Studiare i driver dell'antiricompensa nel comportamento di dipendenza con metodi di espressione genica anatomicamente specifici a singola cellula

Riepilogo

La combinazione di microdissezione a cattura laser e RT-qPCR microfluidica fornisce specificità anatomiche e biotecniche nella misurazione del trascrittoma nei singoli neuroni e glia. L'applicazione di metodi creativi con l'approccio biologico di un sistema alle malattie psichiatriche può portare a scoperte nella comprensione e nel trattamento come l'ipotesi dell'antiricompensa della neuroinfiammazione nella dipendenza.

Abstract

L'aumento dei tassi di comportamento di dipendenza ha motivato ricercatori e medici di salute mentale a comprendere l'antiricompensa e il recupero. Questo allontanamento dalla ricompensa e dall'inizio richiede nuove prospettive, paradigmi e ipotesi insieme a un'espansione dei metodi applicati per indagare la dipendenza. Qui, forniamo un esempio: un approccio di biologia dei sistemi per studiare l'antiricompensa che combina la microdissezione a cattura laser (LCM) e le reazioni a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa microfluidica ad alto rendimento (RT-qPCR). Sono state misurate le dinamiche della rete di espressione genica ed è stato identificato un fattore chiave della disregolazione neuroviscerale nell'astinenza da alcol e oppioidi, la neuroinfiammazione. Questa combinazione di tecnologie fornisce specificità anatomica e fenotipica a risoluzione di una singola cellula con sensibilità ad alto rendimento e misure specifiche di espressione genica che producono sia set di dati che generano ipotesi che possibilità meccanicistiche che generano opportunità per nuove intuizioni e trattamenti.

Introduzione

La dipendenza rimane una sfida crescente nel mondo sviluppato ^1,2. Nonostante i grandi progressi scientifici e clinici, i tassi di dipendenza continuano ad aumentare mentre l'efficacia dei trattamenti consolidati rimane stabile nel migliore dei casi ^3,4,5. Tuttavia, i progressi nella biotecnologia e negli approcci scientifici hanno portato a nuovi metodi e ipotesi per indagare ulteriormente la fisiopatologia della dipendenza da sostanze ^6,7,8....

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni del Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Thomas Jefferson University. Il protocollo è stato approvato dalla Thomas Jefferson University IACUC.

1. Modello animale

1. Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) tre gemelli di ratto singolarmente con libero accesso a etanolo-chow (2 ratti) o miscela control-chow (1 ratto).
   NOTA: Questo esperimento rappresentativo ha impiegato il protocollo Lieber-DeCarli per studiare la neurobiologia dell'astinenza da alcol^25,26....

Risultati

La convalida della raccolta a cella singola viene eseguita visivamente durante le procedure LCM. I nuclei cellulari vengono valutati presso la stazione di controllo qualità. Il tipo di cellula può essere determinato mediante emissione di fluoroforo marcato per quel tipo di cellula e la sua morfologia generale. Se sul cappuccio sono state selezionate cellule non desiderate, il loro materiale genetico può essere distrutto con un laser UV presso la stazione di controllo qualità. È inoltre necessaria un'ulteriore conval.......

Discussione

Il disturbo da uso di alcol rimane una malattia difficile da trattare. Il nostro gruppo ha affrontato questo disturbo studiando i processi antiricompensa con una prospettiva di neuroscienza dei sistemi. Abbiamo misurato i cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni NTS e microglia in una serie temporale di astinenza^{da alcol 16}. La NTS è stata scelta per il suo ruolo di primo piano nella disregolazione autonomica che si verifica nella sindrome da astinenza da alcol. Combiniamo LCM con RT.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody	abcam	ab112	Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit	ThermoFisher Scientific	11739010	Invitrogen
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	R37118	Seconadry Antibody
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A28180	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL	USA Scientific	1402-9700	NA