JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Сочетание микродиссекции лазерного захвата и микрофлюидной RT-qPCR обеспечивает анатомическую и биотехническую специфичность при измерении транскриптома в отдельных нейронах и глии. Применение творческих методов с системным биологическим подходом к психиатрическим заболеваниям может привести к прорывам в понимании и лечении, таким как гипотеза нейровоспаления против рвоты при зависимости.

Аннотация

Растущие показатели поведения наркомании побудили исследователей психического здоровья и клиницистов понять антиревардию и выздоровление. Этот отход от вознаграждения и начала требует новых перспектив, парадигм и гипотез, а также расширения методов, применяемых для исследования зависимости. Здесь мы приводим пример: системный биологический подход к исследованию антиревардии, который сочетает в себе микродиссекцию лазерного захвата (LCM) и высокопроизводительные микрофлюидные количественные полимеразные цепные реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Измерена динамика сети экспрессии генов и выявлен ключевой фактор нейровисцеральной дисрегуляции при алкогольной и опиоидной абстиненции – нейровоспаление. Эта комбинация технологий обеспечивает анатомическую и фенотипическую специфичность при одноклеточном разрешении с высокопроизводительной чувствительностью и специфическими показателями экспрессии генов, что дает как наборы данных, генерирующие гипотезы, так и механистические возможности, которые создают возможности для новых идей и методов лечения.

Введение

Наркомания остается растущей проблемой в развитом мире 1,2. Несмотря на значительные научные и клинические достижения, показатели наркомании продолжают расти, в то время как эффективность установленных методов лечения остается стабильной в лучшем случае 3,4,5. Однако достижения в области биотехнологии и научных подходов привели к появлению новых методов и гипотез для дальнейшего исследования патофизиологии зависимости от вещества 6,7,8. Действительно, последние события свидетельствуют о том, что новые концепции и парадигмы лечения могут привести к прорывам с социальными, экономическими и политическими последствиями 9,10,11,12.

Мы исследовали антиревардию при отмене алкогольной и опиоидной зависимости 13,14,15,16. Методы занимают центральное место в этой парадигме 17,18. Микродиссекция лазерного захвата (LCM) может отбирать отдельные клетки с высокой анатомической специфичностью. Эта функциональность является неотъемлемой частью антиреактивной гипотезы нейровоспаления, поскольку и глия, и нейроны могут быть собраны и проанализированы из одного и того же нейронального субядра у одного и того же животного 13,14,15,16,19. Соответствующая часть транскриптома выбранных клеток затем может быть измерена с помощью высокопроизводительных микрофлюидных количественных полимеразных цепных реакций с обратной транскрипцией (RT-qPCR), обеспечивающих многомерные наборы данных для вычислительного анализа, дающего представление о функциональных сетях20,21.

Измерение подмножества транскриптома в нейронах и глии в определенном ядре мозга генерирует набор данных, который является надежным как по количеству выборки, так и по измеренным генам, а также чувствителен и специфичен. Эти инструменты оптимальны для системного нейробиологического подхода к психическим заболеваниям, потому что глия, в основном астроциты и микроглия, продемонстрировали центральную роль в неврологических и психиатрических заболеваниях за последнее десятилетие22,23. Наш подход может измерять экспрессивный ответ глии и нейронов одновременно через многочисленные рецепторы и лиганды, участвующие в локальной паракринной сигнализации. Действительно, сигнализация может быть выведена из этих наборов данных с использованием различных количественных методов, таких как нечеткая логика24. Кроме того, идентификация клеточных субфенотипов в нейронах или глии и их функции может дать представление о том, как клетки мозга в определенных ядрах организуются, реагируют и дисрегулируются на уровне одной клетки. Динамика этой функциональной системы также может быть смоделирована с помощью экспериментов временных рядов16. Наконец, животные модели могут быть возмущены анатомически или фармакологически, чтобы придать механистическое состояние подходу этой системы.

