解剖学的に特異的な単一細胞遺伝子発現法による依存行動における反報酬の要因の調査

要約

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとマイクロ流体RT-qPCRの組み合わせは、単一ニューロンおよびグリアのトランスクリプトームを測定する際に解剖学的およびバイオテクノロジーの特異性を提供します。精神疾患に対するシステムの生物学的アプローチによる創造的な方法を適用することは、依存症における神経炎症反報酬仮説などの理解と治療におけるブレークスルーにつながる可能性があります。

要約

依存症行動の割合の増加により、メンタルヘルスの研究者と臨床医は同様に、反報酬と回復を理解するようになりました。報酬と開始からのこのシフトは、依存症を調査するために適用される方法の拡張とともに、新しい視点、パラダイム、および仮説を必要とします。ここでは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)とハイスループットマイクロ流体逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を組み合わせたアンチリターンを調査するためのシステム生物学的アプローチの例を紹介します。遺伝子発現ネットワークのダイナミクスが測定され、アルコールおよびオピオイド離脱における神経内臓調節不全の主要な推進力である神経炎症が特定されました。この技術の組み合わせは、ハイスループット感度と特異的遺伝子発現測定により、単一細胞分解能で解剖学的および表現型の特異性を提供し、仮説生成データセットと新しい洞察と治療の機会を生み出す機構的可能性の両方を生み出します。

概要

依存症は依然として先進国で増大する課題です^1,2。科学的および臨床的大きな進歩にもかかわらず、依存症の割合は増加し続けていますが、確立された治療法の有効性はせいぜい^{安定しています3,4,5}。しかし、バイオテクノロジーと科学的アプローチの進歩は、物質依存の病態生理学をさらに調査するための新しい方法と仮説をもたらしました^6,7,8。実際、最近の進展は、新しい概念と治療パラダイムが社会的、経済的、政治的結果を伴うブレークスルーにつながる可能性があることを示唆しています9,10,11,12。

アルコールの離脱とオピオイド依存症における反報酬を調査した^13,14,15,16。メソッドはこのパラダイム^{の中心です17,18}。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)は、解剖学的特異性の高い単一細胞を選択できます。この機能は、グリアとニューロンの両方を同じ動物の同じニューロン亜核から収集および分析できるため、神経炎症反報酬仮説に不可欠です^13、14、15、^16、19。次に、選択された細胞のトランスクリプトームの関連部分を、ハイスループットマイクロ流体逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)で測定することができ、機能ネットワークへの洞察をもたらす計算分析のための高次元データセットを提供する^20,21。

特定の脳核のニューロンとグリアのトランスクリプトームのサブセットを測定すると、サンプル数と測定された遺伝子の両方で堅牢で、感度と特異的なデータセットが生成されます。これらのツールは、グリア、主に星状細胞とミクログリアが過去10年間に神経疾患および精神疾患の中心的な役割を示してきたため、精神疾患に対するシステムの神経科学的アプローチに最適です^22,23。私たちのアプローチは、局所的なパラクリンシグナル伝達に関与する多数の受容体とリガンドにわたって同時にグリアとニューロンの発現応答を測定することができます。実際、シグナリングは、ファジィ論理²⁴などの様々な定量的方法を用いて、これらのデータセットから推論することができる。さらに、ニューロンまたはグリアにおける細胞サブ表現型とその機能の同定は、特定の核の脳細胞が単一細胞レベルでどのように組織化、応答、および調節不全になるかについての洞察を提供することができます。この機能システムのダイナミクスは、時系列実験¹⁶でモデル化することもできます。最後に、動物モデルを解剖学的または薬理学的に摂動して、このシステムのアプローチに機構的状態を与えることができます。

代表的な実験:
以下に、これらの方法の適用例を示します。この研究では、アルコール依存とその後の離脱に応答した孤立核(NTS)におけるラットのニューロンおよびミクログリア遺伝子発現を調査しました¹⁶。ラットコホートは、1)対照、2)エタノール依存性(EtOH)、3)8時間離脱(Wd)、4)32時間Wd、および5)176時間Wdから構成されていました(図1A)。急速な断頭に続いて、脳幹を前脳から分離して凍結切片化し、チロシンヒドロキシラーゼ陽性(TH+)ニューロンおよびミクログリアについてスライスを染色した(図1B)。LCMは、TH+およびTH-ニューロンおよびミクログリアの両方を収集するために使用されました。すべての細胞はNTSからのものであり、10細胞プールのサンプルとして分析されました。4つの96 x 96マイクロ流体RT-qPCRダイナミックアレイを、65個の遺伝子を測定するRT-qPCRプラットフォームで実行しました(図1B-C)。データは-_ΔΔCT法を用いて正規化し、Rを用いて解析し、単一細胞選択を分子マーカーで検証した(図1D-E)。技術的検証は、単一のバッチ内およびバッチ間で分析された技術反復によってさらに検証されました(図2および図3)。TH+ニューロンとTH-ニューロンは、炎症性遺伝子クラスターは類似しているがγ-アミノ酪酸(GABA)受容体(R)クラスターが異なる異なるサブ表現型に編成されています(図4および図5)。炎症性遺伝子クラスターの発現が上昇したサブ表現型は32時間Wdで過剰発現したが、GABA受容体(GABAR)発現は長期のアルコール離脱(176時間Wd)で低いままであった。この研究は、離脱中の内臓からの傍受的フィードバックが内臓感情神経核(すなわち、NTSおよび扁桃体)の調節不全に寄与し、より重度の自律神経および感情的後遺症をもたらし、物質依存に寄与すると推測するアルコールおよびオピオイド依存の反報酬仮説に貢献しています(図6)。

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プロトコル

この研究は、トーマスジェファーソン大学の動物管理および使用委員会(IACUC)の勧告に従って実施されました。プロトコルはトーマスジェファーソン大学IACUCによって承認されました。

1. 動物モデル

1. ハウスオスのSprague Dawley(>120 g、ハーラン、インディアナポリス、インディアナ州、米国)ラットトリプレットを個別にエタノールチャウ(2匹のラット)またはコントロールチャウ混合物(1匹のラット)に無料でアクセスします。
   注:この代表的な実験では、Lieber-DeCarliプロトコルを使用して、アルコール離脱の神経生物学を研究しました^25,26。ラットトリプレットは、同じカロリー数を与えられる3匹のラットコホートで構成されていますが、犠牲にして研究の異なるアームに終わります。この研究の3つのアームは、1)対照、2)エタノール依存性(EtOH)、および3)離脱(Wd)です(図1A)。この研究では、3つのアルコール離脱時点があるため、合計5つの条件があります(図1A)。
   1. 一日おきに、Wdラットによって消費されたエタノール-固形混合物を測定し、消費された量を同量のエタノール混合物とEtOHラットフィーダーに交換する。同等のカロリー量のコントロール混合物をコントロールラットのフィーダーに追加します。.
      注:1日の平均エタノール消費量は、3週間後に約12〜16 g / kgです²⁶。
   2. 安定した長期エタノール消費と依存(>5週間)の後、Wdラットの食品容器を空にして対照混合物で満たすことにより、Wdラットに急性アルコール離脱を誘発します。.3匹のラットすべてが同じ概日時点²¹で犠牲になるようにこれを実行する。
   3. 事前に選択した時点で、トリプレットの3匹のラットすべてを同じ時点で犠牲にします(Control、EtOH、およびWd)。

