 5'. אנו משתמשים באקסונוקלאז לניקוי דגימות להסרת פריימרים לא מקורבים וכל cDNA חד-גדילי שעשוי להימצא לאחר קדם-הגברה.
    8. לתוך כל באר בצלחת PCR, פיפטה 54 μL של חיץ TE. השתמש בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב- 1,300 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C כדי לסובב את התוכן של לוח ה- PCR.
    9. אם אתם מתכננים להמשיך לשלב הבא של הפרוטוקול, מקררים את לוחית ה-PCR בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אם יש יותר מ-12 שעות בין השלמת שלב טרום ההגברה לתחילת ה-qPCR המיקרופלואידי, מכסים את צלחת ה-qPCR ומניחים אותה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו את צלחת המדגם (צלחת PCR חדשה בגודל 96 בארות) עבור שבב qPCR כמתואר להלן.
    1. אם צלחת ה-PCR שלפני ההגברה משלב 7.1 הונחה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס, הסירו ותנו להפשרה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    2. לתוך צלחת PCR חדשה של 96 בארות, פיפטה לתוך כל באר 4.55 μL של PCR סופרמיקס נמוך rox ו 0.45 μL של 20x צבע מחייב DNA. לאחר מכן, פיפטה 3 μL של דגימה מוגברת מראש מצלחת PCR שנעשתה בשלב 7.1. השתמש בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב- 1,300 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C כדי לסובב את צלחת ה- PCR ולהניח את צלחת דגימת ה- PCR על קרח.
  3. הכינו צלחת בדיקה (צלחת PCR חדשה של 96 בארות) עבור שבב qPCR כמתואר להלן.
    1. לתוך צלחת PCR חדשה של 96 בארות, פיפטה לתוך כל באר 1.25 μL של חיץ תרחיף DNA ו 3.75 μL של 2x טעינת ריאגנט. לאחר מכן, פיפטה פריימר qPCR המתאים ב 2.5 μL של 10 μM פריימר. השתמש בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב- 1,300 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C כדי לסובב את צלחת ה- PCR ולהניח את צלחת בדיקת ה- PCR על קרח.
  4. הכן את שבב qPCR לטעינה לפלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית כמתואר להלן.
    הערה: שבב qPCR הוא פלטפורמת qPCR בזמן אמת שעובדת על עקרונות מיקרופלואידיים. שבב qPCR הוא למעשה מטריצה של 96 ערוצי דגימה ו-96 ערוצי פריימר qPCR RNA (כלומר, מבחנים) המצטלבים ב-9,216 (96 x 96) תאים. דגימה ובדיקה ספציפית משולבות בכל תא במערך שבו מתרחשת תגובת qPCR בזמן אמת. הקריאה נוצרת כערכי מחזור סף (Ct) וחלקות הגברה עבור הפריימרים שבהם נעשה שימוש.
    1. הזריקו נוזל קו בקרה לתוך שבב qPCR לצורך פרימה. הכנס את שבב ה- qPCR להתקן הערבוב המיקרופלואידי. בחר את הסקריפט הראשוני (136x) והפעל תוכנית זו.
    2. כאשר התוכנית הושלמה לאחר ~ 45 דקות, הסר את שבב qPCR מוכן. לתוך שבב qPCR מוכן, פיפטה 6 μL של התגובה מצלחת מדגם PCR לתוך הדגימה המתאימה היטב שבב qPCR.
    3. לתוך שבב qPCR מוכן, פיפטה 6 μL של התגובה מצלחת בדיקת PCR לתוך הבדיקה המתאימה היטב שבב qPCR.
      הערה: בועות אוויר עשויות להיווצר בתחתית הדגימה ולבדוק בארות בשבב qPCR, מה שיכול למנוע את כניסת התמיסות לצינורות המיקרופלואידיים. ניתן להשתמש במחט חדה כדי לפוצץ או להסיר את בועות האוויר הללו לפני החדרת שבב ה- qPCR למכשיר הערבוב המיקרופלואידי.
    4. הכנס את שבב ה- qPCR להתקן הערבוב המיקרופלואידי. בחר את סקריפט תערובת הטעינה (136x) והפעל תוכנית זו.
  5. טען שבב qPCR לפלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית.
    1. הפעל את פלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית וחמם את הנורה (~20 דקות). הסר את שבב qPCR מהתקן הערבוב המיקרופלואידי. מקלפים את מדבקת המגן מתחתית שבב ה-qPCR.
    2. פתח את פלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית וטען את שבב ה-qPCR לפלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית. הפעל את פרוטוקול ה-PCR המהיר של 96 x 96 (30 מחזורים) בפלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית.
    3. הפעל את תוכנת איסוף הנתונים ולחץ על התחל הפעלה חדשה.
    4. אמת את ברקוד השבב ואת סוג השבב ולחץ על הבא. לחץ על קובץ Chip Run ועיין במיקום הקובץ לאחסון איסוף הנתונים.
    5. לחץ על סוג היישום ובחר ביטוי גנים; בחר ROX לעיון פסיבי, בחר בדיקה יחידה ובחר EvaGreen עבור סוג הבדיקה.
    6. לחץ כדי לבחור את תוכנית המחזור התרמי ובחר Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR + קובץ v2.pcl נמס.

8. ניתוח נתונים

  1. העלה נתונים משבב qPCR לרוץ לתוכנת הניתוח עבור QC כמתואר להלן.
    1. הורד את תוכנת ניתוח הנתונים. ניתן למצוא זאת באתר הבא: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. הפעל את התוכנה כדי לנתח את הניסוי המיקרופלואידי RT-qPCR.
    2. בתוך התוכנה, פתח את Chip Run. לאחר מכן, פתח את הקובץ ChipRun.bml שנוצר על-ידי הניסוי. יופיע חלון עם פרטי הניסוי, כולל הפניה פסיבית, בדיקה ותוכנית תרמית PCR.
      הערה: ניתן לבצע בקרת איכות (QC) וניתוח נתונים במחשב המחובר לפלטפורמת RT-qPCR המיקרופלואידית או על ידי העברת קובץ ה- .bml למחשב אחר באמצעות כונן הבזק או באמצעים אחרים.
  2. הגדר את ההגדרה לדוגמה כמתואר להלן.
    הערה: שלב זה יוצר תבנית מסומנת של דוגמאות ומבחנים (פריימרים qPCR) עבור נהלי בקרת האיכות (QC) וניתוח הנתונים.
    1. בחר סייר השבבים > הגדרת צלחת דגימה וצור לוח דגימה חדש. בחר את סוג המיכל ותבנית המיכל המתאימים (SBS96 עבור צלחת 96 בארות ששימשה בניסוי מייצג זה).
    2. הדבק את התוויות לדוגמה בגיליון האלקטרוני של התוכנה בהתאם לתכנון הניסויי ובחר מפה מתפריט משימה. בחר SBS96-Left.dsp. ההגדרה לדוגמה ממופה כעת. בחר תצוגת פרטים > ניתוח כדי לעדכן שינויים אלה בקובץ.
      הערה: כל השינויים שבוצעו בתוכנה זו לא יישמרו עד ללחיצה על לחצן נתח .
  3. הגדר את דוגמאות הפקדים בתוכנה. בחר את התאים עבור דגימות הפקדים על-ידי לחיצה שמאלית והחזק תוך כדי גרירת התאים לבחירה. ניתן לבחור תאים בודדים על-ידי לחיצה ממושכת על מקש Ctrl ולחיצה על תאים בודדים. עבור דגימות RNA סטנדרטיות (סדרת דילול), הזן את שם הדגימה ואת ריכוז ה- RNA המשמש. לחץ על נתח כדי לשמור.
  4. הגדר את הגדרת הגלאי בדומה לשלב 8.2 לעיל אך עם שמות בדיקת RT-qPCR, כלומר שמות הגנים שנבדקו. בחר הגדרת לוח גלאי וצור לוח בדיקה חדש. בחר את סוג ותבנית הגורם המכיל המתאימים (SBS96 עבור צלחת של 96 בארות). הדבק את שמות הבדיקה לפי תכנון הניסוי ולחץ על נתח כדי לשמור.
  5. התחל את תהליך בקרת איכות המשתמש (QC) כמתואר להלן.
    הערה: ניסוי מייצג זה השתמש בשיטת סף של זמן מחזור (Ct). כלומר, דגימות שלא הגיעו לאות סף שהוגדר על ידי התוכנה (Auto Global) או באופן ידני (User Global) ייחשבו לתגובות כושלות ולא ייכללו במערך הנתונים.
    1. בחר ניתוח תצוגה > מסגרת פעילות. בחלונית הגדרות ניתוח, שנה את ההגדרות לאוטומטי כללי (מחשב באופן אוטומטי סף המוחל על השבב כולו) או למשתמש כללי. הגדר את תיקון קו הבסיס לנגזרת ליניארית. אם נעשה שימוש ב-User Global, יש לקבוע את סף הכשל באופן ידני כמו בניסוי המייצג.
    2. ניסוי מייצג זה השתמש בכלל QC באופן הבא: אם לבדיקה בודדת או למדגם היה שיעור כישלון של 70% או יותר, כל השורה או העמודה בערכת הנתונים נכשלה.
    3. סקור ידנית כל תגובה בשבב 96 x 96. דמיינו את עקומות ההגברה ואת עקומות ההמסה כדי לקבוע אם כל תגובה תואמת את תבנית ה-qPCR הצפויה. אם עקומת ההגברה או ההיתוך אינה תואמת את הצפוי, נכשלו בתגובה זו.
  6. לאחר QC, ייצא את הנתונים על-ידי בחירה באפשרות קובץ > ייצוא ושמור את ערכת הנתונים כקובץ .csv.
  7. גזום את ערכת הנתונים מכיוון שקובץ .csv המיוצא כולל גם מטריצת Pass-Fail וגם מטריצה עם ערכי Ct גולמיים. השתמש במטריצת Pass-Fail כדי להחליף תאים שנכשלו בערכת הנתונים ב- NA.
  8. הורד את הגרסה המעודכנת ביותר של תוכנת קוד פתוח R ולאחר מכן הורד את היישום R-Studio. העלה את מערך הנתונים המנורמל ל- R. נתח נתונים בהתאם למחקר.
  9. נרמל את מערך הנתונים באמצעות שיטתt -ΔΔC כמתואר להלן.
    הערה: ניתן להשתמש במרכוז חציוני או בנורמליזציה של גנים על פני שורת דגימה כדי ליצור ערךt -ΔC. בניסוי הייצוגי נעשה שימוש במרכוז חציוני ואומת על ידי נורמליזציה של גנים ביתיים. ניתן לעשות זאת בפורמט .csv או על ידי העלאה לתוכנת ניתוח נתונים.
