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Résumé

La combinaison de la microdissection par capture laser et de la RT-qPCR microfluidique fournit une spécificité anatomique et biotechnique dans la mesure du transcriptome dans les neurones individuels et la glie. L’application de méthodes créatives avec l’approche biologique d’un système à la maladie psychiatrique peut conduire à des percées dans la compréhension et le traitement telles que l’hypothèse de la neuroinflammation antirécompense dans la dépendance.

Résumé

L’augmentation des taux de comportement de dépendance a motivé les chercheurs en santé mentale et les cliniciens à comprendre l’antirécompense et le rétablissement. Cet éloignement de la récompense et du commencement nécessite de nouvelles perspectives, paradigmes et hypothèses, ainsi qu’une expansion des méthodes appliquées pour étudier la dépendance. Ici, nous fournissons un exemple: Une approche de biologie des systèmes pour étudier l’antirécompense qui combine la microdissection par capture laser (LCM) et les réactions quantitatives en chaîne par polymérase à transcription inverse microfluidique à haut débit (RT-qPCR). La dynamique du réseau d’expression génique a été mesurée et un facteur clé de la dysrégulation neuroviscérale dans le sevrage de l’alcool et des opioïdes, la neuroinflammation, a été identifié. Cette combinaison de technologies fournit une spécificité anatomique et phénotypique à une résolution unicellulaire avec une sensibilité à haut débit et des mesures d’expression génique spécifiques produisant à la fois des ensembles de données génératrices d’hypothèses et des possibilités mécanistes qui génèrent des opportunités pour de nouvelles connaissances et de nouveaux traitements.

Introduction

La dépendance reste un défi croissant dans le monde développé 1,2. Malgré des avancées scientifiques et cliniques majeures, les taux de dépendance continuent d’augmenter tandis que l’efficacité des traitements établis reste stable aumieux3,4,5. Cependant, les progrès de la biotechnologie et des approches scientifiques ont conduit à de nouvelles méthodes et hypothèses pour étudier plus avant la physiopathologie de la dépendance aux substances 6,7,8. En effet, les développements récents suggèrent que de nouveaux concepts et paradigmes de traitement peuvent conduire à des percées avec des conséquences sociales, économiques et politiques 9,10,11,12.

Nous avons étudié l’antirécompense dans le sevrage de la dépendance à l’alcool et aux opioïdes13,14,15,16. Les méthodes sont au cœur de ce paradigme17,18. La microdissection par capture laser (LCM) peut sélectionner des cellules individuelles avec une spécificité anatomique élevée. Cette fonctionnalité fait partie intégrante de l’hypothèse antirécompense de la neuroinflammation, car la glie et les neurones peuvent être collectés et analysés à partir du même sous-noyau neuronal chez le même animal 13,14,15,16,19. Une partie pertinente du transcriptome de cellules sélectionnées peut ensuite être mesurée avec des réactions en chaîne quantitatives par polymérase à transcription inverse microfluidique à haut débit (RT-qPCR) fournissant des ensembles de données de grande dimension pour l’analyse informatique donnant des informations sur les réseaux fonctionnels20,21.

La mesure d’un sous-ensemble du transcriptome dans les neurones et la glie dans un noyau cérébral spécifique génère un ensemble de données robuste à la fois en nombre d’échantillons et en gènes mesurés, sensible et spécifique. Ces outils sont optimaux pour l’approche neuroscience d’un système à la maladie psychiatrique parce que la glie, principalement les astrocytes et la microglie, ont démontré un rôle central dans les maladies neurologiques et psychiatriques au cours de la dernière décennie22,23. Notre approche permet de mesurer la réponse expressive de la glie et des neurones de manière concomitante à travers de nombreux récepteurs et ligands impliqués dans la signalisation paracrine locale. En effet, la signalisation peut être déduite de ces ensembles de données en utilisant diverses méthodes quantitatives telles que la logique floue24. En outre, l’identification des sous-phénotypes cellulaires dans les neurones ou la glie et leur fonction peut fournir un aperçu de la façon dont les cellules cérébrales dans des noyaux spécifiques s’organisent, répondent et dérégulent au niveau de la cellule unique. La dynamique de ce système fonctionnel peut également être modélisée à l’aide d’expériences de séries chronologiques16. Enfin, les modèles animaux peuvent être perturbés anatomiquement ou pharmacologiquement pour donner une condition mécaniste à l’approche de ce système.