2.サンプル採取

1. 適切なWd時点(8時間、32時間、176時間)で各ラットトリプレットの同じ概日時点で脳を収穫します。
   1. RNAの完全性を維持するために、新鮮な組織を急速に冷却するためのメタノールとドライアイスバスを準備します。横に置きます。
   2. ラットをイソフルランタンク(酸素中5%)に~30秒間、または呼吸数の低下と運動活動の欠如によって示されるように意識喪失が起こるまで入れます。.ラットの頭を適切に鋭利にしたギロチンに入れて、すばやく斬首します。
   3. 動物の頭蓋骨を開き、鉗子を使用して脳を解剖します。手持ちカミソリで新鮮な脳から小脳をグロススライスして取り除き、廃棄します。横切開により、前脳から脳幹をスライスします。
      注:ハンドヘルドカミソリをさらに使用して、実験デザインに従って前脳または脳幹を左右の半球に半分割することができます。たとえば、1 つの半球からの結果を異なる方法で検証するには、左右の発散を調査するか、サンプル数を増やします。
   4. 組織サンプルを完全に浸すことができるように、組織埋め込み金型に最適な切断温度(O.C.T.)媒体を約3〜4 cmの深さに追加します。組織、前脳および/または脳幹を組織埋め込み型に入れ、組織サンプルを完全に覆うためにO.C.T.を追加します。
   5. 組織サンプル(ラット前脳)を含むプラスチック組織包埋型をドライアイスとメタノールの冷却浴に追加し、組織サンプルを直ちに凍結させます。埋め込み型内の組織サンプルを、組織の収集が完了するまで冷却槽に残しますが、15分以内です。
      注意: メタノールがティッシュ容器にこぼれないように注意してください。
   6. 組織サンプルを-80°Cで迅速に保存します。
      注:マイクロ流体RT-qPCRは、mRNA転写物を増幅および測定することにより、遺伝子発現を測定します。これらの転写物は比較的不安定であるため、このプロセスでは、mRNAの分解を防ぐためにサンプルをできるだけ冷たく保つために多くの手順が取られます。

3.凍結切片

注:ラットの神経核は約10μmです。したがって、10 μmがこの動物モデルに最適なスライス厚さです。スライスの厚さは、研究のための動物モデルに従って調整される。

1. -80°Cの冷凍庫から、凍結脳幹を含む組織包埋型を取り出し、サンプルをクライオスタットで-20°Cで5〜10分間解凍します。mRNA保存のために、この-20°Cへの凍結融解を1回だけ行う。
2. ハンドヘルドカミソリを使用して、プラスチック埋め込み型の角を垂直に切ります。O.C.T.に埋め込まれた脳幹をプラスチック組織埋め込み型から取り出します。-20°Cに設定したクライオスタットのチャックに、室温の液体O.C.T.を接着剤として使用し、冠状動脈凍結切開のために吻側から尾側に脳幹を取り付けます。
3. 関心領域(NTS)を含む切片に達するまで、ラットの脳幹から吻側から尾側の10μmの冠状凍結切片を切断します。これらの凍結切片の高さと幅は、プラスチック埋め込み金型の寸法に基づいて~200mmです。
4. NTSを含む脳幹組織の10 μm凍結切片、または研究に基づく他の関心領域を、室温のプレーンスライドガラスに解凍マウントして収集します。すばやく、これらのスライドをセクションとともにドライアイスの上にある冷却金属鍋に入れます。できるだけ早く、凍結切片を含むスライドガラスを-80°Cの冷凍庫に入れて保管します。
   注:幅と高さが~200 mmであるため、1つのスライドガラスに複数の10 μm凍結切片を取り付けることができます。したがって、同じスライドに、異なる細胞型について染色された凍結切片を含めることができます。
   1. スライド上に複数のセクションがある場合は、それらが100 mmの空きスペースで区切られていることを確認してください。凍結切片の間に境界線を作成するには、疎水性ペンを使用します。これにより、同じスライドガラス上で異なる細胞タイプに対して異なる抗体溶液を染色することができます。スライドガラスの端から凍結切片用のスペースを20mm維持します。

4. 単一細胞の免疫蛍光染色

1. 脳凍結切片で迅速な染色免疫蛍光プロトコルを使用して、LCMを使用して収集する目的の脳細胞タイプ(ニューロン、ミクログリア、アストロサイトなど)を標識します。
   注:これらの実験に使用された免疫組織化学染色プロトコルは、このプロセス中の過剰なmRNA分解を防ぐために迅速になるように設計されました。
   1. -80°Cの冷凍庫から、NTSを含むラット脳幹の10μm凍結切片を含むスライドガラスを取り出します。スライドを75%エタノール浴に30秒間浸して、凍結切片組織を固定します。余分な液体を取り除きます。
   2. 固定凍結切片脳幹組織に、抗体の非標的結合をブロックするために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)を30秒間塗布します。その後、PBSで洗ってください。
   3. 凍結切片組織を覆うのに十分な量の一次抗体溶液を塗布します(現在は固定およびブロックされています)。組織切片を一次抗体溶液中で2分間インキュベートします。2%BSA溶液で組織を一度洗浄します。一次抗体溶液には、ブロッキング用のBSA-PBS溶液の96%、一次抗体3%、およびRNase阻害剤1%が含まれています。一次抗体を1:25の比率で希釈した。
      注:この代表的な実験では、一次抗体は抗NeuN抗体と抗Cd11β抗体で構成されています。ニューロンはさらにTH+とTH-サブグループに細分されたため、ニューロン染色用の一次抗体溶液には、BSA PBS溶液の93%、抗NeuN抗体3%、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体3%、およびRNase Out1%が含まれていました。
   4. 脳幹組織を覆うのに十分な量の二次抗体(1:200)溶液を塗布します。二次抗体溶液を組織に浸します。3分後、2%BSA溶液で組織を1回洗浄する。
      注:二次抗体を含む溶液は、196.5 μLの2%BSA、1 μLのヤギ抗マウス555 nm蛍光タグ、TH染色用の1 μLのロバ抗ウサギAlexa 488 nm、2.5 μLのRNase阻害剤、および1.3 μLのDAPI(1:10000)で構成されていました。

5.標準的なエタノールおよびキシレン組織脱水シリーズ

1. 染色された凍結切片組織を75%エタノール浴に30秒間置くスライドガラスを置き、続いて95%エタノール浴に30秒間、100%エタノール浴に30秒間、最後に100%エタノールを両方とも30秒間(第2の容器に入れる)。
2. エタノール脱水シリーズが完了したら、2つの新鮮な100%キシレン浴を注ぎます。次に、スライドガラスを最初のキシレン浴に1分間置きます。スライドをすばやく取り外して、もう一方の新鮮なキシレンバスに4分間入れます。
3. キシレンから染色および脱水された組織凍結切片を含むスライドガラスを取り出し、暗いが換気された容器に5分間置き、風乾します。風乾後、スライドガラスをデシケーターに5分間入れて最終乾燥させます。

6. レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を使用した単一細胞の選択

1. 染色、固定、脱水した組織凍結切片を含むスライドガラスをLCM顕微鏡サンプルホルダーに挿入します。解剖学的ランドマークを使用して、細胞収集が行われる関心領域を特定します(この代表的な例ではNTS)。
2. 顕微鏡蛍光をオンにして、目的の染色された細胞タイプを見つけます。目的の細胞の核が関心領域にあり、他の細胞の核から>3 mmの距離で分離されていることを確認します。LCMソフトウェアを使用して収集する1つの細胞(実験が真の単一細胞の場合)または複数の細胞(この代表的な実験で実証されているように、実験でプールされた単一細胞サンプル[つまり、単一細胞スケール]が必要な場合)を特定してマークします。
   注:この代表的な実験では、10セルプールで構成されるサンプルを使用しました。これは、サンプル間の遺伝子発現の変動を減らし、分析される単一細胞の数を増やすために行われますが、これはまだ単一細胞スケールの実験のままです。真の単一細胞実験は、この方法^20、27で完了することができる。さらに、より大きな組織切片も選択することができる²¹。
3. 目的の細胞を選択したら、LCMロボットアームを使用して、マークされた組織凍結切片の関心領域にLCMキャップを置きます。
4. テストショットを使用して、赤外線(IR)レーザーの強度とターゲティングを調整します。
   注:これはサンプルごとに行われます。キャリブレーションは、非実験組織を誤って選択しないように、組織の真上ではないキャップのセクションで実行する必要があります。
   1. 強度を較正するには、IRレーザーショットの持続時間、強度、およびサイズを調整して、ショットが単一の細胞核を選択するのに十分なキャップ接着剤のみを溶かし、スライド上の凍結切片までキャップを溶かすのに十分な強度になるようにします。これらの値はキャップごとに異なります。
   2. レーザーがキャップを溶かした場所にレーザー十字線を正確に位置させることで、ターゲティングを調整します。
5. LCM赤外線レーザーを発射して同定した細胞を集め、それらの細胞の上の凍結切片組織にキャップを溶かします。ロボットアームを使用してキャップをLCM顕微鏡の品質管理(QC)領域に配置することにより、選択した細胞のみが組織スライスから持ち上げられたことを確認します。キャップ上の余分な細胞を取り除くには、紫外線(UV)レーザーを使用して余分な細胞の遺伝物質を消し去ります。
6. LCMソフトウェアカメラで解剖学的特異性を記録します。細胞が除去された凍結切開組織の写真を撮ります。
7. 解剖学的アトラス(この例ではラット前脳のアトラス)を使用して、ブレグマからのこの組織スライスの距離を決定し、この情報をZ距離²⁸として記録します。写真からX面および/またはY平面内の位置を決定して、選択したセルを完全にローカライズします。
8. 手袋をはめた手で、QC領域からLCMキャップを取り外します。次に、サンプル抽出装置をLCMキャップに固定します。ピペットを使用して、選択した細胞に5.5 μLの溶解バッファーを適用します。これは現在、サンプルと呼ばれています。
   注:溶解バッファー溶液は、5 μLの再懸濁バッファーと0.5 μLの溶解エンハンサーで構成されています。
9. 0.5 mLの微量遠心チューブを、LCMキャップに取り付けられたサンプル抽出装置に取り付けます。この配置を75°Cのホットプレートに置き、サンプルと溶解バッファーをプレートに近づけます。サンプルを15分間加熱します。
10. 0.01〜0.02 x g の低速遠心分離機を使用して、サンプルと溶解バッファーを0.5 mLマイクロ遠心チューブの底に回転させます。マイクロ流体qPCRまでサンプルを-80°Cで保存します。

7. プラットフォーム上のマイクロ流体RT-qPCR上でqPCRチップを実行します

1. シングルセルサンプルの遺伝子発現を測定するには、以下に説明するようにmRNAプレアンプレーションを実行します。
   注:サンプルは非常に少量のRNA(10 pg)を含む単一細胞であり、mRNA単離ステップ中に失われるため、プロトコルにはmRNA抽出は含まれません。単一細胞は溶解され、サンプルの損失を最小限に抑えるために逆転写のために直接進行します。
   1. アッセイするすべての遺伝子のmRNA qPCR遺伝子プライマー(順方向および逆方向)を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに追加して、プライマープールを作成します。各プライマーの最終濃度が500 nMであることを確認してください。本実施例実験におけるプライマーは、補足表1から¹⁶に記載される。
   2. 1 μLの5x cDNA反応ミックスを96ウェルPCRプレートの各ウェルにピペットで入れます。
   3. 単一細胞サンプルを-80°Cの冷凍庫から取り出し、室温で放置することにより、短時間(2〜3分)解凍します。0.01-0.02 x g の低速遠心分離機を使用して、サンプルを20-30秒間スピンダウンします。 各単一細胞サンプル5.5 μLを96ウェルPCRプレートの異なるウェルにピペットで移します。
      注:各ウェルに入れるサンプル番号とタイプは、このステップを開始する前に決定されます。
   4. 96ウェルPCRプレートには、cDNA反応ミックスと各ウェルへのシングルセルサンプルが追加されています。このプレートをサーモサイクラーに65°Cで1.5分間入れ、cDNA反応混合物を活性化します。1,300 x g の高速遠心分離で4°Cで1分間かけて内容物をスピンダウンし、PCRプレートをウェットアイスの上に置きます。
   5. PCRプレートの各ウェルに、0.12 μLのT4遺伝子32タンパク質、0.73 μLのDNA懸濁液バッファー、および0.15 μLの10x cDNA合成マスターミックスをピペットで入れます。サーモサイクラーでPCRプレートを次のプロトコルで実行します:25°Cで5分間、50°Cで30分間、55°Cで25分間、60°Cで5分間、70°Cで10分間、および4°Cで最終ホールドします。
      注:T4遺伝子32タンパク質(一本鎖DNA(ssDNA)結合タンパク質)は、バクテリオファージT4の複製と修復に必要です。T4遺伝子32タンパク質は、逆転写の収率と効率を改善し、PCR産物の収率を高めるために、プロトコルの逆転写ステップで使用されました。
   6. PCRプレートの各ウェルに、7.5 μLのTaqポリメラーゼマスターミックスをピペットで入れます。これに続いて、各ウェルに、ステップ7.1.1で作成したプライマープール1.5 μLをピペットで入れた。PCRプレートをサーモサイクラーで次のリニアプリアンプステップに通します:95°Cで10分間;22サイクル:96°Cで5秒、60°Cで4分間。
   7. PCRプレートの各ウェルに、1.2 μLのエキソヌクレアーゼI、4.2 μLのDNA懸濁液バッファー、および0.6 μLの10xエキソヌクレアーゼI反応バッファーをピペットで入れます。サーモサイクラーでPCRプレートを次のプロトコルで実行します:37°Cで30分間、80°Cで15分間。
      注:エキソヌクレアーゼは、直鎖状一本鎖DNAから3'から5'方向にヌクレオチドを除去する触媒となります。エキソヌクレアーゼは、取り込まれていないプライマーや、事前増幅後に存在する可能性のある一本鎖cDNAを除去するためのサンプルクリーンアップに使用します。
   8. PCRプレート内の各ウェルに、54 μLのTEバッファーをピペットで入れます。1,300 x g の高速遠心分離機を4°Cで5分間使用して、PCRプレートの内容物をスピンダウンします。
   9. プロトコルの次のフェーズを継続する場合は、PCRプレートを4°Cで冷蔵します。 プレアンプフェーズの完了からマイクロ流体qPCRの開始までに12時間以上かかる場合は、qPCRプレートを覆い、-20°Cの冷凍庫に入れます。
2. 下記のようにqPCRチップ用のサンプルプレート(新しい96ウェルPCRプレート)を作成します。
   1. ステップ7.1のプリアンプPCRプレートを-20°Cの冷凍庫に入れた場合は、取り出し、室温で10分間解凍します。
   2. 新しい96ウェルPCRプレートに、4.55 μLのPCRスーパーミックス低ロックスと0.45 μLの20x DNA結合色素を各ウェルにピペットで入れます。次いで、ステップ7.1で作製したPCRプレートから3μLの予め増幅されたサンプルをピペットで採取する。1,300 x g で4°Cで5分間の高速遠心分離を使用してPCRプレートをスピンダウンし、PCRサンプルプレートを氷上に置きます。
3. 下記のようにqPCRチップ用のアッセイプレート(新しい96ウェルPCRプレート)を作成します。
   1. 新しい96ウェルPCRプレートに、各ウェルに1.25 μLのDNA懸濁液バッファーと3.75 μLの2xアッセイローディング試薬をピペットで入れます。次に、対応するqPCRプライマーを2.5 μLの10 μMプライマーでピペットで行います。1,300 x gの高速遠心分離機を4°Cで5分間使用し、PCRプレートをスピンダウンし、PCRアッセイプレートを氷上に置きます。
4. 以下に説明するように、マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームにロードするためのqPCRチップを準備します。
   注:qPCRチップは、マイクロ流体原理で動作するリアルタイムqPCRプラットフォームです。qPCRチップは、基本的に96個のサンプルチャンネルと96個のRNA qPCRプライマーチャンネル(すなわちアッセイ)のマトリックスであり、9,216(96 x 96)チャンバー内で交差します。サンプルと特定のアッセイは、リアルタイムのqPCR反応が起こるアレイの各チャンバーで組み合わされます。読み出しは、使用するプライマーの閾値サイクル(Ct)値および増幅プロットとして生成されます。
   1. プライミングのためにコントロールライン液をqPCRチップに注入します。qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入します。プライム(136x)スクリプトを選択し、このプログラムを実行します。
   2. ~45分後にプログラムが完了したら、プライミングされたqPCRチップを取り外します。プライミングしたqPCRチップに、PCRサンプルプレートからqPCRチップ内の対応するサンプルウェルに6 μLの反応液をピペットで入れます。
   3. プライミングしたqPCRチップに、PCRアッセイプレートからqPCRチップ内の対応するアッセイウェルに6 μLの反応液をピペットで入れます。
      注:qPCRチップのサンプルおよびアッセイウェルの底部に気泡が形成され、溶液がマイクロ流体導管に入るのを妨げる可能性があります。qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入する前に、鋭利な針を使用してこれらの気泡をはじいたり除去したりすることができます。
   4. qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入します。ロードミックス(136x)スクリプトを選択し、このプログラムを実行します。
5. qPCRチップをマイクロ流体RT-qPCRプラットフォームにロードします。
   1. マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームの電源を入れ、電球を温めます(~20分)。マイクロ流体混合装置からqPCRチップを取り外します。qPCRチップの下部から保護ステッカーをはがします。
   2. マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームを開き、qPCRチップをマイクロ流体RT-qPCRプラットフォームにロードします。マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームで高速96 x 96 PCRプロトコル(30サイクル)を実行します。
   3. データ収集ソフトウェアを起動します-[ 新しい実行の開始]をクリックします。
   4. チップバーコードを確認し、チップタイプをクリックして[ 次へ]をクリックします。 Chip Run ファイルをクリックし、データ収集ストレージのファイルの場所を参照します。
   5. アプリケーションタイプをクリックし、遺伝子発現を選択します。パッシブリファレンスにはROXを選択し、シングルプローブを選択し、プローブタイプにはEvaGreenを選択します。
   6. クリックして熱サイクルプログラムを選択し、 バイオマークHD:GEファスト96x96 PCR+メルトv2.pclファイルを選択します。

8.データ分析

1. 以下に説明するように、qPCRチップランからQC用の分析ソフトウェアにデータをアップロードします。
   1. データ分析ソフトウェアをダウンロードします。これは、次のWebサイトにあります:https://www.fluidigm.com/products-services/software#。ソフトウェアを起動して、マイクロ流体RT-qPCR実験を分析します。
   2. ソフトウェア内で、 チップランを開きます。次に、実験によって作成された ChipRun.bml ファイルを開きます。パッシブリファレンス、プローブ、PCRサーマルプログラムなどの実験の詳細を示すウィンドウが表示されます。
      注:品質管理(QC)とデータ分析は、マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームに接続されたコンピューター上で、またはフラッシュドライブまたはその他の手段 を介して .bmlファイルを別のコンピューターに転送することによって実行できます。
2. 以下で説明するように、サンプル設定を定義します。
   注:このステップでは、品質管理(QC)およびデータ分析手順用のサンプルおよびアッセイ(qPCRプライマー)のラベルテンプレートを作成します。
   1. [チップ エクスプローラ]>[サンプル プレート設定]を選択し、新しいサンプル プレートを作成します。適切な容器タイプと容器フォーマットを選択します(この代表的な実験で使用した96ウェルプレートの場合はSBS96)。
   2. 実験計画に従ってサンプル ラベルをソフトウェア スプレッドシートに貼り付け、[タスク] メニューから [ マップ ] を選択します。 SBS96-Left.dsp を選択します。これで、サンプルのセットアップがマップされました。 [詳細ビュー] > [分析] を選択して、 ファイル内のこれらの変更を更新します。
      注意: このソフトウェアで行われた変更は、[ 分析 ]ボタンをクリックするまで保存されません。
3. ソフトウェアで制御サンプルを定義します。コントロールサンプルのセルを選択するには、左クリックしたまま、選択するセルをドラッグします。個々のセルは、Ctrlキーを押しながら個々のセルをクリックすることで選択できます。RNA標準サンプル(希釈系列)の場合は、サンプル名と使用するRNA濃度を入力します。[ 分析 ]をクリックして保存します。
4. 上記のステップ8.2と同様に検出器のセットアップを定義しますが、RT-qPCRアッセイ名、つまりアッセイする遺伝子の名前を使用します。 検出器プレートのセットアップ を選択し、新しいアッセイプレートを作成します。適切な容器タイプとフォーマットを選択します(96ウェルプレートの場合はSBS96)。実験デザインに従ってアッセイ名を貼り付け、 分析 をクリックして保存します。
5. 以下に説明するように、ユーザー品質管理(QC)プロセスを開始します。
   注:この代表的な実験では、サイクルタイム(Ct)閾値化法を使用しました。つまり、ソフトウェア(自動グローバル)または手動(ユーザーグローバル)によって定義されたしきい値信号に達しなかったサンプルは、失敗した反応と見なされ、データセットに含まれません。
   1. [タスク フレーム>分析ビュー] を選択します。分析設定ペインで、設定を [自動グローバル] (チップ全体に適用されるしきい値を自動的に計算する) または [ユーザー グローバル] に変更します。ベースライン補正を線形微分に設定します。User Global を使用する場合は、代表的な実験と同様に、失敗しきい値を手動で決定する必要があります。
   2. この代表的な実験では、次のようなQCルールを使用しました:個々のアッセイまたはサンプルの失敗率が70%以上の場合、データセットのその行または列全体が失敗しました。
   3. 96 x 96チップの各反応を手動で確認します。増幅曲線と融解曲線を視覚化して、各反応が予想されるqPCRパターンに従っているかどうかを判断します。増幅曲線または融解曲線が予想と一致しない場合は、その反応に失敗します。
6. QC に続いて、[ ファイル] > [エクスポート] を選択してデータをエクスポートし、データセットを.csvファイルとして保存します。
7. エクスポートされた.csvファイルには、合格/不合格行列と生の Ct 値を持つ行列の両方が含まれているため、データセットを削除します。合格-不合格行列を使用して、データセット内の失敗したセルをNAに置き換えます。
8. オープンソースの R ソフトウェアの最新バージョンをダウンロードし、R-Studio アプリケーションをダウンロードします。正規化されたデータセットを R にアップロードします。 スタディに適合するようにデータを分析します。
9. 以下で説明するように、-ΔΔC_t メソッドを使用してデータセットを正規化します。
   注:中央値センタリングまたはハウスキーピング遺伝子正規化をサンプル行全体で使用して、-ΔC_t 値を生成できます。代表的な実験では、中央値センタリングが使用され、ハウスキーピング遺伝子正規化によって検証されました。これは、.csv形式で、またはデータ分析ソフトウェアにアップロードすることによって行うことができます。
   1. 中央値センタリングの場合は、個々のサンプル(10セルプール)のすべてのCt値から計算された中央値のCt値を計算します。次に、この中央値からすべての個々のCt値を減算します。これにより、-ΔC_t 値が得られます。
   2. ハウスキーピング遺伝子の正規化では、各サンプルのハウスキーピング遺伝子(代表的な実験ではActb、 Gapdh、 およびLdha )の平均発現を計算し、この値を個々のCt値を減算する値として使用します。
   3. -_ΔΔCT値を生成するには、各アッセイカラムの中央値を取り、-_ΔCct値を含みます。各−_ΔCt値からアッセイ中央値を減算して、−ΔΔCt値を生成する。
10. R のスケール関数を使用して、各 -ΔΔC_t 値の Z スコアを計算します。 R ヒート マップ関数または別のソフトウェアを使用してヒート マップを生成します。
11. ピアソン相関関数を使用して、各遺伝子間のピアソン相関を計算します。R で melt 関数を使用して、他の機能のためにデータセットを整理します。このデータをエクスポートし、遺伝子相関ネットワークソフトウェアにアップロードします。

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結果

単一細胞収集の検証は、LCM手順中に視覚的に実行されます。細胞核はQCステーションで評価されます。細胞型は、その細胞型およびその一般的な形態に対するタグ付き蛍光色素の放出によって決定できます。キャップ上で望ましくない細胞が選択されている場合、それらの遺伝物質はQCステーションでUVレーザーで破壊される可能性があります。分子分析によるさらなる検証も必要です。この?...

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ディスカッション

アルコール使用障害は依然として治療が困難な疾患です。私たちのグループは、システム神経科学の視点で反報酬プロセスを調査することにより、この障害にアプローチしました。アルコール離脱時系列¹⁶における単一NTSニューロンおよびミクログリアの遺伝子発現変化を測定した。NTSは、アルコール離脱症候群で発生する自律神経調節不全におけるその顕著な役割のため?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody	abcam	ab112	Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit	ThermoFisher Scientific	11739010	Invitrogen
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	R37118	Seconadry Antibody
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A28180	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL	USA Scientific	1402-9700	NA