    1. עבור מרכוז חציוני, חשב את ערך ה- Ct החציוני המחושב מכל ערכי Ct עבור דגימה בודדת (מאגר של 10 תאים). לאחר מכן, הפחת את כל ערכי Ct בודדים מערך חציוני זה. זה מניב ערךt -ΔC.
    2. עבור נורמליזציה של גנים ביתיים, חשב את הביטוי הממוצע של הגנים של משק הבית (Actb, Gapdh ו- Ldha בניסוי המייצג) עבור כל דגימה והשתמש בערך זה בתור זה שממנו ניתן להפחית את ערכי ה- Ct הבודדים.
    3. כדי ליצור ערך t -ΔΔC, קח את החציון של כל עמודת בדיקה, המכיל כעת את הערךt -ΔC. הפחת את חציון הבדיקה מכל ערך t -ΔC כדי להפיק ערךt -ΔΔC.
  10. חשב ציוני z עבור כל ערךt -ΔΔC באמצעות פונקציית קנה המידה ב- R. השתמש בפונקציית מפת החום R או בתוכנה נפרדת כדי ליצור מפת חום.
  11. השתמש בפונקציית המתאם של פירסון כדי לחשב את המתאמים של פירסון בין כל גן. השתמש בפונקציית ההיתוך ב- R כדי לארגן את ערכת הנתונים עבור פונקציונליות אחרת. ייצא נתונים אלה והעלה אותם לתוכנת רשת מתאם גנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אימות של אוסף תא בודד מתבצע באופן חזותי במהלך הליכי LCM. גרעיני התאים מוערכים בתחנת QC. ניתן לקבוע את סוג התא על ידי פליטת פלואורופור מתויג עבור אותו סוג תא והמורפולוגיה הכללית שלו. אם נבחרו תאים לא רצויים על הכובע, ניתן להשמיד את החומר הגנטי שלהם באמצעות לייזר UV בתחנת QC. יש צורך גם באימות נוסף ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרעת שימוש באלכוהול נותרה מחלה מאתגרת לטיפול. הקבוצה שלנו ניגשה להפרעה זו על ידי חקירת תהליכים אנטי-פרסואליים עם נקודת מבט של מדעי המוח המערכתיים. מדדנו שינויים בביטוי גנים בתאי עצב בודדים מסוג NTS ובמיקרוגליה בסדרת זמן גמילה מאלכוהול16. ה- NTS נבחר בשל תפקידו הבולט בדיסרגולציה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

העבודה המוצגת כאן מומנה באמצעות NIH HLB U01 HL133360 שהוענק ל- JS ו- RV, NIDA R21 DA036372 שהוענק ל- JS ו- EVB, T32 AA-007463 הוענק ליאן הוק לתמיכה ב- SJO'S, והמכון הלאומי לאלכוהוליזם והתמכרות לאלכוהול: R01 AA018873.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20X DNA Binding DyeFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Loading ReagentFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AntibodyGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60EMD MilliporeMAB377Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibodyabcamab112Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR platform
Bovine Serum AntigenSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific LCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer KitThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry Antibody
Exonuclease INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Sample Extraction DeviceThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope SlidesThermoFisher Scientific22-037-246Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction TubeThermoFisher ScientificN8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Antibody
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermoFisher Scientific11754250Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 ProteinNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mLUSA Scientific1402-9700NA

References

  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790(2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612(2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375(2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved