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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Kombination von Laser-Capture-Mikrodissektion und mikrofluidischer RT-qPCR bietet anatomische und biotechnische Spezifität bei der Messung des Transkriptoms in einzelnen Neuronen und Glia. Die Anwendung kreativer Methoden mit dem systembiologischen Ansatz auf psychiatrische Erkrankungen kann zu Durchbrüchen im Verständnis und in der Behandlung führen, wie z.B. die Neuroinflammation-Anti-Belohnungs-Hypothese bei Sucht.

Zusammenfassung

Steigende Raten von Suchtverhalten haben Forscher für psychische Gesundheit und Kliniker gleichermaßen motiviert, Antibelohnung und Genesung zu verstehen. Diese Abkehr von Belohnung und Beginn erfordert neue Perspektiven, Paradigmen und Hypothesen sowie eine Erweiterung der Methoden zur Untersuchung von Sucht. Hier geben wir ein Beispiel: Ein systembiologischer Ansatz zur Untersuchung von Antibelohnung, der Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) und Hochdurchsatz-Mikrofluidik-Reverse-Transkriptions-quantitative Polymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR) kombiniert. Die Netzwerkdynamik der Genexpression wurde gemessen und ein Schlüsselfaktor für neuroviszerale Dysregulation beim Alkohol- und Opioidentzug, die Neuroinflammation, identifiziert. Diese Kombination von Technologien bietet anatomische und phänotypische Spezifität bei Einzelzellauflösung mit hoher Durchsatzsensitivität und spezifischen Genexpressionsmessungen, die sowohl hypothesengenerierende Datensätze als auch mechanistische Möglichkeiten liefern, die Möglichkeiten für neue Erkenntnisse und Behandlungen schaffen.

Einleitung

Sucht bleibt eine wachsende Herausforderung in den Industrieländern 1,2. Trotz großer wissenschaftlicher und klinischer Fortschritte steigen die Suchtraten weiter an, während die Wirksamkeit etablierter Behandlungen bestenfalls stabil bleibt 3,4,5. Fortschritte in der Biotechnologie und wissenschaftliche Ansätze haben jedoch zu neuen Methoden und Hypothesen geführt, um die Pathophysiologie der Substanzabhängigkeit weiter zu untersuchen 6,7,8. Tatsächlich deuten jüngste Entwicklungen darauf hin, dass neuartige Konzepte und Behandlungsparadigmen zu Durchbrüchen mit sozialen, wirtschaftlichen und politischen Konsequenzen führen können 9,10,11,12.

Wir untersuchten Anti-Belohnung beim Entzug von Alkohol und Opioidabhängigkeit13,14,15,16. Methoden sind zentral für dieses Paradigma17,18. Die Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) kann einzelne Zellen mit hoher anatomischer Spezifität auswählen. Diese Funktionalität ist integraler Bestandteil der Neuroinflammation-Anti-Belohnungshypothese, da sowohl Gliazellen als auch Neuronen aus demselben neuronalen Subnukleus im selben Tier gesammelt und analysiert werden können 13,14,15,16,19. Ein relevanter Teil des Transkriptoms ausgewählter Zellen kann dann mit Hochdurchsatz-mikrofluidischen quantitativen Polymerase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR) gemessen werden, die hochdimensionale Datensätze für die computergestützte Analyse liefern, die Einblicke in funktionelle Netzwerke liefern20,21.

Die Messung einer Teilmenge des Transkriptoms in Neuronen und Gliazellen in einem bestimmten Hirnkern erzeugt einen Datensatz, der sowohl in Bezug auf die Probenanzahl als auch auf die gemessenen Gene robust und sensitiv und spezifisch ist. Diese Werkzeuge sind optimal für den neurowissenschaftlichen Ansatz eines Systems für psychiatrische Erkrankungen, da Glia, hauptsächlich Astrozyten und Mikroglia, in den letzten zehn Jahren eine zentrale Rolle bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen gespielt haben22,23. Unser Ansatz kann die expressive Reaktion von Gliazellen und Neuronen gleichzeitig über zahlreiche Rezeptoren und Liganden messen, die an der lokalen parakrinen Signalübertragung beteiligt sind. Tatsächlich kann die Signalisierung aus diesen Datensätzen mit verschiedenen quantitativen Methoden wie Fuzzy-Logik24 abgeleitet werden. Darüber hinaus kann die Identifizierung zellulärer Subphänotypen in Neuronen oder Gliazellen und ihrer Funktion Aufschluss darüber geben, wie sich Gehirnzellen in bestimmten Kernen auf Einzelzellebene organisieren, darauf reagieren und sie dysregulieren. Die Dynamik dieses Funktionssystems kann auch mit Zeitreihenexperimentenmodelliert werden 16. Schließlich können Tiermodelle anatomisch oder pharmakologisch gestört werden, um dem Ansatz dieses Systems eine mechanistische Bedingung zu verleihen.

Repräsentatives Experiment:
Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für die Anwendung dieser Methoden. Diese Studie untersuchte die neuronale und Mikroglia-Genexpression von Ratten im solitären Kern (NTS) als Reaktion auf Alkoholabhängigkeit und anschließenden Entzug16. Rattenkohorten umfassten 1) Kontrolle, 2) Ethanol-abhängig (EtOH), 3) 8-Stunden-Entzug (Wd), 4) 32 Stunden Wd und 5) 176 Stunden Wd (Abbildung 1A). Nach einer schnellen Enthauptung wurden Hirnstängel vom Vorderhirn getrennt und kryosektioniert, und Scheiben wurden für Tyrosinhydroxylase-positive (TH +) Neuronen und Mikroglia gefärbt (Abbildung 1B). LCM wurde verwendet, um sowohl TH+ als auch TH-Neuronen und Mikroglia zu sammeln. Alle Zellen stammten aus dem NTS und wurden als Proben von 10-Zell-Pools analysiert. Vier 96 x 96 mikrofluidische RT-qPCR dynamische Arrays wurden auf der RT-qPCR-Plattform mit 65 Genen durchgeführt (Abbildung 1B-C). Die Daten wurden mit einer -ΔΔC-t-Methode normalisiert und mit R analysiert, und die Einzelzellselektion wurde mit molekularen Markern validiert (Abbildung 1D-E). Die technische Validierung wurde weiter durch technische Replikate überprüft, die innerhalb einer einzelnen Charge und chargenübergreifend analysiert wurden (Abbildung 2 und Abbildung 3). TH+- und TH-Neuronen, die in verschiedenen Subphänotypen mit ähnlichen entzündlichen Genclustern, aber unterschiedlichen γ-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptor-Clustern (R) organisiert sind (Abbildung 4 und Abbildung 5). Subphänotypen, die eine erhöhte Expression von entzündlichen Genclustern aufwiesen, waren bei 32 h Wd überrepräsentiert, während die GABA-Rezeptor (GABAR) -Expression bei langwierigem Alkoholentzug niedrig blieb (176 h Wd). Diese Arbeit trägt zur Anti-Belohnungshypothese der Alkohol- und Opioidabhängigkeit bei, die vermutet, dass interzeptives Feedback von den Eingeweiden beim Entzug zur Dysregulation viszeral-emotionaler neuronaler Kerne (d.h. NTS und Amygdala) beiträgt, was zu schwereren autonomen und emotionalen Folgeerscheinungen führt, die zur Substanzabhängigkeit beitragen (Abbildung 6).

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Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Thomas Jefferson University durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Thomas Jefferson University IACUC genehmigt.

1. Tiermodell

  1. Hausrüde Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) Rattendrillinge einzeln mit freiem Zugang zu Ethanol-Chow (2 Ratten) oder Kontroll-Chow-Mischung (1 Ratte).
    ANMERKUNG: Dieses repräsentative Experiment verwendete das Lieber-DeCarli-Protokoll, um die Neurobiologie des Alkoholentzugs zu untersuchen25,26. Rattendrillinge bestehen aus einer Kohorte mit drei Ratten, die mit der gleichen Anzahl von Kalorien gefüttert werden, aber bei Opfern in verschiedenen Armen der Studie enden. Die drei Arme für diese Studie sind: 1) Kontrolle, 2) Ethanol-abhängig (EtOH) und 3) Entzug (Wd) (Abbildung 1A). Es gibt fünf Gesamtbedingungen in dieser Studie, da es drei Alkoholentzugszeiten gibt (Abbildung 1A).
    1. Messen Sie jeden zweiten Tag das von der Wd-Ratte verbrauchte Ethanol-Chow-Gemisch und ersetzen Sie die verbrauchte Menge durch die gleiche Menge Ethanolgemisch zum EtOH-Rattenfutterautomaten. Geben Sie die äquivalente kalorische Menge der Kontrollmischung in den Feeder der Kontrollratte.
      HINWEIS: Der durchschnittliche tägliche Ethanolverbrauch beträgt nach 3 Wochenetwa 12-16 g / kg.
    2. Nach stabilem langfristigem Ethanolkonsum und -abhängigkeit (>5 Wochen) induzieren Sie einen akuten Alkoholentzug bei Wd-Ratte, indem Sie ihren Futterbehälter leeren und mit einer Kontrollmischung füllen. Führen Sie dies so durch, dass alle drei Ratten zum gleichen circadianen Zeitpunkt21 geopfert werden.
    3. Opfern Sie zum vorgewählten Zeitpunkt alle drei Ratten im Triplett zum gleichen Zeitpunkt (Control, EtOH und Wd).

2. Probenentnahme

  1. Das Gehirn wird zum gleichen circadianen Zeitpunkt für jedes Rattentriplett zum richtigen Zeitpunkt (8 h, 32 h, 176 h) entnommen.
    1. Bereiten Sie ein Methanol- und Trockeneisbad für die schnelle Abkühlung von frischem Gewebe vor, um die RNA-Integrität zu erhalten. Zur Seite stellen.
    2. Legen Sie die Ratte für ~ 30 s in einen Isoflurantank (5% Sauerstoff) oder bis der Bewusstseinsverlust auftritt, wie durch die reduzierte Atemfrequenz und das Fehlen motorischer Aktivität angezeigt. Stecken Sie den Rattenkopf in eine richtig geschärfte Guillotine, um schnell zu enthaupten.
    3. Öffnen Sie den Schädel des Tieres, um das Gehirn mit einer Pinzette zu sezieren. Entfernen Sie das Kleinhirn mit einem Handrasierer aus dem frischen Gehirn durch grobes Schneiden und entsorgen Sie es. Durch Querschnitt schneiden Sie den Hirnstamm vom Vorderhirn ab.
      HINWEIS: Ein Handrasierer kann weiter verwendet werden, um das Vorderhirn oder den Hirnstamm entsprechend dem experimentellen Design in die linke und rechte Hemisphäre zu halbieren. Zum Beispiel, um Befunde aus einer Hemisphäre mit verschiedenen Methoden zu validieren, Links-Rechts-Divergenz zu untersuchen oder die Stichprobenzahl zu erhöhen.
    4. Fügen Sie die optimale Schnitttemperatur (O.C.T.) medium bis ca. 3-4 cm Tiefe in die Gewebeeinbettungsform ein, damit die Gewebeprobe vollständig eingetaucht werden kann. Legen Sie das Gewebe, das Vorderhirn und / oder den Hirnstamm in die Gewebeeinbettungsform und fügen Sie mehr O.C.T. hinzu, um die Gewebeprobe vollständig zu bedecken.
    5. Fügen Sie die plastische Gewebeeinbettungsform mit der Gewebeprobe (Rattenvorderhirn) in das Kühlbad aus Trockeneis und Methanol hinzu, um die Gewebeprobe sofort einzufrieren. Lassen Sie die Gewebeprobe in der Einbettungsform im Kühlbad verbleiben, bis die Gewebeentnahme abgeschlossen ist, jedoch nicht länger als 15 Minuten.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Methanol nicht in den Gewebebehälter gelangt.
    6. Gewebeproben schnell bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Die mikrofluidische RT-qPCR misst die Genexpression durch Amplifikation und Messung von mRNA-Transkripten. Diese Transkripte sind relativ instabil, so dass in diesem Prozess viele Schritte unternommen werden, um die Probe so kalt wie möglich zu halten, um einen mRNA-Abbau zu verhindern.

3. Kryosektion

HINWEIS: Ein neuronaler Kern der Ratte ist etwa 10 μm groß. Somit ist 10 μm die optimale Scheibendicke für dieses Tiermodell. Die Schichtdicke wird entsprechend dem Tiermodell für die Studie angepasst.

  1. Nehmen Sie aus dem -80 °C Gefrierschrank die Gewebeeinbettungsform, die gefrorenen Hirnstamm enthält, und tauen Sie die Probe bei -20 °C im Kryostat für 5-10 min auf. Führen Sie dieses Gefrier-Auftauen auf -20 °C nur einmal durch, um die mRNA-Konservierung zu erhalten.
  2. Schneiden Sie mit einem Handrasierer die Ecken der Kunststoffeinbettungsform vertikal ab. Entfernen Sie den in O.C.T. eingebetteten Hirnstamm aus der plastischen Gewebeeinbettungsform. Verwenden Sie auf dem auf -20 °C eingestellten Kryostat die Flüssigkeit O.C.T. bei Raumtemperatur als Klebstoff, um den Hirnstamm in rostraler bis kaudaler Richtung für die koronale Kryosektion zu montieren.
  3. Schneiden Sie 10 μm koronale Kryosektionen in rostraler bis kaudaler Richtung vom Hirnstamm der Ratte, bis Abschnitte erreicht sind, die die Region of Interest (NTS) enthalten. Die Höhe und Breite dieser Kryosektionen beträgt ~200 mm, basierend auf den Abmessungen der Kunststoffeinbettungsform.
  4. Sammeln Sie die 10-μm-Kryosektionen von Hirnstammgewebe, die das NTS oder eine andere Region von Interesse enthalten, die auf der Studie basieren, indem Sie sie auf Objektträger mit Raumtemperatur auftauen. Legen Sie diese Dias mit Abschnitten schnell in eine kühlende Metallpfanne, die sich auf Trockeneis befindet. Glasobjektträger mit Kryoschnitten so schnell wie möglich zur Lagerung in den Gefrierschrank bei -80 °C legen.
    HINWEIS: Ein einzelner Objektträger kann mehrere 10 μm Kryosektionen aufnehmen, da die Breite und Höhe ~ 200 mm beträgt. So kann derselbe Objektträger Kryosektionen enthalten, die für verschiedene Zelltypen gefärbt sind.
    1. Wenn sich mehrere Abschnitte auf dem Objektträger befinden, stellen Sie sicher, dass sie durch 100 mm leeren Raum getrennt sind. Um einen Rahmen zwischen den Kryosektionen zu erstellen, verwenden Sie einen hydrophoben Stift. Dies ermöglicht verschiedene Antikörperlösungen, um verschiedene Zelltypen auf demselben Objektträger zu färben. Halten Sie 20 mm Platz für den Kryoschnitt vom Rand des Glasobjektträgers.

4. Immunfluoreszenzfärbung einzelner Zellen

  1. Verwenden Sie das Immunfluoreszenzprotokoll für die schnelle Färbung von Kryosektionen des Gehirns, um die gewünschten Gehirnzelltypen (Neuronen, Mikroglia, Astrozyten usw.) für die Sammlung mit LCM zu markieren.
    HINWEIS: Das für diese Experimente verwendete immunhistochemische Färbeprotokoll wurde so konzipiert, dass es schnell ist, um einen übermäßigen mRNA-Abbau während dieses Prozesses zu verhindern.
    1. Aus dem Gefrierschrank bei -80 °C nehmen Sie Glasobjektträger heraus, die 10 μm Kryoschnitte von Rattenhirnstamm enthalten, die NTS enthalten. Tauchen Sie Objektträger für 30 s in ein 75% Ethanolbad, um kryogeschnittenes Gewebe zu fixieren. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.
    2. Auf das feste kryosektionierte Hirnstammgewebe 2% Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) für 30 s auftragen, um die ungezielte Bindung von Antikörpern zu blockieren. Anschließend mit PBS waschen.
    3. Tragen Sie genügend primäre Antikörperlösung auf, um das kryogeschnittene Gewebe (jetzt fixiert und blockiert) zu bedecken. Inkubieren Sie den Gewebeschnitt in primärer Antikörperlösung für 2 min. Waschen Sie das Gewebe einmal mit 2% iger BSA-Lösung. Die primäre Antikörperlösung enthält 96% der BSA-PBS-Lösung zur Blockierung, 3% primäre Antikörper und 1% RNase-Inhibitor. Der primäre Antikörper wurde im Verhältnis 1:25 verdünnt.
      HINWEIS: In diesem repräsentativen Experiment bestehen primäre Antikörper aus Anti-NeuN-Antikörpern und Anti-Cd11β-Antikörpern. Neuronen wurden weiter in TH+ und TH-Untergruppen unterteilt, so dass primäre Antikörperlösungen für die neuronale Färbung 93% der BSA PBS-Lösung, 3% Anti-NeuN-Antikörper, 3% Anti-Tyrosinhydroxylase-Antikörper und 1% RNase Out enthielten.
    4. Tragen Sie genügend sekundäre Antikörperlösung (1:200) auf, um das Hirnstammgewebe zu bedecken. Lassen Sie die sekundäre Antikörperlösung das Gewebe baden. Nach 3 min das Gewebe einmal mit 2% iger BSA-Lösung waschen.
      HINWEIS: Die Lösung, die den sekundären Antikörper enthielt, bestand aus 196,5 μL 2% BSA, 1 μL Ziegen-Anti-Maus-555 nm Fluoreszenz-Tag für den Zelltyp, 1 μL Esel-Anti-Kaninchen-Alexa 488 nm für TH-Färbung, 2,5 μL RNase-Inhibitor und 1,3 μL DAPI (1:10000).

5. Standard-Ethanol- und Xylolgewebe-Dehydratisierungsreihe

  1. Legen Sie Glasobjektträger, auf denen das gefärbte Kryosektionsgewebe für 30 s in einem 75% Ethanolbad ruht, gefolgt von einem 95% Ethanolbad für 30 s, einem 100% Ethanolbad für 30 s und schließlich einem 100% Ethanol für beide für 30 s (in einem zweiten Behälter).
  2. Nach Abschluss der Ethanol-Dehydratisierungsserie gießen Sie zwei frische 100% Xylol-Bäder. Anschließend legen Sie die Objektträger für 1 min in das erste Xylolbad. Die Objektträger schnell entfernen und für 4 min in das andere frische Xylolbad legen.
  3. Nehmen Sie Objektträger mit gefärbten und dehydrierten Gewebekryosektionen aus Xylol und legen Sie sie 5 Minuten lang zum Trocknen an der Luft in einen dunklen, aber belüfteten Behälter. Nach der Lufttrocknung Glasobjektträger für 5 min in einen Exsikkator legen, um sie endgültig zu trocknen.

6. Auswahl einzelner Zellen mittels Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM)

  1. Führen Sie einen Objektträger mit gefärbten, fixierten und dehydrierten Gewebekryosektionen in den Probenhalter des LCM-Mikroskops ein. Verwenden Sie anatomische Orientierungspunkte, um die Region von Interesse zu lokalisieren, von der aus die Zellentnahme stattfindet (NTS in diesem repräsentativen Beispiel).
  2. Schalten Sie die Mikroskopfluoreszenz ein und finden Sie gefärbte Zelltypen von Interesse. Stellen Sie sicher, dass sich der Kern der gewünschten Zelle im interessierenden Bereich befindet und von den Kernen anderer Zellen durch einen Abstand >3 mm isoliert ist. Identifizieren und markieren Sie eine Zelle (wenn das Experiment eine echte Einzelzelle ist) oder mehrere Zellen (wenn das Experiment gepoolte Einzelzellproben erfordert [d. h. Einzelzellskala], wie in diesem repräsentativen Experiment gezeigt), um sie mit der LCM-Software zu sammeln.
    HINWEIS: In diesem repräsentativen Experiment wurden Proben aus 10-Zell-Pools verwendet. Dies geschieht, um die Genexpressionsvariabilität zwischen den Proben zu verringern und die Anzahl der analysierten Einzelzellen zu erhöhen, obwohl dies immer noch ein Einzelzellexperiment bleibt. Echte Einzelzellexperimente können mit dieser Methode durchgeführt werden20,27. Zusätzlich können auch größere Gewebeschnitte ausgewählt werden21.
  3. Nachdem die gewünschten Zellen ausgewählt wurden, verwenden Sie den LCM-Roboterarm und platzieren Sie die LCM-Kappe auf dem interessierenden Bereich der markierten Gewebekryosektion.
  4. Kalibrieren Sie die Intensität und Ausrichtung des Infrarot (IR) Lasers mithilfe von Testaufnahmen.
    HINWEIS: Dies geschieht für jedes Beispiel. Die Kalibrierung sollte an einem Abschnitt der Kappe durchgeführt werden, der sich nicht direkt über dem Gewebe befindet, um nicht fälschlicherweise nicht-experimentelles Gewebe auszuwählen.
    1. Um die Intensität zu kalibrieren, passen Sie die Dauer, Stärke und Größe des IR-Laserschusses so an, dass ein Schuss nur den Kappenkleber so schmilzt, dass ein einzelner Zellkern ausgewählt werden kann, und auch stark genug ist, um die Kappe mit der Kryosektion auf dem Objektträger zu schmelzen. Diese Werte sind für jede Obergrenze unterschiedlich.
    2. Kalibrieren Sie das Ziel, indem Sie das Fadenkreuz des Lasers genau dort lokalisieren, wo der Laser die Kappe geschmolzen hat.
  5. Sammeln Sie die identifizierten Zellen, indem Sie den LCM-Infrarotlaser abfeuern, um die Kappe auf das kryogeschnittene Gewebe über diesen Zellen zu schmelzen. Stellen Sie sicher, dass nur ausgewählte Zellen aus der Gewebescheibe gehoben wurden, indem Sie den Roboterarm verwenden, um die Kappe im Bereich der Qualitätskontrolle (QC) des LCM-Mikroskops zu lokalisieren. Um überschüssige Zellen auf der Kappe zu entfernen, verwenden Sie einen ultravioletten (UV) Laser, um das genetische Material der zusätzlichen Zellen zu verwischen.
  6. Erfassen Sie anatomische Spezifität mit der LCM-Softwarekamera. Machen Sie ein Bild des kryogeschnittenen Gewebes, aus dem die Zelle(n) entfernt wurde(n).
  7. Verwenden Sie einen anatomischen Atlas (in diesem Beispiel einen Atlas des Rattenvorderhirns), um den Abstand dieser Gewebescheibe von Bregma zu bestimmen, und notieren Sie diese Information als Z-Abstand28. Bestimmen Sie die Position in der X- und/oder Y-Ebene anhand des Fotos, um die ausgewählte Zelle vollständig zu lokalisieren.
  8. Entfernen Sie mit behandschuhten Händen die LCM-Kappe aus dem QC-Bereich. Befestigen Sie anschließend die Probenextraktionsvorrichtung an der LCM-Kappe. Verwenden Sie eine Pipette, um 5,5 μl Lysepuffer auf die ausgewählte(n) Zelle(n) aufzutragen. Dies wird jetzt als Stichprobe bezeichnet.
    HINWEIS: Die Lysepufferlösung besteht aus 5 μL Resuspensionspuffer zusammen mit 0,5 μL Lyseverstärker.
  9. Befestigen Sie ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen an der Probenextraktionsvorrichtung, die an der LCM-Kappe befestigt ist. Legen Sie diese Anordnung auf eine 75 °C heiße Heizplatte, wobei die Probe und der Lysepuffer näher an der Platte liegen. Lassen Sie die Probe 15 min erhitzen.
  10. Verwenden Sie eine Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit bei 0,01-0,02 x g , um die Probe und den Lysepuffer in den Boden des 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens zu drehen. Lagern Sie die Probe bei -80 °C bis zur mikrofluidischen qPCR.

7. Führen Sie den qPCR-Chip auf einer mikrofluidischen RT-qPCR auf der Plattform aus

  1. Um die Genexpression für Einzelzellproben zu messen, führen Sie eine mRNA-Voramplifikation wie unten beschrieben durch.
    HINWEIS: Das Protokoll beinhaltet keine mRNA-Extraktion, da die Proben einzelne Zellen sind, die eine sehr geringe Menge an RNA (10 pg) enthalten, die während des mRNA-Isolierungsschritts verloren geht. Die einzelnen Zellen werden lysiert und direkt zur reversen Transkription überführt, um den Probenverlust zu minimieren.
    1. Erstellen Sie einen Primerpool, indem Sie die mRNA-qPCR-Genprimer (vorwärts und rückwärts) für jedes Gen, das untersucht wird, in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration jedes Primers 500 nM beträgt. Die Primer in diesem Beispielexperiment sind in der Zusatztabelle 116 aufgeführt.
    2. Pipettieren Sie 1 μL 5x cDNA-Reaktionsmischung in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte.
    3. Einzelzellproben kurz auftauen lassen (2-3 min), indem Sie sie aus dem -80 °C Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur ruhen lassen. Verwenden Sie eine Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit bei 0,01-0,02 x g , um die Proben für 20-30 s herunterzuschleudern. Pipettieren Sie 5,5 μL jeder Einzelzellprobe in eine andere Vertiefung in der 96-Well-PCR-Platte.
      HINWEIS: Die Probennummer und der Typ, die in jede Vertiefung gegeben werden sollen, werden vor Beginn dieses Schritts bestimmt.
    4. Die 96-Well-PCR-Platte enthält nun die cDNA-Reaktionsmischung und eine Einzelzellprobe, die jeder Vertiefung hinzugefügt wurde. Legen Sie diese Platte für 1,5 min bei 65 °C in einen Thermocycler, um die cDNA-Reaktionsmischung zu aktivieren. Der Inhalt wird mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 1.300 x g für 1 min bei 4 °C heruntergedreht und die PCR-Platte auf nasses Eis gelegt.
    5. In jede Vertiefung in der PCR-Platte pipettieren 0,12 μL T4 Gen 32 Protein, 0,73 μL DNA-Suspensionspuffer und 0,15 μL 10x cDNA-Synthese-Mastermix. Führen Sie die PCR-Platte im Thermocycler durch das folgende Protokoll: 25 °C für 5 min, 50 °C für 30 min, 55 °C für 25 min, 60 °C für 5 min, 70 °C für 10 min und ein endgültiges Halten bei 4 °C.
      HINWEIS: Das T4-Gen-32-Protein (ein einzelsträngiges DNA-bindendes (ssDNA)-Bindeprotein) ist für die Replikation und Reparatur von T4-Bakterien erforderlich. Das T4-Gen-32-Protein wurde im reversen Transkriptionsschritt des Protokolls verwendet, um die Ausbeute und Effizienz der reversen Transkription zu verbessern und die PCR-Produktausbeute zu erhöhen.
    6. In jede Vertiefung in der PCR-Platte werden 7,5 μL Taq-Polymerase-Mastermix pipettiert. Anschließend pipettieren Sie in jeder Vertiefung 1,5 μL des in Schritt 7.1.1 erstellten Primerbeckens. Führen Sie die PCR-Platte durch den folgenden linearen Vorverstärkungsschritt im Thermocycler: 95 °C für 10 min; 22 Zyklen von: 96 °C für 5 s und 60 °C für 4 min.
    7. In jede Vertiefung in der PCR-Platte pipettieren 1,2 μL Exonuklease I, 4,2 μL DNA-Suspensionspuffer und 0,6 μL 10x Exonuklease I-Reaktionspuffer. Führen Sie die PCR-Platte durch das folgende Protokoll im Thermocycler: 37 °C für 30 min, 80 °C für 15 min.
      HINWEIS: Exonuklease katalysiert die Entfernung von Nukleotiden aus linearer einzelsträngiger DNA in Richtung 3' bis 5'. Wir verwenden Exonuklease für die Probenreinigung zur Entfernung von nicht inkorporierten Primern und jeglicher einzelsträngiger cDNA, die nach der Voramplifikation vorhanden sein kann.
    8. In jede Vertiefung in der PCR-Platte pipettieren Sie 54 μL TE-Puffer. Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 1.300 x g für 5 min bei 4 °C, um den Inhalt der PCR-Platte herunterzuschleudern.
    9. Wenn Sie mit der nächsten Phase des Protokolls fortfahren möchten, kühlen Sie die PCR-Platte bei 4 °C. Wenn zwischen Abschluss der Voramplifikationsphase und Beginn der mikrofluidischen qPCR mehr als 12 Stunden liegen, decken Sie die qPCR-Platte ab und legen Sie sie in einen -20 °C Gefrierschrank.
  2. Stellen Sie die Probenplatte (neue 96-Well-PCR-Platte) für den qPCR-Chip wie unten beschrieben her.
    1. Wenn die Voramplifikations-PCR-Platte aus Schritt 7.1 in einen -20 °C Gefrierschrank gegeben wurde, entfernen und bei Raumtemperatur 10 min auftauen lassen.
    2. In eine neue 96-Well-PCR-Platte pipettieren Sie in jede Vertiefung 4,55 μL PCR-Supermix mit niedrigem Rox-Gehalt und 0,45 μL 20x DNA-bindenden Farbstoff. Dann pipettieren Sie 3 μL der voramplifizierten Probe aus der in Schritt 7.1 hergestellten PCR-Platte. Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 1.300 x g für 5 Minuten bei 4 °C, um die PCR-Platte herunterzudrehen und die PCR-Probenplatte auf Eis zu legen.
  3. Erstellen Sie eine Assay-Platte (eine neue 96-Well-PCR-Platte) für den qPCR-Chip, wie unten beschrieben.
    1. In eine neue 96-Well-PCR-Platte pipettieren Sie 1,25 μL DNA-Suspensionspuffer und 3,75 μL 2x Assay-Ladereagenz. Dann pipetten Sie den entsprechenden qPCR-Primer bei 2,5 μL 10 μM Primer. Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 1.300 x g für 5 min bei 4 °C, um die PCR-Platte abzudrehen und die PCR-Assayplatte auf Eis zu legen.
  4. Bereiten Sie den qPCR-Chip für das Laden in die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform wie unten beschrieben vor.
    HINWEIS: Der qPCR-Chip ist eine Echtzeit-qPCR-Plattform, die nach mikrofluidischen Prinzipien arbeitet. Der qPCR-Chip ist im Wesentlichen eine Matrix aus 96 Probenkanälen und 96 RNA-qPCR-Primer-Kanälen (d.h. Assays), die sich in 9.216 (96 x 96) Kammern schneiden. Eine Probe und ein spezifischer Assay werden in jeder Kammer des Arrays kombiniert, in der eine Echtzeit-qPCR-Reaktion stattfindet. Die Anzeige wird als Schwellenwertzykluswerte (Ct) und Amplifikationsdiagramme für die verwendeten Primer generiert.
    1. Injizieren Sie Steuerleitungsflüssigkeit in den qPCR-Chip zum Priming. Setzen Sie den qPCR-Chip in die mikrofluidische Mischvorrichtung ein. Wählen Sie das Prime-Skript (136x) aus und führen Sie dieses Programm aus.
    2. Wenn das Programm nach ~45 Minuten abgeschlossen ist, entfernen Sie den grundierten qPCR-Chip. In den grundierten qPCR-Chip pipettieren 6 μL der Reaktion von der PCR-Probenplatte in die entsprechende Probenvertiefung im qPCR-Chip.
    3. In den grundierten qPCR-Chip werden 6 μL der Reaktion von der PCR-Assayplatte in die entsprechende Assay-Vertiefung im qPCR-Chip pipettiert.
      HINWEIS: Am Boden der Probe und Assay-Vertiefungen im qPCR-Chip können sich Luftblasen bilden, die verhindern können, dass die Lösungen in die mikrofluidischen Leitungen gelangen. Eine scharfe Nadel kann verwendet werden, um diese Luftblasen zu knallen oder zu entfernen, bevor der qPCR-Chip in die mikrofluidische Mischvorrichtung eingeführt wird.
    4. Setzen Sie den qPCR-Chip in die mikrofluidische Mischvorrichtung ein. Wählen Sie das Lastmix-Skript (136x) aus und führen Sie dieses Programm aus.
  5. Laden Sie den qPCR-Chip in die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform.
    1. Schalten Sie die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform ein und wärmen Sie die Glühbirne auf (~20 min). Entfernen Sie den qPCR-Chip aus der mikrofluidischen Mischvorrichtung. Ziehen Sie den Schutzaufkleber von der Unterseite des qPCR-Chips ab.
    2. Öffnen Sie die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform und laden Sie den qPCR-Chip in die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform. Führen Sie das schnelle 96 x 96 PCR-Protokoll (30 Zyklen) auf der mikrofluidischen RT-qPCR-Plattform aus.
    3. Starten Sie die Datenerfassungssoftware - klicken Sie auf Neue Ausführung starten.
    4. Überprüfen Sie den Chip-Barcode und den Chip-Typ - klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie auf die Chip Run-Datei und durchsuchen Sie den Dateispeicherort für den Datenerfassungsspeicher.
    5. Klicken Sie auf Anwendungstyp und wählen Sie Genexpression; Wählen Sie ROX als passive Referenz, wählen Sie Single Probe und wählen Sie EvaGreen als Sondentyp.
    6. Klicken Sie, um das Temperaturwechselprogramm auszuwählen, und wählen Sie Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl Datei aus.

8. Datenanalyse

  1. Laden Sie Daten aus dem qPCR-Chiplauf wie unten beschrieben in die Analysesoftware für QC hoch.
    1. Laden Sie die Datenanalysesoftware herunter. Diese finden Sie auf folgender Website: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Starten Sie die Software, um das mikrofluidische RT-qPCR-Experiment zu analysieren.
    2. Öffnen Sie in der Software Chip Run. Öffnen Sie dann die Datei ChipRun.bml, die vom Test erstellt wurde. Es erscheint ein Fenster mit den experimentellen Details, einschließlich der passiven Referenz, der Sonde und des PCR-Wärmeprogramms.
      HINWEIS: Die Qualitätskontrolle (QC) und die Datenanalyse können auf dem Computer durchgeführt werden, der an die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform angeschlossen ist, oder indem die .bml-Datei über ein Flash-Laufwerk oder auf andere Weise auf einen anderen Computer übertragen wird.
  2. Definieren Sie das Beispielsetup wie unten beschrieben.
    HINWEIS: In diesem Schritt wird eine beschriftete Vorlage von Proben und Assays (qPCR-Primer) für die Qualitätskontrolle (QC) und Datenanalyseverfahren erstellt.
    1. Wählen Sie Chip Explorer > Sample Plate Setup und erstellen Sie eine neue Probenplatte. Wählen Sie den geeigneten Behältertyp und das geeignete Behälterformat (SBS96 für eine 96-Well-Platte, die in diesem repräsentativen Experiment verwendet wird).
    2. Fügen Sie die Beispielbeschriftungen gemäß dem Versuchsentwurf in die Softwaretabelle ein, und wählen Sie im Menü Task die Option Karte aus. Wählen Sie SBS96-Left.dsp aus. Das Beispielsetup ist jetzt zugeordnet. Wählen Sie Detailansicht > Analysieren , um diese Änderungen in der Datei zu aktualisieren.
      HINWEIS: Alle in dieser Software vorgenommenen Änderungen werden erst gespeichert, wenn auf die Schaltfläche Analysieren geklickt wird.
  3. Definieren Sie die Kontrollbeispiele in der Software. Markieren Sie die Zellen für die Steuerbeispiele durch Klicken mit der linken Maustaste, und halten Sie sie gedrückt, während Sie durch die Zellen ziehen, um sie auszuwählen. Einzelne Zellen können durch Gedrückthalten der Strg-Taste und Klicken auf einzelne Zellen ausgewählt werden. Geben Sie für die RNA-Standardproben (Verdünnungsreihe) den Probennamen und die verwendete RNA-Konzentration ein. Klicken Sie zum Speichern auf Analysieren .
  4. Definieren Sie den Detektoraufbau ähnlich wie in Schritt 8.2 oben, jedoch mit RT-qPCR-Assay-Namen, d.h. den Namen der untersuchten Gene. Wählen Sie Detector Plate Setup (Detektorplatten-Setup ) und erstellen Sie eine neue Assay-Platte. Wählen Sie den entsprechenden Behältertyp und das entsprechende Format (SBS96 für eine 96-Well-Platte). Fügen Sie die Assay-Namen gemäß dem experimentellen Design ein und klicken Sie auf Analysieren , um zu speichern.
  5. Beginnen Sie den Prozess der Benutzerqualitätskontrolle (QC) wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Dieses repräsentative Experiment verwendete eine Zykluszeitschwellenmethode (Ct). Das heißt, Stichproben, die ein von der Software (Auto Global) oder manuell (User Global) definiertes Schwellenwertsignal nicht erreicht haben, gelten als fehlgeschlagene Reaktionen und werden nicht in den Datensatz aufgenommen.
    1. Wählen Sie Analyseansicht > Aufgabenrahmen. Ändern Sie im Bereich der Analyseeinstellungen die Einstellungen in Auto Global (berechnet automatisch einen Schwellenwert, der auf den gesamten Chip angewendet wird) oder User Global. Setzen Sie die Basislinienkorrektur auf lineare Ableitung. Wenn User Global verwendet wird, muss der Fehlerschwellenwert wie im repräsentativen Experiment manuell ermittelt werden.
    2. Dieses repräsentative Experiment verwendete eine QC-Regel wie folgt: Wenn ein einzelner Assay oder eine einzelne Probe eine Ausfallrate von 70% oder mehr aufwies, war diese gesamte Zeile oder Spalte im Datensatz fehlgeschlagen.
    3. Überprüfen Sie jede Reaktion im 96 x 96-Chip manuell. Visualisieren Sie die Amplifikationskurven und Schmelzkurven, um festzustellen, ob jede Reaktion dem erwarteten qPCR-Muster folgt. Wenn die Verstärkungs- oder Schmelzkurve nicht mit dem übereinstimmt, was erwartet wird, schlägt diese Reaktion fehl.
  6. Exportieren Sie nach QC die Daten, indem Sie Datei > Exportieren auswählen und den Datensatz als .csv Datei speichern.
  7. Bereinigen Sie das Dataset, da die exportierte .csv Datei sowohl eine Pass-Fail-Matrix als auch eine Matrix mit unformatierten Ct-Werten aufweist. Verwenden Sie die Pass-Fail-Matrix, um fehlerhafte Zellen im Datensatz durch NA zu ersetzen.
  8. Laden Sie die aktuellste Version der Open-Source-R-Software herunter und laden Sie dann die R-Studio-Anwendung herunter. Laden Sie den normalisierten Datensatz in R hoch. Analysieren Sie die Daten entsprechend der Eignung für die Studie.
  9. Normalisieren Sie den Datensatz mit der -ΔΔCt-Methode , wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Medianzentrierung oder Housekeeping-Gennormalisierung kann über eine Probenreihe verwendet werden, um einen -ΔCt-Wert zu erzeugen. Im repräsentativen Experiment wurde die mediane Zentrierung verwendet und durch Normalisierung des Housekeeping-Gens validiert. Dies kann in .csv Format oder durch Hochladen in eine Datenanalysesoftware erfolgen.
    1. Berechnen Sie für die mediane Zentrierung den mittleren Ct-Wert, der aus allen Ct-Werten für eine einzelne Stichprobe (10-zelliger Pool) berechnet wird. Subtrahieren Sie dann alle einzelnen Ct-Werte von diesem Medianwert. Daraus ergibt sich ein -ΔCt-Wert .
    2. Für die Normalisierung des Housekeeping-Gens berechnen Sie die durchschnittliche Expression der Housekeeping-Gene (Actb, Gapdh und Ldha im repräsentativen Experiment) für jede Probe und verwenden Sie diesen Wert als den, von dem die einzelnen Ct-Werte subtrahiert werden.
    3. Um einen -ΔΔC t-Wert zu generieren, nehmen Sie den Median jeder Assay-Spalte, der nun den -ΔCt-Wert enthält. Subtrahieren Sie den Assay-Median von jedem -ΔC t-Wert, um einen -ΔΔCt-Wert zu erhalten.
  10. Berechnen Sie die Z-Werte für jeden -ΔΔCt-Wert mit der Skalierungsfunktion in R. Verwenden Sie die R-Heatmap-Funktion oder eine separate Software, um eine Heatmap zu erstellen.
  11. Verwenden Sie die Pearson-Korrelationsfunktion, um Pearson-Korrelationen zwischen den einzelnen Genen zu berechnen. Verwenden Sie die Schmelzfunktion in R, um das Dataset für andere Funktionen zu organisieren. Exportieren Sie diese Daten und laden Sie sie in eine Genkorrelationsnetzwerk-Software hoch.

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Ergebnisse

Die Validierung der Einzelzellentnahme erfolgt visuell während der LCM-Verfahren. Zellkerne werden an der QC-Station untersucht. Der Zelltyp kann durch Emission von markiertem Fluorophor für diesen Zelltyp und seine allgemeine Morphologie bestimmt werden. Wurden auf der Kappe nicht erwünschte Zellen selektiert, kann deren Erbgut mit einem UV-Laser an der QC-Station zerstört werden. Eine weitere Validierung durch molekulare Analyse ist ebenfalls erforderlich. In diesem repräsentativen Beispiel16

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Diskussion

Alkoholkonsumstörung bleibt eine herausfordernde Krankheit zu behandeln. Unsere Gruppe hat sich dieser Störung genähert, indem sie Anti-Belohnungsprozesse aus einer systemneurowissenschaftlichen Perspektive untersucht hat. Wir haben Genexpressionsveränderungen in einzelnen NTS-Neuronen und Mikroglia in einer Alkoholentzugszeitreihe16 gemessen. Das NTS wurde aufgrund seiner herausragenden Rolle bei der autonomen Dysregulation ausgewählt, die beim Alkoholentzugssyndrom auftritt. Wir kombinieren...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die hier vorgestellte Arbeit wurde durch NIH HLB U01 HL133360 für JS und RV, NIDA R21 DA036372 für JS und EVB, T32 AA-007463 für Jan Hoek zur Unterstützung von SJO'S und National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873 finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
20X DNA Binding DyeFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Loading ReagentFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AntibodyGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60EMD MilliporeMAB377Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibodyabcamab112Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR platform
Bovine Serum AntigenSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific LCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer KitThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry Antibody
Exonuclease INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Sample Extraction DeviceThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope SlidesThermoFisher Scientific22-037-246Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction TubeThermoFisher ScientificN8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Antibody
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermoFisher Scientific11754250Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 ProteinNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mLUSA Scientific1402-9700NA

Referenzen

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