Expérience représentative :
Ci-dessous, nous fournissons un exemple de l’application de ces méthodes. Cette étude a examiné l’expression des gènes neuronaux et microgliaux du rat dans le noyau solitaire (SNT) en réponse à la dépendance à l’alcool et au sevrage subséquent16. Les cohortes de rats comprenaient 1) le groupe témoin, 2) l’éthanol-dépendant (EtOH), 3) le retrait de 8 h (Wd), 4) 32 h Wd et 5) 176 h Wd (figure 1A). Après une décapitation rapide, les troncs cérébraux ont été séparés du cerveau antérieur et cryosectionnés, et des tranches ont été colorées pour les neurones tyrosine hydroxylase positive (TH +) et la microglie (Figure 1B). La LCM a été utilisée pour collecter à la fois les neurones TH+ et TH- et la microglie. Toutes les cellules provenaient du SNRC et ont été analysées comme des échantillons de pools de 10 cellules. Quatre réseaux dynamiques RT-qPCR microfluidiques de 96 x 96 ont été exécutés sur la plateforme RT-qPCR mesurant 65 gènes (Figure 1B-C). Les données ont été normalisées à l’aide d’une méthode -ΔΔCt et analysées à l’aide de R, et la sélection d’une cellule unique a été validée avec des marqueurs moléculaires (Figure 1D-E). La validation technique a ensuite été vérifiée par des répliques techniques analysées au sein d’un seul lot et entre les lots (figure 2 et figure 3). Les neurones TH+ et TH- sont organisés en différents sous-phénotypes avec des groupes de gènes inflammatoires similaires, mais des groupes de récepteurs (R) de l’acide γ-aminobutyrique (GABA) différents (Figure 4 et Figure 5). Les sous-phénotypes qui avaient une expression élevée des groupes de gènes inflammatoires étaient surreprésentés à 32 h Wd, tandis que l’expression du récepteur GABA (GABAR) restait faible dans le sevrage prolongé de l’alcool (176 h Wd). Ces travaux contribuent à l’hypothèse antirécompense de la dépendance à l’alcool et aux opioïdes qui conjecture que la rétroaction interceptive des viscères en sevrage contribue à la dérégulation des noyaux neuronaux viscéraux-émotionnels (c.-à-d. SNT et amygdale) entraînant des séquelles autonomes et émotionnelles plus graves, qui contribuent à la dépendance aux substances (Figure 6).

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Protocole

Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations de l’Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Thomas Jefferson. Le protocole a été approuvé par l’IACUC de l’Université Thomas Jefferson.

1. Modèle animal

  1. Mâle domestique Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) triplés de rats individuellement avec libre accès à l’éthanol-chow (2 rats) ou au mélange témoin-chow (1 rat).
    NOTE: Cette expérience représentative a utilisé le protocole Lieber-DeCarli pour étudier la neurobiologie du sevrage alcoolique25,26. Les triplés de rats se composent d’une cohorte de trois rats pour être nourris avec le même nombre de calories, mais se retrouvent dans différents bras de l’étude au sacrifice. Les trois volets de cette étude sont : 1) le contrôle, 2) l’éthanol-dépendant (EtOH) et 3) le retrait (Wd) (figure 1A). Il y a cinq conditions totales dans cette étude, car il y a trois points de temps de sevrage alcoolique (figure 1A).
    1. Tous les deux jours, mesurer le mélange éthanol-chow consommé par le rat Wd et remplacer la quantité consommée par la même quantité de mélange d’éthanol dans la mangeoire à rats EtOH. Ajouter la quantité calorique équivalente du mélange témoin à la mangeoire du rat témoin.
      NOTE: La consommation quotidienne moyenne d’éthanol est d’environ 12-16 g / kg après 3 semaines26.
    2. Après une consommation stable à long terme d’éthanol et une dépendance (>5 semaines), induire un sevrage alcoolique aigu chez le rat Wd en vidant son contenant alimentaire et en le remplissant de mélange témoin. Effectuez cela de manière à ce que les trois rats soient sacrifiés au même point temporel circadien21.
    3. Au point temporel préchoisi, sacrifiez les trois rats du triplet au même moment (contrôle, EtOH et Wd).

2. Prélèvement d’échantillons

  1. Récolter le cerveau au même point de temps circadien pour chaque triplet de rat au point de temps Wd approprié (8 h, 32 h, 176 h).
    1. Préparez un bain de méthanol et de glace sèche pour un refroidissement rapide des tissus frais afin de préserver l’intégrité de l’ARN. Mettez de côté.
    2. Mettez le rat dans un réservoir d’isoflurane (5% d’oxygène) pendant ~30 s ou jusqu’à ce que la perte de conscience se produise, comme indiqué par la fréquence respiratoire réduite et l’absence d’activité motrice. Mettez la tête de rat dans une guillotine correctement aiguisée pour la décapiter rapidement.
    3. Ouvrez le crâne de l’animal pour disséquer le cerveau à l’aide de forceps. Retirez le cervelet du cerveau frais avec un rasoir à main en le tranchant grossier et jetez-le. Par incision transversale, trancher le tronc cérébral du cerveau antérieur.
      REMARQUE: Un rasoir portatif peut être utilisé pour hémi-secter le cerveau antérieur ou le tronc cérébral dans les hémisphères gauche et droit selon la conception expérimentale. Par exemple, pour valider les résultats d’un hémisphère avec différentes méthodes, étudier la divergence gauche-droite ou augmenter le nombre d’échantillons.
    4. Ajouter la température de coupe optimale (O.C.T.) moyenne à environ 3-4 cm de profondeur dans le moule d’enrobage du tissu afin que l’échantillon de tissu puisse être complètement immergé. Placez le tissu, le cerveau antérieur et/ou le tronc cérébral dans le moule d’incorporation tissulaire et ajoutez plus d’O.C.T. pour couvrir complètement l’échantillon de tissu.
    5. Ajouter le moule d’incorporation de tissu plastique contenant l’échantillon de tissu (cerveau antérieur du rat) dans le bain de refroidissement de glace sèche et de méthanol pour congeler immédiatement l’échantillon de tissu. Laisser l’échantillon de tissu dans le moule d’enrobage rester dans le bain de refroidissement jusqu’à ce que la collecte de tissu soit terminée, mais pas plus de 15 minutes.
      REMARQUE: Veillez à éviter que du méthanol ne se répande dans le contenant de tissu.
    6. Conserver rapidement les échantillons de tissus à -80 °C.
      REMARQUE: La RT-qPCR microfluidique mesure l’expression des gènes en amplifiant et en mesurant les transcrits d’ARNm. Ces transcrits sont relativement instables, de sorte que de nombreuses étapes sont prises dans ce processus pour garder l’échantillon aussi froid que possible afin d’empêcher la dégradation de l’ARNm.

3. Cryosectionnement

REMARQUE: Un noyau neuronal de rat mesure environ 10 μm. Ainsi, 10 μm est l’épaisseur de tranche optimale pour ce modèle animal. L’épaisseur de la tranche est ajustée en fonction du modèle animal pour l’étude.

  1. Du congélateur à -80 °C, retirer le moule d’enrobage tissulaire contenant le tronc cérébral congelé et décongeler l’échantillon à -20 °C dans un cryostat pendant 5 à 10 min. Effectuer ce gel-décongélation à -20 °C une seule fois pour la préservation de l’ARNm.
  2. Avec un rasoir à main, coupez verticalement les coins du moule d’enrobage en plastique. Retirez le tronc cérébral incorporé dans O.C.T. du moule d’incorporation de tissu plastique. Sur le mandrin du cryostat réglé à -20 °C, utiliser du liquide O.C.T. à température ambiante comme colle pour monter le tronc cérébral dans la direction rostrale à caudale pour la cryosection coronale.
  3. Couper des cryosections coronales de 10 μm dans le sens rostral à caudale du tronc cérébral du rat jusqu’à ce que les sections contenant la région d’intérêt (SNT) soient atteintes. La hauteur et la largeur de ces cryosections sont de ~200 mm basées sur les dimensions du moule d’enrobage en plastique.
  4. Prélever les cryosections de 10 μm de tissu du tronc cérébral qui comprennent le SNT, ou une autre région d’intérêt basée sur l’étude, en les décongelant sur des lames de verre ordinaire à température ambiante. Rapidement, placez ces lames avec des sections dans un bac métallique de refroidissement situé sur de la glace sèche. Dès que possible, placer les lames de verre contenant des cryosections dans un congélateur à -80 °C pour les conserver.
    REMARQUE: Une seule lame de verre peut s’adapter à plusieurs cryosections de 10 μm car la largeur et la hauteur sont de ~ 200 mm. Ainsi, la même lame peut contenir des cryosections qui sont colorées pour des types de cellules distincts.
    1. Lorsque plusieurs sections sont sur la glissière, assurez-vous qu’elles sont séparées par 100 mm d’espace vide. Pour créer une bordure entre les cryosections, utilisez un stylo hydrophobe. Cela permet d’obtenir différentes solutions d’anticorps pour colorer différents types de cellules sur la même lame de verre. Maintenez 20 mm d’espace pour la cryosection à partir du bord de la lame de verre.