Репрезентативный эксперимент:
Ниже мы приводим пример применения этих методов. В этом исследовании изучалась экспрессия генов нейронов и микроглии крыс в солитарном ядре (NTS) в ответ на алкогольную зависимость и последующую абстиненцию16. Когорты крыс включали 1) Контроль, 2) Этанолозависимый (EtOH), 3) 8-часовой вывод (Wd), 4) 32 ч Wd и 5) 176 ч Wd (Рисунок 1A). После быстрого обезглавливания стволы мозга отделяли от переднего мозга и криосекционировали, а срезы окрашивали для тирозингидроксилаз-положительных (TH+) нейронов и микроглии (рисунок 1B). LCM использовался для сбора как TH+, так и TH-нейронов и микроглии. Все клетки были из NTS и проанализированы как образцы 10-клеточных пулов. Четыре микрофлюидных динамических массива RT-qPCR 96 x 96 были запущены на платформе RT-qPCR, измеряя 65 генов (рисунок 1B-C). Данные нормализовали с помощью метода -ΔΔCt и проанализировали с использованием R, а одноклеточный отбор проверяли молекулярными маркерами (рисунок 1D-E). Техническая валидация была дополнительно проверена техническими репликами, проанализированными в рамках одной партии и между партиями (рисунок 2 и рисунок 3). Нейроны TH+ и TH организованы в различные субфенотипы с аналогичными кластерами воспалительных генов, но отличающимися γ кластерами рецепторов аминомасляной кислоты (ГАМК) (R) (рисунок 4 и рисунок 5). Субфенотипы, которые имели повышенную экспрессию воспалительных кластеров генов, были чрезмерно представлены при 32 ч Wd, в то время как экспрессия ГАМК-рецептора (GABAR) оставалась низкой при длительной отмене алкоголя (176 ч Wd). Эта работа способствует антиреактивной гипотезе алкогольной и опиоидной зависимости, которая предполагает, что перехватывающая обратная связь от внутренних органов при абстиненции способствует дисрегуляции висцерально-эмоциональных нейронных ядер (т.е. НТС и миндалины), что приводит к более тяжелым вегетативным и эмоциональным последствиям, которые способствуют зависимости от вещества (рисунок 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Данное исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Томаса Джефферсона. Протокол был одобрен Университетом Томаса Джефферсона IACUC.

1. Животная модель

  1. Домашний самец Sprague Dawley (>120 г, Харлан, Индианаполис, Индиана, США) тройняет крыс по отдельности со свободным доступом к этанол-чау (2 крысы) или контрольно-чау-смеси (1 крыса).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом репрезентативном эксперименте использовался протокол Либера-ДеКарли для изучения нейробиологии отмены алкоголя25,26. Крысиные тройняшки состоят из когорты из трех крыс, которых кормят одинаковым количеством калорий, но в конечном итоге они попадают в разные руки исследования при жертвоприношении. Тремя группами для этого исследования являются: 1) Контроль, 2) Этанолозависимый (EtOH) и 3) Вывод (Wd) (Рисунок 1A). В этом исследовании есть пять общих условий, так как есть три временные точки отмены алкоголя (рисунок 1A).
    1. Через день измеряйте смесь этанол-чау, потребляемую крысой Wd, и заменяйте количество, потребляемое тем же количеством смеси этанола, на кормушку для крыс EtOH. Добавьте эквивалентное количество калорий контрольной смеси в кормушку контрольной крысы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среднесуточное потребление этанола составляет около 12-16 г/кг через 3 недели26.
    2. После стабильного длительного потребления этанола и зависимости (>5 недель) вызывают острую отмену алкоголя у крысы Wd, опорожняя ее или ее пищевой контейнер и заполняя его контрольной смесью. Выполните это таким образом, чтобы все три крысы были принесены в жертву в одну и ту же циркадную точку времени21.
    3. В заранее выбранной точке времени принесите в жертву всех трех крыс в тройке одновременно (Control, EtOH и Wd).

2. Сбор проб

  1. Собирайте мозг в одну и ту же циркадную точку времени для каждой крысиной тройки в правильную точку времени Wd (8 ч, 32 ч, 176 ч).
    1. Приготовьте ванну с метанолом и сухим льдом для быстрого охлаждения свежих тканей для сохранения целостности РНК. Отложите в сторону.
    2. Поместите крысу в изофлурановой баллон (5% в кислороде) на ~30 с или до тех пор, пока не произойдет потеря сознания, о чем свидетельствует снижение частоты дыхания и отсутствие двигательной активности. Поместите голову крысы в правильно заточенную гильотину, чтобы быстро обезглавить.
    3. Откройте череп животного, чтобы рассечь мозг с помощью щипцов. Удалите мозжечок из свежего мозга ручной бритвой путем грубой нарезки и выбросьте его. Путем поперечного разреза разрезайте ствол мозга от переднего мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ручная бритва может быть использована для дальнейшего окрашивания переднего мозга или ствола мозга в левое и правое полушария в соответствии с экспериментальным дизайном. Например, чтобы проверить результаты из одного полушария с помощью различных методов, исследовать дивергенцию влево-вправо или увеличить число выборок.
    4. Добавьте оптимальную температуру резания (O.C.T.) среды на глубину примерно 3-4 см в форму для встраивания ткани, чтобы образец ткани мог быть полностью погружен. Поместите ткань, передний мозг и / или ствол мозга, в ткань, встраивающую плесень, и добавьте больше O.C.T., чтобы полностью покрыть образец ткани.
    5. Добавьте пластиковую форму для встраивания ткани, содержащую образец ткани (передний мозг крысы), в охлаждающую ванну сухого льда и метанола, чтобы немедленно заморозить образец ткани. Позвольте образцу ткани во встраиваемой форме оставаться в охлаждающей ванне до тех пор, пока сбор ткани не будет завершен, но не дольше 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы предотвратить попадание метанола в контейнер для тканей.
    6. Быстро храните образцы тканей при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидная RT-qPCR измеряет экспрессию генов путем амплификации и измерения транскриптов мРНК. Эти транскрипты относительно нестабильны, поэтому в этом процессе предпринимается много шагов, чтобы сохранить образец как можно более холодным, чтобы предотвратить деградацию мРНК.

3. Криосечение

ПРИМЕЧАНИЕ: Нейрональные ядра крысы составляют приблизительно 10 мкм. Таким образом, 10 мкм является оптимальной толщиной среза для этой животной модели. Толщина среза регулируется в соответствии с животной моделью для исследования.

  1. Из морозильной камеры при -80 °C выньте встраиваемую в ткань плесень, содержащую замороженный ствол мозга, и разморозьте образец при -20 °C в криостате в течение 5-10 минут. Выполняйте эту замораживание-оттаивание до -20 °C только один раз для сохранения мРНК.
  2. С помощью ручной бритвы вертикально срежьте углы пластиковой встраиваемой формы. Удалите ствол мозга, встроенный в O.C.T., из пластической формы встраивания ткани. На патроне криостата, установленного при -20 °C, используйте жидкость O.C.T. комнатной температуры в качестве клея для установки ствола мозга в ростральном и каудальном направлении для корональной криосекции.
  3. Вырежьте 10 мкм корональные криосекции в ростральном и каудальном направлении от ствола мозга крысы до тех пор, пока не будут достигнуты участки, содержащие интересующую область (NTS). Высота и ширина этих криосекций составляют ~ 200 мм в зависимости от размеров пластиковой формы для встраивания.
  4. Соберите 10-мкм криосекции ткани ствола мозга, которые включают NTS или другую область, представляющую интерес на основе исследования, путем оттаивания на простых стеклянных слайдах при комнатной температуре. Быстро поместите эти горки с секциями в охлаждающую металлическую кастрюлю, которая расположена поверх сухого льда. Как можно скорее поместите стеклянные слайды, содержащие криосекции, в морозильную камеру при температуре -80 °C для хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один стеклянный слайд может вместить несколько 10 мкм криосекции, так как ширина и высота ~ 200 мм. Таким образом, один и тот же слайд может содержать криосекции, которые окрашиваются для различных типов клеток.
    1. Когда на слайде находится несколько секций, убедитесь, что они разделены 100 мм пустого пространства. Чтобы создать границу между криосекциями, используйте гидрофобную ручку. Это позволяет различным растворам антител окрашивать различные типы клеток на одном и том же стеклянном слайде. Сохраните 20 мм пространства для криосекции от края стеклянной горки.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание одиночных клеток

  1. Используйте протокол быстрой окрашивания иммунофлуоресценции на криосекциях мозга для маркировки желаемых типов клеток мозга (нейроны, микроглия, астроциты и т. Д.) Для сбора с использованием LCM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол окрашивания иммуногистохимии, используемый для этих экспериментов, был разработан, чтобы быть быстрым для предотвращения избыточной деградации мРНК во время этого процесса.
    1. Из морозильной камеры -80 °C выньте стеклянные слайды, содержащие 10 мкм криосекций ствола мозга крысы, содержащего NTS. Опустите слайды на 30 с в 75% этаноловую ванну, чтобы зафиксировать криосекционированную ткань. Удалите лишнюю жидкость.
    2. На фиксированную криосекционированную ткань ствола мозга наносят 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 30 с для блокирования нецелевого связывания антител. После этого помойте PBS.
    3. Нанесите достаточное количество первичного раствора антител, чтобы покрыть криосекционированную ткань (теперь фиксированную и заблокированную). Инкубируют участок ткани в растворе первичных антител в течение 2 мин. Промыть ткань 2% раствором BSA один раз. Раствор первичного антитела содержит 96% раствора BSA-PBS для блокирования, 3% первичного антитела и 1% ингибитора РНКазы. Первичное антитело разбавляли в соотношении 1:25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом репрезентативном эксперименте первичные антитела состоят из антитела против NeuN и анти-Cd11β антитела. Нейроны были далее подразделены на подгруппы TH+ и TH-, поэтому первичные растворы антител для окрашивания нейронов содержали 93% раствора BSA PBS, 3% антитела против NeuN, 3% антитирозингидроксилазного антитела и 1% RNase Out.
    4. Примените достаточное количество раствора вторичных антител (1:200), чтобы покрыть ткань ствола мозга. Пусть раствор вторичного антитела омывает ткани. Через 3 мин промыть ткань 2% раствором БСА однократно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор, содержащий вторичное антитело, состоял из 196,5 мкл 2% BSA, 1 мкл флуоресцентной метки козьей против мыши 555 нм для клеточного типа, 1 мкл ослиной анти-кролика Alexa 488 нм для окрашивания TH, 2,5 мкл ингибитора РНКазы и 1,3 мкл DAPI (1:10000).

5. Стандартная серия обезвоживания этанола и ксилоловой ткани

  1. Поместите стеклянные слайды, на которых витражная криосекционированная ткань покоится в 75% этаноловой ванне в течение 30 с, затем поместите в 95% этаноловую ванну на 30 с, 100% этаноловую ванну на 30 с и, наконец, 100% этанол в течение 30 с (во втором контейнере).
  2. После завершения серии обезвоживания этанола залить двумя свежими 100% ксилоловыми ваннами. Затем поместите стеклянные горки в первую ксилоновую ванну на 1 мин. Быстро снимите и поместите слайды в другую свежую ксилольную ванну на 4 минуты.
  3. Возьмите стеклянные слайды, содержащие окрашенные и обезвоженные криосекции тканей, из ксилола и поместите в темный, но вентилируемый контейнер на 5 минут, чтобы высушить на воздухе. После воздушной сушки поместите стеклянные горки в осушитель на 5 минут для окончательной сушки.

6. Выберите отдельные ячейки с помощью лазерной микродиссекции (LCM)

  1. Вставьте стеклянный слайд, содержащий окрашенные, фиксированные и обезвоженные криосекции тканей, в держатель образца микроскопа LCM. Используйте анатомические ориентиры, чтобы найти интересующую область, из которой будет происходить сбор клеток (NTS в этом репрезентативном примере).
  2. Включите флуоресценцию микроскопа и найдите окрашенные типы клеток, представляющие интерес. Убедитесь, что ядро нужной клетки находится в интересующей области и изолировано от ядер других клеток на расстояние >3 мм. Определите и пометьте одну клетку (если эксперимент является истинным одноклеточным) или несколько клеток (если эксперимент требует объединенных одноклеточных образцов [т.е. одноклеточных масштабов], как показано в этом репрезентативном эксперименте) для сбора с использованием программного обеспечения LCM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, состоящие из 10-клеточных пулов, были использованы в этом репрезентативном эксперименте. Это делается для уменьшения вариабельности экспрессии генов между образцами и увеличения количества анализируемых одиночных клеток, хотя это все еще остается экспериментом в масштабе одной клетки. Истинные одноклеточные эксперименты могут быть завершены с помощью этого метода20,27. Кроме того, более крупные участки ткани также могут быть выбраны21.
  3. После того, как нужные клетки выбраны, используйте роботизированную руку LCM, поместите колпачок LCM на интересующую область на отмеченной криосекции ткани.
  4. Откалибруйте интенсивность и направленность инфракрасного (ИК) лазера с помощью тестовых снимков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для каждого образца. Калибровка должна выполняться на участке колпачка, который не находится непосредственно над тканью, чтобы не ошибиться в выборе неэкспериментальной ткани.
    1. Чтобы откалибровать интенсивность, отрегулируйте продолжительность, силу и размер ИК-лазерного выстрела таким образом, чтобы выстрел расплавлял клей крышки только настолько, чтобы выбрать одно клеточное ядро, а также был достаточно прочным, чтобы расплавить колпачок до криосекции на слайде. Эти значения будут разными для каждого колпачка.
    2. Калибруйте прицеливание, локализуя лазерное перекрестие именно там, где лазер расплавил колпачок.
  5. Соберите клетки, идентифицированные путем запуска инфракрасного лазера LCM, чтобы расплавить колпачок на криосекционированную ткань над этими клетками. Убедитесь, что только выбранные клетки были подняты из среза ткани с помощью роботизированной руки, чтобы найти колпачок в области контроля качества (QC) микроскопа LCM. Чтобы удалить лишние клетки на колпачке, используйте ультрафиолетовый (УФ) лазер для уничтожения генетического материала дополнительных клеток.
  6. Запишите анатомическую специфичность с помощью программной камеры LCM. Сделайте снимок криосекционной ткани, из которой была удалена клетка (клетки).
  7. Используйте анатомический атлас (атлас переднего мозга крысы в этом примере), чтобы определить расстояние этого среза ткани от брегмы и записать эту информацию как расстояние Z28. Определите местоположение в плоскости X и/или Y по фотографии, чтобы полностью локализовать выбранную ячейку.
  8. Руками в перчатках снимите колпачок LCM из области контроля качества. Затем прикрепите устройство для извлечения образцов к колпачку LCM. Используйте пипетку для нанесения 5,5 мкл буфера лизиса на выбранную ячейку (ячейки). Теперь это называется образцом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферный раствор лизиса состоит из 5 мкл буфера ресуспензии вместе с 0,5 мкл усилителя лизиса.
  9. Установите микроцентрифужную трубку объемом 0,5 мл на устройство для извлечения образцов, которое прикреплено к колпачку LCM. Поместите это устройство на конфорку с температурой 75 °C с образцом и буфером лизиса ближе к пластине. Дайте образцу нагреться в течение 15 минут.
  10. Используйте низкоскоростную центрифугу при 0,01-0,02 х г для вращения образца и буфера лизиса вниз в нижнюю часть микроцентрифужной трубки объемом 0,5 мл. Храните образец при -80 °C до микрофлюидной qPCR.

7. Запустите чип qPCR на микрофлюидном RT-qPCR на платформе

  1. Чтобы измерить экспрессию генов для образцов с одной клеткой, выполните предварительную амплификацию мРНК, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол не включает экстракцию мРНК, поскольку образцы представляют собой одиночные клетки, содержащие очень низкое количество РНК (10 пг), которые будут потеряны на этапе выделения мРНК. Одиночные клетки лизируют и непосредственно переходят на обратную транскрипцию, чтобы свести к минимуму потерю образца.
    1. Создайте пул праймеров, добавив праймеры гена mRNA qPCR (прямой и обратный) для каждого гена, анализируемого в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. Убедитесь, что конечная концентрация каждой грунтовки составляет 500 нМ. Грунтовки в этом примере эксперимента перечислены в дополнительной таблице 116.
    2. Пипетка 1 мкл 5x кДНК реакционной смеси в каждую лунку 96-луночной ПЦР-пластины.
    3. Дайте одноклеточным образцам ненадолго разморозиться (2-3 мин), вынув их из морозильной камеры -80 °C и дав им посидеть при комнатной температуре. Используйте низкоскоростную центрифугу при 0,01-0,02 х г для вращения образцов в течение 20-30 с. Пипетка 5,5 мкл каждого одноклеточного образца в другую скважину в 96-луночной ПЦР-пластине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Номер и тип образца, который должен быть помещен в каждую скважину, определяются до начала этого этапа.
    4. Пластина ПЦР с 96 лунками теперь содержит реакционную смесь кДНК и одноклеточный образец, добавленный к каждой скважине. Поместите эту пластину в термоциклер на 1,5 мин при 65 °C, чтобы активировать реакционную смесь кДНК. Раскрутите содержимое с помощью высокоскоростного центрифугирования при 1 300 х г в течение 1 мин при 4 °C и положите пластину ПЦР на влажный лед.
    5. В каждую лунку в пластине ПЦР пипетка 0,12 мкл белка гена Т4 32, 0,73 мкл буфера суспензии ДНК и 0,15 мкл 10x синтеза кДНК. Запустите ПЦР-пластину по следующему протоколу в термоциклере: 25 °C в течение 5 мин, 50 °C в течение 30 мин, 55 °C в течение 25 мин, 60 °C в течение 5 мин, 70 °C в течение 10 мин и окончательная выдержка при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок гена T4 32 (одноцепочечный ДНК (ssDNA), связывающий белок) необходим для репликации и восстановления бактериофага T4. Белок T4 Gene 32 использовался на этапе обратной транскрипции протокола для улучшения выхода и эффективности обратной транскрипции и увеличения выхода продукта ПЦР.
    6. В каждую скважину в ПЦР-пластине пипетка 7,5 мкл taq полимеразы мастер-микс. После этого в каждой скважине пипетка 1,5 мкл грунтовочного пула создается на шаге 7.1.1. Пропустите пластину ПЦР через следующий линейный этап предварительного уплотнения в термоциклере: 95 °C в течение 10 мин; 22 цикла: 96 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 4 мин.
    7. В каждую лунку в ПЦР-пластине пипетка 1,2 мкл экзонуклеазы I, 4,2 мкл буфера суспензии ДНК и 0,6 мкл 10x экзонуклеазы I реакционного буфера. Запустите пластину ПЦР по следующему протоколу в термоциклере: 37 °C в течение 30 мин, 80 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экзонуклеаза катализирует удаление нуклеотидов из линейной одноцепочечной ДНК в направлении от 3' до 5'. Мы используем экзонуклеазу для очистки образцов для удаления неинкорпорированных праймеров и любой одноцепочечной кДНК, которая может присутствовать после предварительного усиления.
    8. В каждую скважину в ПЦР-пластине пипетку 54 мкл TE-буфера. Используйте высокоскоростную центрифугу при 1 300 х г в течение 5 мин при 4 °C для раскрутки содержимого пластины ПЦР.
    9. Если планируется продолжить следующий этап протокола, охладите ПЦР-пластину при 4 °C. Если между завершением фазы предварительного усиления и началом микрофлюидной qPCR прошло более 12 ч, накройте пластину qPCR и поместите ее в морозильную камеру с температурой -20 °C.
  2. Сделайте пробную пластину (новую 96-луночную ПЦР-пластину) для чипа qPCR, как описано ниже.
    1. Если предварительно амплификационную ПЦР-пластину со стадии 7.1 поместили в морозильную камеру при температуре -20 °C, снимите и дайте оттаять при комнатной температуре в течение 10 мин.
    2. В новую 96-луночную ПЦР-пластину, пипетку в каждую скважину 4,55 мкл супермикса ПЦР с низким содержанием rox и 0,45 мкл 20x ДНК-связывающего красителя. Затем пипетку 3 мкл предварительно амплированного образца из ПЦР-пластины, изготовленной на шаге 7.1. Используйте высокоскоростное центрифугирование при 1 300 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы открутить пластину ПЦР и поместить пластину образца ПЦР на лед.
  3. Сделайте пробирную пластину (новую 96-луночную ПЦР-пластину) для чипа qPCR, как описано ниже.
    1. В новую 96-луночную ПЦР-пластину, пипетку в каждую скважину 1,25 мкл буфера суспензии ДНК и 3,75 мкл 2-кратного реагента для загрузки проб. Затем пипетку соответствующей грунтовки qPCR на 2,5 мкл из 10 мкМ праймера. Используйте высокоскоростную центрифугу при 1 300 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы открутить пластину ПЦР и поместить пластину анализа ПЦР на лед.
  4. Подготовьте чип qPCR к загрузке в микрофлюидную платформу RT-qPCR, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чип qPCR представляет собой платформу qPCR в реальном времени, которая работает на микрофлюидных принципах. Чип qPCR по существу представляет собой матрицу из 96 каналов выборки и 96 каналов праймера РНК qPCR (т.е. анализов), которые пересекаются в 9,216 (96 x 96) камерах. Образец и конкретный анализ объединяются в каждой камере массива, в которой происходит реакция qPCR в реальном времени. Считывание генерируется в виде значений порогового цикла (Ct) и графиков усиления для используемых праймеров.
    1. Впрыскивайте жидкость управляющей линии в чип qPCR для грунтовки. Вставьте чип qPCR в микрофлюидное микшерное устройство. Выберите основной (136x) сценарий и запустите эту программу.
    2. Когда программа будет завершена через ~45 минут, удалите загрунтованный чип qPCR. В загрунтованный чип qPCR пипетка 6 мкл реакции из пластины образца ПЦР в соответствующую пробную скважину в чипе qPCR.
    3. В загрунтованный чип qPCR пипетка 6 мкл реакции из пластины анализа ПЦР в соответствующую пробирную скважину в чипе qPCR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха могут образовываться в нижней части образца и пробирных скважин в чипе qPCR, что может предотвратить попадание растворов в микрофлюидные каналы. Острая игла может быть использована для лопания или удаления этих пузырьков воздуха перед вставкой чипа qPCR в микрофлюидное смесительное устройство.
    4. Вставьте чип qPCR в микрофлюидное микшерное устройство. Выберите скрипт load mix (136x) и запустите эту программу.
  5. Загрузите чип qPCR в микрофлюидную платформу RT-qPCR.
    1. Включите микрофлюидную платформу RT-qPCR и прогрейте лампочку (~20 мин). Извлеките чип qPCR из микрофлюидного смесительного устройства. Снимите защитную наклейку со дна чипа qPCR.
    2. Откройте микрофлюидную платформу RT-qPCR и загрузите чип qPCR в микрофлюидную платформу RT-qPCR. Запустите быстрый протокол ПЦР 96 x 96 (30 циклов) на микрофлюидной платформе RT-qPCR.
    3. Запустите программное обеспечение для сбора данных и щелкните Начать новый запуск.
    4. Проверьте штрих-код чипа и тип чипа нажмите далее. Нажмите на файл Chip Run и просмотрите расположение файла для хранилища сбора данных.
    5. Нажмите на Тип приложения и выберите Экспрессия генов; выберите ROX для пассивного использования, выберите Single Probe и выберите EvaGreen для типа зонда.
    6. Нажмите, чтобы выбрать программу термоциклирования и выберите файл Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl.

8. Анализ данных

  1. Загрузите данные с микросхемы qPCR в аналитическое программное обеспечение для контроля качества, как описано ниже.
    1. Загрузите программное обеспечение для анализа данных. Это можно найти на следующем веб-сайте: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Запустите программное обеспечение для анализа микрофлюидного эксперимента RT-qPCR.
    2. В программном обеспечении откройте Chip Run. Затем откройте файл ChipRun.bml, созданный экспериментом. Появится окно с экспериментальными деталями, включая пассивный эталон, зонд и тепловую программу ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль качества (QC) и анализ данных могут быть выполнены на компьютере, подключенном к микрофлюидной платформе RT-qPCR, или путем передачи файла .bml на другой компьютер через флэш-накопитель или другие средства.
  2. Определите пример настройки, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе создается маркированный шаблон образцов и анализов (qPCR primers) для процедур контроля качества (QC) и анализа данных.
    1. Выберите Chip Explorer > Настройка образца пластины и создайте новый образец пластины. Выберите соответствующий тип контейнера и формат контейнера (SBS96 для 96-луночной пластины, используемой в этом репрезентативном эксперименте).
    2. Вставьте образцы этикеток в электронную таблицу программного обеспечения в соответствии с экспериментальным дизайном и выберите «Карта » в меню «Задача». Выберите SBS96-Left.dsp. Пример настройки теперь сопоставлен. Выберите Подробное представление > Анализ , чтобы обновить эти изменения в файле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любые изменения, внесенные в это программное обеспечение, не будут сохранены до тех пор, пока не будет нажата кнопка Анализ .
  3. Определите образцы элементов управления в программном обеспечении. Выделите ячейки для образцов элементов управления, щелкнув левой кнопкой мыши и удерживая нажатой клавишу, перетаскивая ячейки для выделения. Отдельные ячейки можно выбрать, нажав и удерживая клавишу Ctrl и щелкнув по отдельным ячейкам. Для стандартных образцов РНК (серия разбавления) введите название образца и используемую концентрацию РНК. Нажмите « Анализировать», чтобы сохранить.
  4. Определите настройку детектора аналогично шагу 8.2 выше, но с именами анализов RT-qPCR, то есть именами анализируемых генов. Выберите Настройка детекторной пластины и создайте новую пробирную пластину. Выберите подходящий тип и формат контейнера (SBS96 для плиты с 96 скважинами). Вставьте имена анализов в соответствии с экспериментальным дизайном и нажмите « Анализировать», чтобы сохранить.
  5. Начните процесс контроля качества пользователей (QC), как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом репрезентативном эксперименте использовался метод порогового значения времени цикла (Ct). То есть образцы, которые не достигли порогового сигнала, определенного программным обеспечением (Auto Global) или вручную (User Global), будут считаться неудачными реакциями и не включаться в набор данных.
    1. Выберите Представление анализа > рамках задачи. В области параметров анализа измените параметры на Автоглобал (автоматически вычисляет пороговое значение, применяемое ко всему чипу) или User Global. Установите базовую коррекцию в линейную производную. Если используется User Global, пороговое значение сбоя должно быть определено вручную, как и в репрезентативном эксперименте.
    2. В этом репрезентативном эксперименте использовалось правило контроля качества следующим образом: если отдельный анализ или выборка имели частоту сбоев 70% или выше, то вся строка или столбец в наборе данных была неудачной.
    3. Вручную просмотрите каждую реакцию в чипе 96 x 96. Визуализируйте кривые усиления и кривые расплава, чтобы определить, следовала ли каждая реакция ожидаемой схеме qPCR. Если кривая усиления или расплава не совпадает с ожидаемой, провалите эту реакцию.
  6. Следуя контролю качества, экспортируйте данные, выбрав Файл > Экспорт и сохраните набор данных в виде файла .csv.
  7. Обрежьте набор данных, так как экспортируемый .csv файл имеет как матрицу Pass-Fail, так и матрицу с необработанными значениями Ct. Используйте матрицу Pass-Fail для замены всех неисправных ячеек в наборе данных na.
  8. Загрузите самую последнюю версию программного обеспечения R с открытым исходным кодом, а затем загрузите приложение R-Studio. Загрузите нормализованный набор данных в R. Проанализируйте данные в соответствии с требованиями исследования.
  9. Нормализуйте набор данных с помощью метода -ΔΔCt , как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Медианное центрирование или нормализация генов домашнего хозяйства могут быть использованы в строке выборки для генерации значения -ΔCt . В репрезентативном эксперименте медианное центрирование использовалось и подтверждалось нормализацией генов домашнего хозяйства. Это можно сделать в .csv формате или путем загрузки в программное обеспечение для анализа данных.
    1. Для медианного центрирования вычислите медианное значение Ct, рассчитанное из всех значений Ct для отдельного образца (10-ячеечный пул). Затем вычтите все отдельные значения Ct из этого медианного значения. Это дает значение -ΔCt .
    2. Для нормализации генов ведения хозяйства рассчитайте среднюю экспрессию генов ведения хозяйства (Actb, Gapdh и Ldha в репрезентативном эксперименте) для каждого образца и используйте это значение в качестве значения, из которого вычитаются отдельные значения Ct.
    3. Чтобы сгенерировать значение -ΔΔCt , возьмите медиану каждого столбца анализа, которая теперь содержит значение -ΔCt . Вычтите медиану анализа из каждого значения -ΔCt , чтобы получить значение -ΔΔCt .
  10. Рассчитайте z-баллы для каждого значения -ΔΔCt с помощью функции масштабирования в R. Используйте функцию тепловой карты R или отдельное программное обеспечение для создания тепловой карты.
  11. Используйте корреляционную функцию Пирсона для расчета корреляций Пирсона между каждым геном. Используйте функцию melt в R для организации набора данных для других функций. Экспортируйте эти данные и загрузите их в программное обеспечение для сети корреляции генов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Валидация одноклеточного сбора выполняется визуально во время процедур LCM. Клеточные ядра оцениваются на станции КК. Тип клетки может быть определен по выбросу меченого флуорофора для этого типа клеток и его общей морфологии. Если нежелательные клетки были выбраны на колпачке, их гене?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Расстройство, связанное с употреблением алкоголя, остается сложным заболеванием для лечения. Наша группа подошла к этому расстройству, исследуя антиревардетные процессы с точки зрения системной нейробиологии. Мы измерили изменения экспрессии генов в отдельных нейронах NTS и микроглии...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Работа, представленная здесь, финансировалась через NIH HLB U01 HL133360, присужденную JS и RV, NIDA R21 DA036372, присужденную JS и EVB, T32 AA-007463 присужденную Яну Хуку в поддержку SJO и Национальный институт алкоголизма и злоупотребления алкоголем: R01 AA018873.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
20X DNA Binding DyeFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Loading ReagentFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AntibodyGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60EMD MilliporeMAB377Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibodyabcamab112Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR platform
Bovine Serum AntigenSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific LCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer KitThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry Antibody
Exonuclease INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Sample Extraction DeviceThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope SlidesThermoFisher Scientific22-037-246Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction TubeThermoFisher ScientificN8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Antibody
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermoFisher Scientific11754250Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 ProteinNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mLUSA Scientific1402-9700NA

Ссылки

  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790(2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612(2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375(2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены