Investigando Drivers de Anti-recompensa no Comportamento de Dependência com Métodos de Expressão Gênica de Célula Única Anatomicamente Específicos

Resumo

A combinação de microdissecção de captura a laser e RT-qPCR microfluídica fornece especificidade anatômica e biotécnica na medição do transcriptoma em neurônios únicos e glia. A aplicação de métodos criativos com a abordagem biológica de um sistema para doenças psiquiátricas pode levar a avanços na compreensão e tratamento, como a hipótese anti-recompensa da neuroinflamação no vício.

Resumo

O aumento das taxas de comportamento de dependência motivou pesquisadores e clínicos de saúde mental a entender a anti-recompensa e a recuperação. Essa mudança da recompensa e do início requer novas perspectivas, paradigmas e hipóteses, juntamente com uma expansão dos métodos aplicados para investigar o vício. Aqui, fornecemos um exemplo: Uma abordagem de biologia de sistemas para investigar a anti-recompensa que combina microdissecção de captura a laser (LCM) e reações quantitativas quantitativas de cadeia da polimerase por transcrição reversa microfluídica de alto rendimento (RT-qPCR). A dinâmica da rede de expressão gênica foi medida e um dos principais impulsionadores da desregulação neurovisceral na abstinência de álcool e opioides, a neuroinflamação, foi identificado. Essa combinação de tecnologias fornece especificidade anatômica e fenotípica em resolução de célula única com sensibilidade de alto rendimento e medidas específicas de expressão gênica, produzindo conjuntos de dados geradores de hipóteses e possibilidades mecanicistas que geram oportunidades para novos insights e tratamentos.

Introdução

O vício continua sendo um desafio crescente no mundo desenvolvido ^1,2. Apesar dos grandes avanços científicos e clínicos, as taxas de dependência continuam a aumentar, enquanto a eficácia dos tratamentos estabelecidos permanece estável na melhor das hipóteses ^3,4,5. No entanto, os avanços na biotecnologia e nas abordagens científicas têm levado a novos métodos e hipóteses para investigar melhor a fisiopatologia da dependência de substâncias ^6,7,8. De fato, desenvolvimentos recentes sugerem que novos conceitos e paradigmas de tratamento podem levar a avanços com consequências sociais, econômicas e políticas 9,10,11,12.

Investigamos o anti-recompensa na abstinência da dependência de álcool e opioides^13,14,15,16. Os métodos são centrais para esse paradigma^17,18. A microdissecção por captura a laser (LCM) pode selecionar células individuais com alta especificidade anatômica. Essa funcionalidade é parte integrante da hipótese anti-recompensa da neuroinflamação, pois tanto a glia quanto os neurônios podem ser coletados e analisados a partir do mesmo subnúcleo neuronal no mesmo animal 13,14,15,16,19. Uma porção relevante do transcriptoma de células selecionadas pode então ser medida com reações quantitativas de cadeia da polimerase por transcrição reversa microfluídica de alto rendimento (RT-qPCR), fornecendo conjuntos de dados de alta dimensão para análise computacional, fornecendo insights sobre redes funcionais^20,21.

Medir um subconjunto do transcriptoma em neurônios e glia em um núcleo cerebral específico gera um conjunto de dados que é robusto tanto no número de amostras quanto nos genes medidos e é sensível e específico. Essas ferramentas são ótimas para a abordagem da neurociência de um sistema para doenças psiquiátricas, pois a glia, principalmente astrócitos e micróglias, demonstraram um papel central na doença neurológica e psiquiátrica na última década^22,23. Nossa abordagem pode medir a resposta expressiva da glia e dos neurônios concomitantemente em vários receptores e ligantes envolvidos na sinalização parácrina local. De fato, a sinalização pode ser inferida a partir desses conjuntos de dados usando vários métodos quantitativos, como a lógica fuzzy²⁴. Além disso, a identificação de subfenótipos celulares em neurônios ou glia e sua função pode fornecer informações sobre como as células cerebrais em núcleos específicos organizam, respondem e desregulam no nível de célula única. A dinâmica desse sistema funcional também pode ser modelada com experimentos de séries^{temporais 16}. Por fim, os modelos animais podem ser perturbados anatomicamente ou farmacologicamente para emprestar uma condição mecanicista à abordagem desse sistema.

Experiência representativa:
Abaixo, fornecemos um exemplo da aplicação desses métodos. Este estudo investigou a expressão gênica neuronal e microglia de ratos no núcleo solitário (SNT) em resposta à dependência de álcool e subsequente abstinência¹⁶. As coortes de ratos compreenderam 1) Controle, 2) Etanol-dependente (EtOH), 3) Retirada de 8 h (Wd), 4) Wd de 32 h e 5) Wd de 176 h (Figura 1A). Após a rápida decapitação, os caules cerebrais foram separados do prosencéfalo e criosseccionados, e fatias foram coradas para neurônios e micróglia positivos para tirosina hidroxilase (TH +) (Figura 1B). O LCM foi usado para coletar neurônios TH+ e TH- e microglia. Todas as células eram do NTS e analisadas como amostras de pools de 10 células. Quatro matrizes dinâmicas microfluídicas RT-qPCR de 96 x 96 foram executadas na plataforma RT-qPCR medindo 65 genes (Figura 1B-C). Os dados foram normalizados pelo método -ΔΔC_t e analisados por R, e a seleção unicelular foi validada com marcadores moleculares (Figura 1D-E). A validação técnica foi ainda verificada por meio de repetições técnicas analisadas dentro de um único lote e entre lotes (Figura 2 e Figura 3). Neurônios TH+ e TH- organizados em diferentes subfenótipos com clusters de genes inflamatórios semelhantes, mas diferentes clusters de receptores (R) de ácido γ-aminobutírico (GABA) (Figura 4 e Figura 5). Os subfenótipos que apresentaram expressão elevada de clusters de genes inflamatórios foram super-representados em 32 h Wd, enquanto a expressão do receptor GABA (GABAR) permaneceu baixa na abstinência prolongada de álcool (176 h Wd). Este trabalho contribui para a hipótese antirecompensa da dependência de álcool e opioides, que conjectura que o feedback interceptivo das vísceras na abstinência contribui para a desregulação dos núcleos neuronais visceral-emocionais (ou seja, NTS e amígdala), resultando em sequelas autonômicas e emocionais mais graves, que contribuem para a dependência de substâncias (Figura 6).

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Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Comitê de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Thomas Jefferson University. O protocolo foi aprovado pela IACUC da Universidade Thomas Jefferson.

1. Modelo animal

1. Trigêmeos machos domésticos Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianápolis, IN, EUA) individualmente com livre acesso à mistura de etanol-ração (2 ratos) ou ração controle (1 rato).
   NOTA: Este experimento representativo empregou o protocolo de Lieber-DeCarli para estudar a neurobiologia da abstinência alcoólica^25,26. Trigêmeos de ratos consistem em uma coorte de três ratos a serem alimentados com o mesmo número de calorias, mas acabam em braços diferentes do estudo no sacrifício. Os três braços para este estudo são: 1) Controle, 2) Etanol-dependente (EtOH) e 3) Retirada (Wd) (Figura 1A). Há cinco condições totais neste estudo, pois há três pontos de tempo de abstinência alcoólica (Figura 1A).
   1. A cada dois dias, meça a mistura etanol-ração consumida pelo rato Wd e substitua a quantidade consumida pela mesma quantidade de mistura de etanol para o alimentador de ratos EtOH. Adicionar a quantidade calórica equivalente de mistura de controlo ao alimentador do rato de controlo.
      NOTA: O consumo médio diário de etanol é de cerca de 12-16 g / kg após 3 semanas²⁶.
   2. Após o consumo e dependência estáveis de etanol a longo prazo (>5 semanas), induza a abstinência aguda de álcool em ratos Wd esvaziando seu recipiente de alimentos e enchendo-o com mistura de controle. Realize isso de tal forma que todos os três ratos sejam sacrificados no mesmo ponto de tempo^{circadiano 21}.
   3. No ponto de tempo pré-escolhido, sacrifique todos os três ratos no trio no mesmo ponto de tempo (Control, EtOH e Wd).

2. Colheita da amostra

1. Colher o cérebro no mesmo ponto de tempo circadiano para cada trio de rato no ponto de tempo Wd adequado (8 h, 32 h, 176 h).
   1. Prepare um banho de metanol e gelo seco para resfriamento rápido de tecido fresco para preservar a integridade do RNA. Coloque de lado.
   2. Coloque o rato em tanque de isoflurano (5% em oxigênio) por ~30 s ou até que ocorra perda de consciência, conforme indicado pela redução da frequência respiratória e ausência de atividade motora. Coloque a cabeça do rato em uma guilhotina devidamente afiada para decapitar rapidamente.
   3. Abra o crânio do animal para dissecar o cérebro usando fórceps. Remova o cerebelo do cérebro fresco com uma navalha de mão por corte grosseiro e descarte-o. Por incisão transversal, corte o tronco cerebral do prosencéfalo.
      NOTA: Uma navalha portátil pode ser usada ainda mais para hemi-sectar o prosencéfalo ou tronco encefálico nos hemisférios esquerdo e direito de acordo com o desenho experimental. Por exemplo, para validar achados de um hemisfério com métodos diferentes, investigar a divergência esquerda-direita ou aumentar o número da amostra.
   4. Adicione a temperatura de corte ideal (O.C.T.) média a aproximadamente 3-4 cm de profundidade no molde de incorporação de tecido para que a amostra de tecido possa ser totalmente imersa. Coloque o tecido, o prosencéfalo e/ou o tronco encefálico no molde de incorporação do tecido e adicione mais OCT para cobrir totalmente a amostra de tecido.
   5. Adicione o molde de incorporação de tecido plástico contendo a amostra de tecido (prosencéfalo de rato) no banho de resfriamento de gelo seco e metanol para congelar imediatamente a amostra de tecido. Deixe a amostra de tecido no molde de incorporação permanecer no banho de resfriamento até que a coleta de tecido esteja completa, mas não por mais de 15 minutos.
      NOTA: Tenha cuidado para evitar que o metanol se derrame no recipiente de tecido.
   6. Armazene rapidamente amostras de tecido a -80 °C.
      NOTA: O RT-QPCR microfluídico mede a expressão gênica amplificando e medindo os transcritos de mRNA. Esses transcritos são relativamente instáveis, então muitas etapas são tomadas neste processo para manter a amostra o mais fria possível para evitar a degradação do mRNA.

3. Criosecção

NOTA: Os núcleos neuronais de um rato são de aproximadamente 10 μm. Assim, 10 μm é a espessura de corte ideal para este modelo animal. A espessura da fatia é ajustada de acordo com o modelo animal para o estudo.

1. Do congelador a -80 °C, retire o molde de incorporação de tecido que contém o tronco encefálico congelado e descongele a amostra a -20 °C no criostato durante 5-10 min. Efectuar este congelamento-descongelamento a -20 °C apenas uma vez para preservação do ARNm.
2. Com uma navalha de mão, corte verticalmente os cantos do molde de incorporação de plástico. Remova o tronco encefálico embutido no O.C.T. do molde de incorporação de tecido plástico. No mandril do criostato fixado a -20 °C, use o líquido O.C.T. à temperatura ambiente como cola para montar o tronco encefálico na direção rostral a caudal para criosecção coronal.
3. Corte 10 μm de criosecções coronais na direção rostral a caudal do tronco encefálico de ratos até que as seções contendo a região de interesse (NTS) sejam atingidas. A altura e a largura dessas crioseções são de ~ 200 mm com base nas dimensões do molde de incorporação de plástico.
4. Colete as criosecções de 10 μm de tecido do tronco encefálico que incluem o NTS, ou outra região de interesse com base no estudo, descongelando a montagem em lâminas de vidro simples à temperatura ambiente. Rapidamente, coloque essas lâminas com seções em uma panela de metal de resfriamento que esteja situada em cima do gelo seco. Logo que possível, coloque lâminas de vidro contendo criosecções no congelador a -80 °C para armazenamento.
   NOTA: Uma única lâmina de vidro pode caber em várias criosecções de 10 μm, pois a largura e a altura são de ~200 mm. Assim, a mesma lâmina pode conter criosecções que são coradas para tipos de células distintas.
   1. Quando várias seções estiverem no slide, certifique-se de que elas estejam separadas por 100 mm de espaço vazio. Para criar uma borda entre as criossecções, use uma caneta hidrofóbica. Isso permite que diferentes soluções de anticorpos manchem diferentes tipos de células na mesma lâmina de vidro. Mantenha 20 mm de espaço para a criossecção a partir da borda da lâmina de vidro.

4. Coloração por imunofluorescência de células únicas

1. Use o protocolo de imunofluorescência de coloração rápida em criosecções cerebrais para rotular os tipos desejados de células cerebrais (neurônios, micróglia, astrócitos, etc.) para coleta usando LCM.
   NOTA: O protocolo de coloração imuno-histoquímica usado para esses experimentos foi projetado para ser rápido para evitar o excesso de degradação de mRNA durante este processo.
   1. Do congelador a -80 °C, retire lâminas de vidro contendo criosecções de 10 μm de tronco encefálico de rato contendo NTS. Mergulhe as lâminas por 30 s em banho de etanol a 75% para fixar o tecido crioseccionado. Remova o excesso de líquido.
   2. Para o tecido fixo criosseccionado do tronco encefálico, aplique 2% de albumina sérica bovina (BSA) em solução salina tampão fosfato (PBS) por 30 s para bloquear a ligação não direcionada de anticorpos. Depois, lave com PBS.
   3. Aplique uma quantidade suficiente de solução de anticorpos primários para cobrir o tecido criosseccionado (agora fixo e bloqueado). Incubar a secção tecidual em solução de anticorpos primários durante 2 min. Lave o tecido com solução de BSA a 2% uma vez. A solução primária de anticorpos contém 96% da solução de BSA-PBS para bloqueio, 3% de anticorpos primários e 1% de inibidor de RNase. O anticorpo primário foi diluído na proporção de 1:25.
      NOTA: Neste experimento representativo, os anticorpos primários consistem em anticorpos anti-NeuN e anticorpos anti-Cd11β. Os neurônios foram subdivididos em subgrupos TH+ e TH-, de modo que as soluções primárias de anticorpos para coloração neuronal continham 93% da solução BSA PBS, 3% anticorpo anti-NeuN, 3% anticorpo anti-tirosina hidroxilase e 1% RNase Out.
   4. Aplique uma quantidade suficiente de solução de anticorpos secundários (1:200) para cobrir o tecido do tronco encefálico. Deixe a solução de anticorpos secundários banhar o tecido. Após 3 min, lave o tecido com solução de BSA a 2% uma vez.
      NOTA: A solução contendo o anticorpo secundário foi composta por 196,5 μL de BSA a 2%, 1 μL de tag fluorescente anti-rato de cabra 555 nm para o tipo de célula, 1 μL de burro anti-coelho Alexa 488 nm para coloração TH, inibidor de RNase de 2,5 μL e 1,3 μL de DAPI (1:10000).

5. Série padrão de desidratação do tecido de etanol e xileno

1. Coloque lâminas de vidro sobre as quais o tecido criosseccionado manchado repousa em um banho de etanol a 75% por 30 s, seguido de colocar em banho de etanol a 95% por 30 s, um banho de etanol a 100% por 30 s e, finalmente, um etanol a 100% por 30 s (em um segundo recipiente).
2. Depois de completar a série de desidratação de etanol, despeje dois banhos frescos de xileno 100%. Em seguida, coloque as lâminas de vidro no primeiro banho de xileno por 1 min. Retire rapidamente e coloque as lâminas no outro banho de xileno fresco por 4 minutos.
3. Tire as lâminas de vidro contendo criosecções de tecido manchadas e desidratadas de xileno e coloque em um recipiente escuro, mas ventilado, por 5 minutos para secar ao ar. Após a secagem ao ar, coloque as lâminas de vidro em um exsicador por 5 minutos para a secagem final.

6. Selecione células individuais usando microdissecção de captura a laser (LCM)

1. Insira a lâmina de vidro contendo criosecções de tecido manchado, fixo e desidratado no suporte da amostra do microscópio LCM. Use pontos de referência anatômicos para localizar a região de interesse a partir da qual a coleta de células ocorrerá (NTS neste exemplo representativo).
2. Ligue a fluorescência do microscópio e encontre o(s) tipo(s) de células coradas(ões) de interesse. Certifique-se de que o núcleo da célula desejada esteja na região de interesse e seja isolado dos núcleos de outras células a uma distância >3 mm. Identifique e marque uma célula (se o experimento for verdadeiro de célula única) ou várias células (se o experimento exigir amostras agrupadas de célula única [ou seja, escala de célula única], conforme demonstrado neste experimento representativo) para coletar usando o software LCM.
   NOTA: Amostras compostas por pools de 10 células foram utilizadas neste experimento representativo. Isso é feito para diminuir a variabilidade da expressão gênica entre as amostras e aumentar o número de células únicas analisadas, embora isso ainda permaneça um experimento em escala de célula única. Verdadeiros experimentos unicelulares podem ser completados com este método^20,27. Além disso, seções maiores de tecido também podem ser selecionadas²¹.
3. Depois que as células desejadas forem selecionadas, use o braço robótico LCM, coloque a tampa LCM na região de interesse na criossecção de tecido marcada.
4. Calibre a intensidade e a mira do laser infravermelho (IR) usando tiros de teste.
   NOTA: Isso é feito para cada amostra. A calibração deve ser realizada em uma seção da tampa que não esteja diretamente sobre o tecido, de modo a não selecionar erroneamente o tecido não experimental.
   1. Para calibrar a intensidade, ajuste a duração, a força e o tamanho do disparo a laser IR para que um tiro apenas derreta o adesivo da tampa o suficiente para selecionar um único núcleo celular e também seja forte o suficiente para derreter a tampa para a criossecção na lâmina. Esses valores serão diferentes para cada capitalização.
   2. Calibre a segmentação localizando a mira do laser precisamente onde o laser derreteu a tampa.
5. Reúna as células identificadas disparando o laser infravermelho LCM para derreter a tampa no tecido criossecado sobre essas células. Certifique-se de que apenas as células selecionadas foram retiradas da fatia de tecido usando o braço do robô para localizar a tampa na área de controle de qualidade (QC) do microscópio LCM. Para remover qualquer excesso de células na tampa, use laser ultravioleta (UV) para obliterar o material genético das células extras.
6. Registre a especificidade anatômica com a câmera do software LCM. Tire uma foto do tecido criosseccionado do qual a(s) célula(s) foi(foram) removida(s).
7. Use um atlas anatômico (um atlas do prosencéfalo de rato neste exemplo) para determinar a distância dessa fatia de tecido do bregma e registrar essa informação como a distância Z²⁸. Determine o local no plano X e/ou Y da foto para localizar totalmente a célula selecionada.
8. Com as mãos enluvadas, remova a tampa LCM da área do QC. Em seguida, prenda o dispositivo de extração de amostra à tampa do LCM. Use uma pipeta para aplicar 5,5 μL de tampão de lise à(s) célula(s) selecionada(s). Isso agora é chamado de amostra.
   NOTA: A solução tampão de lise é composta por tampão de ressuspensão de 5 μL juntamente com 0,5 μL de potenciador de lise.
9. Encaixe um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL no dispositivo de extração de amostras que está conectado à tampa do LCM. Colocar este arranjo numa placa de aquecimento a 75 °C com a amostra e o tampão de lise mais próximos da placa. Deixe a amostra aquecer por 15 min.
10. Use uma centrífuga de baixa velocidade a 0,01-0,02 x g para girar a amostra e o tampão de lise para o fundo do tubo de microcentrífuga de 0,5 mL. Conservar a amostra a -80 °C até à qPCR microfluídica.

7. Execute o chip qPCR em um RT-qPCR microfluídico na plataforma

1. Para medir a expressão gênica de amostras unicelulares, realize a pré-amplificação de RNAm, conforme descrito abaixo.
   NOTA: O protocolo não envolve a extração de mRNA, pois as amostras são células únicas contendo uma quantidade muito baixa de RNA (10 pg), que será perdida durante a etapa de isolamento do mRNA. As células individuais são lisadas e diretamente processadas para transcrição reversa para minimizar a perda da amostra.
   1. Crie um pool de iniciadores adicionando os primers do gene qPCR de mRNA (para frente e para trás) para cada gene que está sendo ensaiado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que a concentração final de cada primer é de 500 nM. Os primers neste experimento de exemplo estão listados na Tabela Suplementar 1¹⁶.
   2. Pipeta 1 μL de 5x cDNA reação misturar em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços.
   3. Deixar as amostras de célula única descongelarem brevemente (2-3 min), retirando-as do congelador a -80 °C e deixando-as sentar-se à temperatura ambiente. Use uma centrífuga de baixa velocidade em 0,01-0,02 x g para girar as amostras para baixo por 20-30 s. Pipeta 5,5 μL de cada amostra de célula única para um poço diferente na placa de PCR de 96 poços.
      Observação : O número da amostra e o tipo a ser colocado em cada poço são determinados antes de iniciar esta etapa.
   4. A placa de PCR de 96 poços agora tem a mistura de reação cDNA e uma amostra de célula única adicionada a cada poço. Colocar esta placa num termociclador durante 1,5 min a 65 °C para activar a mistura de reacção de cDNA. Girar o conteúdo utilizando centrifugação de alta velocidade a 1.300 x g durante 1 min a 4 °C e colocar a placa de PCR no gelo húmido.
   5. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 0,12 μL de proteína T4 Gene 32, 0,73 μL de tampão de suspensão de DNA e 0,15 μL de 10x cDNA síntese master mix. Executar a placa de PCR através do seguinte protocolo no termociclador: 25 °C por 5 min, 50 °C por 30 min, 55 °C por 25 min, 60 °C por 5 min, 70 °C por 10 min e uma retenção final a 4 °C.
      NOTA: A proteína T4 Gene 32 (uma proteína de ligação ao DNA de fita simples (ssDNA)) é necessária para a replicação e reparo do bacteriófago T4. A proteína T4 Gene 32 foi utilizada na etapa de transcrição reversa do protocolo para melhorar o rendimento e a eficiência da transcrição reversa e aumentar o rendimento do produto em PCR.
   6. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 7,5 μL de Taq polimerase master mix. Em seguida, em cada poço, pipeta 1,5 μL do pool de primer criado na etapa 7.1.1. Executar a placa de PCR através da seguinte etapa de pré-amplificação linear no termociclador: 95 °C durante 10 min; 22 ciclos de: 96 °C para 5 s e 60 °C para 4 min.
   7. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 1,2 μL de exonuclease I, 4,2 μL de tampão de suspensão de DNA e 0,6 μL de 10x tampão de reação exonuclease I. Executar a placa de PCR através do seguinte protocolo no termociclador: 37 °C durante 30 min, 80 °C durante 15 min.
      NOTA: A exonuclease catalisa a remoção de nucleotídeos do DNA linear de fita simples na direção de 3' a 5'. Usamos exonuclease para limpeza de amostras para a remoção de primers não incorporados e qualquer cDNA de fita simples que possa estar presente após a pré-amplificação.
   8. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 54 μL de tampão TE. Use uma centrífuga de alta velocidade a 1.300 x g por 5 minutos a 4 °C para girar o conteúdo da placa de PCR.
   9. Se planeia continuar com a próxima fase do protocolo, refrigerar a placa de PCR a 4 °C. Se houver mais de 12 h entre a conclusão da fase de pré-amplificação e o início da qPCR microfluídica, cubra a placa de qPCR e coloque-a num congelador de -20 °C.
2. Faça a placa de amostra (nova placa de PCR de 96 poços) para o chip qPCR, conforme descrito abaixo.
   1. Se a placa de PCR de pré-amplificação da etapa 7.1 foi colocada em um freezer de -20 °C, remova e deixe descongelar à temperatura ambiente por 10 min.
   2. Em uma nova placa de PCR de 96 poços, pipete para cada poço 4,55 μL de PCR supermix baixo rox e 0,45 μL de 20x corante de ligação ao DNA. Em seguida, pipetar 3 μL de amostra pré-amplificada da placa de PCR feita na etapa 7.1. Use centrifugação de alta velocidade a 1.300 x g por 5 min a 4 °C para girar a placa de PCR e colocar a placa de amostra de PCR no gelo.
3. Faça uma placa de ensaio (uma nova placa de PCR de 96 poços) para o chip qPCR, conforme descrito abaixo.
   1. Em uma nova placa de PCR de 96 poços, pipete para cada poço 1,25 μL de tampão de suspensão de DNA e 3,75 μL de reagente de carregamento de ensaio 2x. Em seguida, pipete o primer qPCR correspondente a 2,5 μL do primer de 10 μM. Use centrífuga de alta velocidade a 1.300 x g por 5 min a 4 °C para girar a placa de PCR e colocar a placa de ensaio de PCR no gelo.
4. Prepare o chip qPCR para carregamento na plataforma microfluídica RT-qPCR, conforme descrito abaixo.
   NOTA: O chip qPCR é uma plataforma qPCR em tempo real que trabalha com base em princípios microfluídicos. O chip qPCR é essencialmente uma matriz de 96 canais de amostra e 96 canais de iniciadores de qPCR de RNA (ou seja, ensaios) que se cruzam em 9.216 (96 x 96) câmaras. Uma amostra e um ensaio específico são combinados em cada câmara da matriz na qual ocorre uma reação qPCR em tempo real. A leitura é gerada como valores de ciclo limiar (Ct) e gráficos de amplificação para os primers utilizados.
   1. Injete fluido de linha de controle no chip qPCR para escorva. Insira o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script prime (136x) e execute este programa.
   2. Quando o programa estiver concluído após ~ 45 min, remova o chip qPCR preparado. No chip qPCR preparado, pipetar 6 μL da reação da placa de amostra de PCR para o poço de amostra correspondente no chip de qPCR.
   3. No chip qPCR preparado, pipeta 6 μL da reação da placa de ensaio de PCR para o poço de ensaio correspondente no chip de qPCR.
      NOTA: Bolhas de ar podem se formar na parte inferior da amostra e poços de ensaio no chip qPCR, o que pode impedir que as soluções entrem nos condutos microfluídicos. Uma agulha afiada pode ser usada para estourar ou remover essas bolhas de ar antes de inserir o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica.
   4. Insira o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script de mistura de carga (136x) e execute este programa.
5. Carregue o chip qPCR na plataforma microfluídica RT-qPCR.
   1. Ligue a plataforma microfluídica RT-qPCR e aqueça a lâmpada (~20 min). Remova o chip qPCR do dispositivo de mistura microfluídica. Descasque o adesivo protetor da parte inferior do chip qPCR.
   2. Abra a plataforma microfluídica RT-qPCR e carregue o chip qPCR na plataforma microfluídica RT-qPCR. Execute o protocolo rápido de PCR 96 x 96 (30 ciclos) na plataforma microfluídica RT-qPCR.
   3. Inicie o software de coleta de dados - clique em Iniciar uma nova execução.
   4. Verifique o código de barras do chip e o tipo de chip - clique em Avançar. Clique no arquivo Chip Run e navegue pelo local do arquivo para o armazenamento de coleta de dados.
   5. Clique em Tipo de Aplicação e selecione Expressão Gênica; selecione ROX para referência passiva, selecione Sonda única e selecione EvaGreen para o tipo de sonda.
   6. Clique para selecionar o programa de ciclo térmico e selecione Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl file.

8. Análise dos dados

1. Carregue os dados do chip qPCR executados para o software de análise para QC, conforme descrito abaixo.
   1. Baixe o software de análise de dados. Isso pode ser encontrado no seguinte site: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Inicie o software para analisar o experimento microfluídico RT-qPCR.
   2. Dentro do software, abra o Chip Run. Em seguida, abra o arquivo ChipRun.bml que foi criado pelo experimento. Uma janela aparecerá com os detalhes experimentais, incluindo a referência passiva, a sonda e o programa térmico de PCR.
      NOTA: O controle de qualidade (QC) e a análise de dados podem ser feitos no computador conectado à plataforma microfluídica RT-qPCR ou transferindo o arquivo .bml para um computador diferente por meio de uma unidade flash ou outros meios.
2. Defina a configuração de exemplo conforme descrito abaixo.
   NOTA: Esta etapa cria um modelo rotulado de amostras e ensaios (iniciadores qPCR) para os procedimentos de controle de qualidade (QC) e análise de dados.
   1. Selecione Chip Explorer > Sample Plate Setup e crie uma nova placa de amostra. Selecione o tipo de recipiente apropriado e o formato de recipiente (SBS96 para uma placa de 96 poços usada neste experimento representativo).
   2. Cole os rótulos de amostra na planilha do software de acordo com o experimento e selecione Mapa no menu Tarefa. Selecione SBS96-Left.dsp. A configuração de exemplo agora está mapeada. Selecione Exibição de detalhes > Analisar para atualizar essas alterações no arquivo.
      NOTA: Quaisquer alterações feitas neste software não serão salvas até que o botão Analisar seja clicado.
3. Defina as amostras de controle no software. Selecione as células para as amostras de controle clicando com o botão esquerdo do mouse e mantendo pressionado enquanto arrasta pelas células para seleção. As células individuais podem ser selecionadas pressionando e mantendo pressionada a tecla Ctrl e clicando em células individuais. Para as amostras padrão de ARN (séries de diluição), indicar o nome da amostra e a concentração de ARN utilizada. Clique em Analisar para salvar.
4. Defina o detector configurado de forma semelhante à etapa 8.2 acima, mas com nomes de ensaio RT-qPCR, ou seja, os nomes dos genes ensaiados. Selecione Configuração da placa do detector e crie uma nova placa de ensaio. Selecione o tipo e o formato de recipiente apropriados (SBS96 para uma placa de 96 poços). Cole os nomes dos ensaios de acordo com o experimento e clique em Analisar para salvar.
5. Inicie o processo de controle de qualidade (QC) do usuário conforme descrito abaixo.
   NOTA: Este experimento representativo usou um método de limiar de tempo de ciclo (Ct). Ou seja, as amostras que não atingiram um sinal de limite definido pelo software (Auto Global) ou manualmente (User Global) serão consideradas reações com falha e não incluídas no conjunto de dados.
   1. Selecione Modo de Exibição de Análise > Quadro de Tarefas. No painel de configurações de análise, altere as configurações para Global Automático (calcula automaticamente um limite aplicado a todo o chip) ou Global do Usuário. Defina a correção de linha de base como derivada linear. Se User Global for usado, o limite de falha deverá ser determinado manualmente, como no experimento representativo.
   2. Esse experimento representativo usou uma regra de QC da seguinte forma: se um ensaio ou amostra individual tivesse uma taxa de falha de 70% ou mais, então toda essa linha ou coluna no conjunto de dados seria reprovada.
   3. Revise manualmente cada reação no chip 96 x 96. Visualize as curvas de amplificação e as curvas de fusão para considerar se cada reação seguiu o padrão de qPCR esperado. Se a amplificação ou a curva de fusão não corresponder ao esperado, falhe essa reação.
6. Após o QC, exporte os dados selecionando Arquivo > Exportar e salve o conjunto de dados como um arquivo .csv.
7. Remova o conjunto de dados à medida que o arquivo .csv exportado tem uma matriz Pass-Fail e uma matriz com valores Ct brutos. Use a matriz Pass-Fail para substituir todas as células com falha no conjunto de dados por NA.
8. Transfira a versão mais actualizada do software R de código aberto e, em seguida, transfira a aplicação R-Studio. Carregue o conjunto de dados normalizado em R. Analise os dados conforme adequado para o estudo.
9. Normalize o conjunto de dados usando o método -ΔΔC_t , conforme descrito abaixo.
   NOTA: A centralização mediana ou a normalização do gene de limpeza podem ser usadas em uma linha de amostra para gerar um valor_t -ΔC. No experimento representativo, a mediana de centralização foi utilizada e validada pela normalização do gene housekeeping. Isso pode ser feito em formato .csv ou fazendo o upload para um software de análise de dados.
   1. Para a centralização mediana, calcule o valor mediano de Ct calculado a partir de todos os valores de Ct para uma amostra individual (pool de 10 células). Em seguida, subtraia todos os valores individuais de Ct desse valor mediano. Isso produz um valor_t -ΔC.
   2. Para a normalização do gene de limpeza, calcule a expressão média dos genes de limpeza (Actb, Gapdh e Ldha no experimento representativo) para cada amostra e use esse valor como aquele do qual subtrair os valores individuais de Ct.
   3. Para gerar um valor t -ΔΔC, tome a mediana de cada coluna de ensaio, que agora contém o valor_t -ΔC. Subtraia a mediana do ensaio de cada valor t -ΔC para produzir um valor_t -ΔΔC.
10. Calcule escores z para cada valor_t -ΔΔC usando a função de escala em R. Use a função de mapa de calor R ou um software separado para gerar um mapa de calor.
11. Use a função de correlação de Pearson para calcular as correlações de Pearson entre cada gene. Use a função de fusão em R para organizar o conjunto de dados para outras funcionalidades. Exporte esses dados e carregue-os em um software de rede de correlação gênica.

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Resultados

A validação da coleta de célula única é realizada visualmente durante os procedimentos de LCM. Os núcleos celulares são avaliados na estação QC. O tipo de célula pode ser determinado pela emissão de fluoróforo marcado para esse tipo de célula e sua morfologia geral. Se as células não desejadas tiverem sido selecionadas na tampa, seu material genético pode ser destruído com um laser UV na estação QC. É igualmente necessária uma validação adicional por análise molecular. Neste exemplo representativo...

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Discussão

O transtorno por uso de álcool continua sendo uma doença desafiadora para tratar. Nosso grupo abordou esse distúrbio investigando processos anti-recompensa com uma perspectiva de neurociência de sistemas. Medimos as alterações na expressão gênica em neurônios NTS únicos e microglia em uma série temporal de abstinência alcoólica¹⁶. O NTS foi escolhido por seu papel proeminente na desregulação autonômica que ocorre na síndrome de abstinência alcoólica. Combinamos LCM com RT-qPCR m...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody	abcam	ab112	Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit	ThermoFisher Scientific	11739010	Invitrogen
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	R37118	Seconadry Antibody
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A28180	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL	USA Scientific	1402-9700	NA