4. Coloration par immunofluorescence de cellules individuelles

  1. Utiliser un protocole d’immunofluorescence de coloration rapide sur les cryosections cérébrales pour étiqueter les types de cellules cérébrales souhaités (neurones, microglies, astrocytes, etc.) pour la collecte à l’aide de LCM.
    REMARQUE: Le protocole de coloration immunohistochimique utilisé pour ces expériences a été conçu pour être rapide afin de prévenir la dégradation excessive de l’ARNm au cours de ce processus.
    1. Du congélateur à -80 °C, sortez les lames de verre contenant des cryosections de 10 μm de tronc cérébral de rat contenant des SNT. Trempez les glissements pendant 30 s dans un bain d’éthanol à 75 % pour fixer le tissu cryosectionné. Enlevez l’excès de liquide.
    2. Sur le tissu fixe du tronc cérébral cryosectionné, appliquer 2% d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution saline tampon phosphate (PBS) pendant 30 s pour bloquer la liaison non ciblée des anticorps. Ensuite, lavez avec PBS.
    3. Appliquer une quantité suffisante de solution d’anticorps primaires pour couvrir le tissu cryosectionné (maintenant fixé et bloqué). Incuber la section tissulaire dans une solution d’anticorps primaires pendant 2 min. Laver le mouchoir avec une solution de BSA à 2% une fois. La solution d’anticorps primaires contient 96% de la solution BSA-PBS pour le blocage, 3% d’anticorps primaires et 1% d’inhibiteur de RNase. L’anticorps primaire a été dilué dans un rapport de 1:25.
      REMARQUE: Dans cette expérience représentative, les anticorps primaires sont constitués d’anticorps anti-NeuN et d’anticorps anti-Cd11β. Les neurones ont ensuite été subdivisés en sous-groupes TH + et TH-, de sorte que les solutions d’anticorps primaires pour la coloration neuronale contenaient 93% de la solution PBS BSA, 3% d’anticorps anti-NeuN, 3% d’anticorps anti-tyrosine hydroxylase et 1% de RNase Out.
    4. Appliquez une quantité suffisante de solution d’anticorps secondaire (1:200) pour couvrir le tissu du tronc cérébral. Laissez la solution d’anticorps secondaire baigner le tissu. Après 3 min, laver le mouchoir avec une solution de BSA à 2% une fois.
      REMARQUE: La solution contenant l’anticorps secondaire était composée de 196,5 μL de BSA à 2%, 1 μL de marqueur fluorescent anti-souris de chèvre de 555 nm pour le type cellulaire, 1 μL d’âne anti-lapin Alexa 488 nm pour la coloration TH, 2,5 μL d’inhibiteur de RNase et 1,3 μL de DAPI (1:10000).

5. Série standard de déshydratation tissulaire à l’éthanol et au xylène

  1. Placez les lames de verre sur lesquelles repose le tissu cryosectionné coloré dans un bain d’éthanol à 75% pendant 30 s, puis placez dans un bain d’éthanol à 95% pendant 30 s, un bain d’éthanol à 100% pendant 30 s et enfin un bain d’éthanol à 100% pendant 30 s (dans un deuxième récipient).
  2. Après avoir terminé la série de déshydratation à l’éthanol, versez deux bains frais 100% xylène. Ensuite, placez les lames de verre dans le premier bain de xylène pendant 1 min. Retirer rapidement et placer les lames dans l’autre bain de xylène frais pendant 4 min.
  3. Retirer du xylène les lames de verre contenant des cryosections de tissus tachés et déshydratés et les placer dans un récipient sombre mais ventilé pendant 5 minutes pour les faire sécher à l’air. Après séchage à l’air, placer les lames de verre dans un dessiccateur pendant 5 minutes pour le séchage final.

6. Sélectionnez des cellules individuelles à l’aide de la microdissection par capture laser (LCM)

  1. Insérez une lame de verre contenant des cryosections de tissus tachés, fixes et déshydratés dans le porte-échantillon du microscope LCM. Utilisez des repères anatomiques pour localiser la région d’intérêt à partir de laquelle la collecte de cellules aura lieu (SNRC dans cet exemple représentatif).
  2. Activez la fluorescence du microscope et trouvez le(s) type(s) de cellules colorées d’intérêt. Assurez-vous que le noyau de la cellule désirée se trouve dans la région d’intérêt et est isolé des noyaux des autres cellules par une distance de >3 mm. Identifier et marquer une cellule (si l’expérience est une vraie cellule unique) ou plusieurs cellules (si l’expérience nécessite des échantillons unicellulaires regroupés [c.-à-d. à l’échelle d’une seule cellule] comme démontré dans cette expérience représentative) à collecter à l’aide du logiciel LCM.
    NOTE: Des échantillons composés de pools de 10 cellules ont été utilisés dans cette expérience représentative. Ceci est fait pour diminuer la variabilité de l’expression génique entre les échantillons et augmenter le nombre de cellules individuelles analysées, bien que cela reste encore une expérience à l’échelle d’une seule cellule. De véritables expériences unicellulaires peuvent être complétées avec cette méthode20,27. De plus, des sections de tissus plus grandes peuvent également être sélectionnées21.
  3. Une fois les cellules souhaitées sélectionnées, utilisez le bras du robot LCM, placez le capuchon LCM sur la région d’intérêt sur la cryosection tissulaire marquée.
  4. Calibrez l’intensité et le ciblage du laser infrarouge (IR) à l’aide de tirs d’essai.
    REMARQUE: Ceci est fait pour chaque échantillon. L’étalonnage doit être effectué sur une section du capuchon qui n’est pas directement au-dessus du tissu afin de ne pas sélectionner par erreur un tissu non expérimental.
    1. Pour calibrer l’intensité, ajustez la durée, la force et la taille de la prise de vue laser IR de sorte qu’une prise de vue ne fasse fondre que suffisamment l’adhésif du capuchon pour sélectionner un seul noyau cellulaire et soit également assez forte pour faire fondre le capuchon à la cryosection sur la lame. Ces valeurs seront différentes pour chaque plafond.
    2. Calibrez le ciblage en localisant le réticule laser précisément à l’endroit où le laser a fait fondre le capuchon.
  5. Rassemblez les cellules identifiées en tirant le laser infrarouge LCM pour faire fondre le capuchon sur le tissu cryosectionné sur ces cellules. Assurez-vous que seules les cellules sélectionnées ont été retirées de la tranche de tissu en utilisant le bras du robot pour localiser le capuchon dans la zone de contrôle de la qualité (CQ) du microscope LCM. Pour éliminer tout excès de cellules sur le capuchon, utilisez un laser ultraviolet (UV) pour effacer le matériel génétique des cellules supplémentaires.
  6. Enregistrez la spécificité anatomique avec la caméra du logiciel LCM. Prenez une photo du tissu cryosectionné dont la ou les cellules ont été retirées.
  7. Utilisez un atlas anatomique (un atlas du cerveau antérieur du rat dans cet exemple) pour déterminer la distance de cette tranche de tissu par rapport au bregma et notez cette information comme la distance Z28. Déterminez l’emplacement dans le plan X et/ou Y à partir de la photo pour localiser complètement la cellule sélectionnée.
  8. Avec des mains gantées, retirez le capuchon LCM de la zone QC. Ensuite, fixez le dispositif d’extraction d’échantillon au capuchon LCM. Utilisez une pipette pour appliquer 5,5 μL de tampon de lyse sur la ou les cellules sélectionnées. C’est ce qu’on appelle maintenant l’échantillon.
    REMARQUE: La solution tampon de lyse est composée d’un tampon de remise en suspension de 5 μL et de 0,5 μL d’amplificateur de lyse.
  9. Installez un tube microcentrifuge de 0,5 mL sur le dispositif d’extraction d’échantillon fixé au bouchon LCM. Placer cette disposition sur une plaque chauffante à 75 °C avec l’échantillon et le tampon de lyse plus près de la plaque. Laisser chauffer l’échantillon pendant 15 min.
  10. Utilisez une centrifugeuse à basse vitesse à 0,01-0,02 x g pour faire tourner l’échantillon et le tampon de lyse vers le bas du tube de microcentrifugation de 0,5 mL. Conserver l’échantillon à -80 °C jusqu’à la qPCR microfluidique.

7. Exécutez la puce qPCR sur une RT-qPCR microfluidique sur la plate-forme

  1. Pour mesurer l’expression génique d’échantillons de cellules uniques, effectuez une préamplification de l’ARNm comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE: Le protocole n’implique pas l’extraction d’ARNm car les échantillons sont des cellules uniques contenant une très faible quantité d’ARN (10 pg), qui sera perdue lors de l’étape d’isolement de l’ARNm. Les cellules individuelles sont lysées et directement procédées à la transcription inverse afin de minimiser la perte de l’échantillon.
    1. Créez un pool d’amorces en ajoutant les amorces du gène qPCR de l’ARNm (avant et arrière) pour chaque gène dosé dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. S’assurer que la concentration finale de chaque amorce est de 500 nM. Les amorces de cet exemple d’expérience sont énumérées dans le tableau supplémentaire 116.
    2. Pipeter 1 μL de mélange réactionnel d’ADNc 5x dans chaque puits d’une plaque PCR à 96 puits.
    3. Laisser décongeler brièvement les échantillons unicellulaires (2-3 min) en les retirant du congélateur à -80 °C et en les laissant reposer à température ambiante. Utilisez une centrifugeuse à basse vitesse à 0,01-0,02 x g pour faire tourner les échantillons pendant 20-30 s. Pipeter 5,5 μL de chaque échantillon unicellulaire vers un puits différent dans la plaque PCR à 96 puits.
      REMARQUE : Le numéro et le type d’échantillon à placer dans chaque puits sont déterminés avant de commencer cette étape.
    4. La plaque PCR à 96 puits contient maintenant le mélange réactionnel d’ADNc et un échantillon unicellulaire ajouté à chaque puits. Placez cette plaque dans un thermocycleur pendant 1,5 min à 65 °C pour activer le mélange réactionnel d’ADNc. Faire tourner le contenu à l’aide d’une centrifugation à grande vitesse à 1 300 x g pendant 1 min à 4 °C et placer la plaque de PCR sur de la glace humide.
    5. Dans chaque puits de la plaque PCR, pipeter 0,12 μL de protéine T4 Gene 32, 0,73 μL de tampon de suspension d’ADN et 0,15 μL de mélange maître de synthèse d’ADNc 10x. Faites passer la plaque PCR par le protocole suivant dans le thermocycleur : 25 °C pendant 5 min, 50 °C pendant 30 min, 55 °C pendant 25 min, 60 °C pendant 5 min, 70 °C pendant 10 min, et un maintien final à 4 °C.
      REMARQUE : La protéine T4 Gene 32 (une protéine de liaison à l’ADN simple brin (ssDNA)) est nécessaire pour la réplication et la réparation du bactériophage T4. La protéine T4 Gene 32 a été utilisée dans l’étape de transcription inverse du protocole pour améliorer le rendement et l’efficacité de la transcription inverse et augmenter le rendement du produit PCR.
    6. Dans chaque puits de la plaque PCR, pipeter 7,5 μL de mélange maître de polymérase Taq. Ensuite, dans chaque puits, pipeter 1,5 μL du pool d’amorces créé à l’étape 7.1.1. Faire passer la plaque PCR par l’étape de préamplification linéaire suivante dans le thermocycleur : 95 °C pendant 10 min ; 22 cycles de: 96 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 4 min.
    7. Dans chaque puits de la plaque PCR, pipeter 1,2 μL d’exonucléase I, 4,2 μL de tampon de suspension d’ADN et 0,6 μL de tampon de réaction exonucléase I 10x. Faites passer la plaque PCR selon le protocole suivant dans le thermocycleur : 37 °C pendant 30 min, 80 °C pendant 15 min.
      NOTE: L’exonucléase catalyse l’élimination des nucléotides de l’ADN simple brin linéaire dans la direction 3' à 5'. Nous utilisons l’exonucléase pour le nettoyage des échantillons afin d’éliminer les amorces non incorporées et tout ADNc simple brin qui pourrait être présent après la préamplification.
    8. Dans chaque puits de la plaque PCR, pipeter 54 μL de tampon TE. Utiliser une centrifugeuse à grande vitesse à 1 300 x g pendant 5 min à 4 °C pour faire tourner le contenu de la plaque PCR.
    9. Si vous prévoyez de poursuivre la phase suivante du protocole, réfrigérez la plaque de PCR à 4 °C. S’il s’écoule plus de 12 heures entre la fin de la phase de préamplification et le début de la qPCR microfluidique, couvrir la plaque de qPCR et la placer dans un congélateur à -20 °C.
  2. Fabriquez la plaque d’échantillon (nouvelle plaque PCR à 96 puits) pour la puce qPCR comme décrit ci-dessous.
    1. Si la plaque de PCR de préamplification de l’étape 7.1 a été placée dans un congélateur à -20 °C, retirer et laisser décongeler à température ambiante pendant 10 min.
    2. Dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits, pipeter dans chaque puits 4,55 μL de PCR supermix low rox et 0,45 μL de colorant de liaison à l’ADN 20x. Ensuite, pipeter 3 μL d’échantillon préamplifié de la plaque PCR réalisée à l’étape 7.1. Utilisez une centrifugation à grande vitesse à 1 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C pour faire tourner la plaque PCR et placer la plaque d’échantillon PCR sur de la glace.
  3. Fabriquez une plaque de dosage (une nouvelle plaque PCR à 96 puits) pour la puce qPCR comme décrit ci-dessous.
    1. Dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits, pipeter dans chaque puits 1,25 μL de tampon de suspension d’ADN et 3,75 μL de réactif de charge de dosage 2x. Ensuite, pipeter l’amorce qPCR correspondante à 2,5 μL d’amorce 10 μM. Utilisez une centrifugeuse à grande vitesse à 1 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C pour faire tourner la plaque de PCR vers le bas et placer la plaque d’essai PCR sur la glace.
  4. Préparez la puce qPCR pour le chargement dans la plate-forme microfluidique RT-qPCR comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE: La puce qPCR est une plate-forme qPCR en temps réel qui fonctionne sur des principes microfluidiques. La puce qPCR est essentiellement une matrice de 96 canaux d’échantillonnage et de 96 canaux d’amorce qPCR d’ARN (c’est-à-dire des essais) qui se croisent dans 9 216 (96 x 96) chambres. Un échantillon et un test spécifique sont combinés dans chaque chambre du réseau dans laquelle une réaction qPCR en temps réel se produit. La lecture est générée sous forme de valeurs de cycle seuil (Ct) et de graphiques d’amplification pour les amorces utilisées.
    1. Injectez le fluide de la ligne de contrôle dans la puce qPCR pour l’amorçage. Insérez la puce qPCR dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script prime (136x) et exécutez ce programme.
    2. Lorsque le programme est terminé après ~45 min, retirez la puce qPCR amorcée. Dans la puce qPCR amorcée, pipeter 6 μL de la réaction de la plaque d’échantillonnage PCR dans le puits d’échantillon correspondant dans la puce qPCR.
    3. Dans la puce qPCR amorcée, pipeter 6 μL de la réaction de la plaque d’essai PCR dans le puits de dosage correspondant dans la puce qPCR.
      REMARQUE: Des bulles d’air peuvent se former au fond de l’échantillon et des puits de dosage dans la puce qPCR, ce qui peut empêcher les solutions de pénétrer dans les conduits microfluidiques. Une aiguille tranchante peut être utilisée pour faire éclater ou éliminer ces bulles d’air avant d’insérer la puce qPCR dans le dispositif de mélange microfluidique.
    4. Insérez la puce qPCR dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script de mélange de charges (136x) et exécutez ce programme.
  5. Chargez la puce qPCR dans la plateforme microfluidique RT-qPCR.
    1. Allumez la plateforme microfluidique RT-qPCR et réchauffez l’ampoule (~20 min). Retirez la puce qPCR du dispositif de mélange microfluidique. Décollez l’autocollant de protection du bas de la puce qPCR.
    2. Ouvrez la plateforme microfluidique RT-qPCR et chargez la puce qPCR dans la plateforme microfluidique RT-qPCR. Exécutez le protocole PCR rapide 96 x 96 (30 cycles) sur la plate-forme microfluidique RT-qPCR.
    3. Lancez le logiciel de collecte de données - cliquez sur Démarrer une nouvelle exécution.
    4. Vérifiez le code-barres de la puce et le type de puce - cliquez sur Suivant. Cliquez sur le fichier Chip Run et parcourez l’emplacement du fichier pour le stockage de la collecte de données.
    5. Cliquez sur Type d’application et sélectionnez Expression génique; sélectionnez ROX pour référence passive, sélectionnez Sonde unique et sélectionnez EvaGreen pour le type de sonde.
    6. Cliquez pour sélectionner le programme de cyclage thermique et sélectionnez Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl file.

8. Analyse des données

  1. Téléchargez les données de la puce qPCR exécutée vers le logiciel d’analyse pour le contrôle qualité comme décrit ci-dessous.
    1. Téléchargez le logiciel d’analyse de données. Cela peut être trouvé sur le site Web suivant: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Lancez le logiciel pour analyser l’expérience microfluidique RT-qPCR.
    2. Dans le logiciel, ouvrez Chip Run. Ensuite, ouvrez le fichier ChipRun.bml qui a été créé par l’expérience. Une fenêtre apparaîtra avec les détails expérimentaux, y compris la référence passive, la sonde et le programme thermique PCR.
      REMARQUE: Le contrôle de la qualité (CQ) et l’analyse des données peuvent être effectués sur l’ordinateur connecté à la plate-forme microfluidique RT-qPCR ou en transférant le fichier .bml vers un autre ordinateur via un lecteur flash ou d’autres moyens.
  2. Définissez l’exemple de configuration comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Cette étape crée un modèle étiqueté d’échantillons et de tests (amorces qPCR) pour les procédures de contrôle de la qualité (CQ) et d’analyse des données.
    1. Sélectionnez Chip Explorer > Sample Plate Setup (Configuration de la plaque d’échantillonnage) et créez une nouvelle plaque d’échantillonnage. Sélectionnez le type de conteneur et le format de conteneur appropriés (SBS96 pour une plaque de 96 puits utilisée dans cette expérience représentative).
    2. Collez les exemples d’étiquettes dans la feuille de calcul du logiciel conformément à la conception expérimentale et sélectionnez Carte dans le menu Tâche. Sélectionnez SBS96-Left.dsp. L’exemple de configuration est maintenant mappé. Sélectionnez Affichage détaillé > Analyser pour mettre à jour ces modifications dans le fichier.
      REMARQUE: Toutes les modifications apportées à ce logiciel ne seront pas enregistrées tant que vous n’aurez pas cliqué sur le bouton Analyser .
  3. Définissez les échantillons de contrôle dans le logiciel. Sélectionnez les cellules pour les échantillons de contrôle par clic gauche et maintenez-les enfoncés tout en faisant glisser les cellules à sélectionner. Les cellules individuelles peuvent être sélectionnées en maintenant la touche Ctrl enfoncée et en cliquant sur des cellules individuelles. Pour les échantillons étalons d’ARN (série de dilution), entrez le nom de l’échantillon et la concentration d’ARN utilisée. Cliquez sur Analyser pour enregistrer.
  4. Définir la configuration du détecteur similaire à l’étape 8.2 ci-dessus, mais avec des noms de test RT-qPCR, c’est-à-dire les noms des gènes testés. Sélectionnez Detector Plate Setup (Configuration de la plaque détectrice ) et créez une nouvelle plaque d’essai. Sélectionnez le type et le format de conteneur appropriés (SBS96 pour une plaque de 96 puits). Collez les noms des tests selon la conception expérimentale et cliquez sur Analyser pour enregistrer.
  5. Commencez le processus de contrôle de la qualité de l’utilisateur (CQ) comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Cette expérience représentative a utilisé une méthode de seuillage du temps de cycle (Ct). Autrement dit, les échantillons qui n’ont pas atteint un signal seuil défini par le logiciel (Auto Global) ou manuellement (User Global) seront considérés comme des réactions échouées et ne seront pas inclus dans l’ensemble de données.
    1. Sélectionnez Analysis View > Task Frame. Dans le volet des paramètres d’analyse, définissez les paramètres sur Auto Global (calcule automatiquement un seuil appliqué à l’ensemble de la puce) ou User Global. Définissez la correction de ligne de base sur la dérivée linéaire. Si l’utilisateur global est utilisé, le seuil d’échec doit être déterminé manuellement comme dans l’expérience représentative.
    2. Cette expérience représentative a utilisé une règle de CQ comme suit : si un test ou un échantillon individuel avait un taux d’échec de 70 % ou plus, alors cette ligne ou colonne entière de l’ensemble de données a échoué.
    3. Examinez manuellement chaque réaction dans la puce 96 x 96. Visualisez les courbes d’amplification et les courbes de fusion pour déterminer si chaque réaction a suivi le modèle qPCR attendu. Si la courbe d’amplification ou de fusion ne correspond pas à ce qui est attendu, échouez cette réaction.
  6. Après QC, exportez les données en sélectionnant Fichier > Exporter et enregistrez le jeu de données en tant que fichier .csv.
  7. Élaguez le jeu de données car le fichier .csv exporté possède à la fois une matrice Pass-Fail et une matrice avec des valeurs Ct brutes. Utilisez la matrice Pass-Fail pour remplacer les cellules défaillantes de l’ensemble de données par NA.
  8. Téléchargez la version la plus récente du logiciel open source R, puis téléchargez l’application R-Studio. Téléchargez l’ensemble de données normalisé dans R. Analysez les données en fonction de l’étude.
  9. Normalisez le jeu de données à l’aide de la méthode -ΔΔCt comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Le centrage médian ou la normalisation du gène d’entretien interne peuvent être utilisés sur une rangée d’échantillons pour générer une valeur -ΔCt . Dans l’expérience représentative, le centrage médian a été utilisé et validé par la normalisation des gènes de gestion. Cela peut être fait dans .csv format ou en téléchargeant dans un logiciel d’analyse de données.
    1. Pour le centrage médian, calculez la valeur médiane Ct calculée à partir de toutes les valeurs Ct pour un échantillon individuel (pool à 10 cellules). Ensuite, soustrayez toutes les valeurs Ct individuelles de cette valeur médiane. Cela donne une valeur -ΔCt .
    2. Pour la normalisation des gènes d’entretien ménager, calculez l’expression moyenne des gènes d’entretien ménager (Actb, Gapdh et Ldha dans l’expérience représentative) pour chaque échantillon et utilisez cette valeur comme celle à partir de laquelle soustraire les valeurs Ct individuelles.
    3. Pour générer une valeurt -ΔΔC, prenez la médiane de chaque colonne d’essai, qui contient maintenant la valeur -ΔCt. Soustrayez la médiane de chaque valeur -ΔC t pour obtenir une valeur-ΔΔCt.
  10. Calculez les scores z pour chaque valeur t -ΔΔCà l’aide de la fonction d’échelle dans R. Utilisez la fonction de carte thermique R ou un logiciel distinct pour générer une carte thermique.
  11. Utilisez la fonction de corrélation de Pearson pour calculer les corrélations de Pearson entre chaque gène. Utilisez la fonction melt dans R pour organiser le jeu de données pour d’autres fonctionnalités. Exportez ces données et téléchargez-les dans un logiciel de réseau de corrélation génétique.

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Résultats

La validation de la collecte de cellules uniques est effectuée visuellement pendant les procédures LCM. Les noyaux cellulaires sont évalués à la station QC. Le type de cellule peut être déterminé par l’émission de fluorophore marqué pour ce type de cellule et sa morphologie générale. Si des cellules non désirées ont été sélectionnées sur le capuchon, leur matériel génétique peut être détruit avec un laser UV à la station QC. Une validation supplémentaire par analyse moléculaire est également ...

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Discussion

Le trouble lié à la consommation d’alcool demeure une maladie difficile à traiter. Notre groupe a abordé ce trouble en étudiant les processus antirécompense dans une perspective de neuroscience des systèmes. Nous avons mesuré les changements d’expression génique dans les neurones SNT simples et la microglie dans une série de temps de sevrage alcoolique16. Le SNT a été choisi pour son rôle de premier plan dans la dysrégulation autonome qui se produit dans le syndrome de sevrage al...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Le travail présenté ici a été financé par NIH HLB U01 HL133360 attribué à JS et RV, NIDA R21 DA036372 attribué à JS et EVB, T32 AA-007463 attribué à Jan Hoek à l’appui de SJO, et National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
20X DNA Binding DyeFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Loading ReagentFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AntibodyGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60EMD MilliporeMAB377Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibodyabcamab112Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR platform
Bovine Serum AntigenSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific LCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer KitThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry Antibody
Exonuclease INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Sample Extraction DeviceThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope SlidesThermoFisher Scientific22-037-246Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction TubeThermoFisher ScientificN8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Antibody
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermoFisher Scientific11754250Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 ProteinNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mLUSA Scientific1402-9700NA

Références

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