במבחנה עיכול תחליבים בטיפה אחת באמצעות החלפה רב-פאזית של נוזלי מערכת העיכול המדומים

Julia Maldonado-Valderrama; Teresa del Castillo Santaella; Juan Antonio Holgado-Terriza; Miguel Ángel Cabrerizo-Vílchez

doi:10.3791/64158

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

איזון יריעת פני השטח של התליון המיושם עם החלפה מרובת תת-פאזות, המכונה OCTOPUS, מאפשר לחקות את תנאי העיכול על ידי החלפת תת-פאזה רציפה של התמיסה המקורית בתפזורת עם נוזלים מדומים במערכת העיכול. העיכול המדומה במבחנה מנוטר על ידי רישום באתרו של המתח הבין-פאזי של השכבה הבין-מרחבית המעוכלת.

Abstract

תחליבים משמשים כיום כדי לתמצת ולספק חומרים מזינים ותרופות כדי להתמודד עם מצבים שונים במערכת העיכול כגון השמנת יתר, העשרת חומרים מזינים, אלרגיות למזון ומחלות עיכול. היכולת של תחליב לספק את הפונקציונליות הרצויה, כלומר, להגיע לאתר מסוים במערכת העיכול, לעכב / מעכב ליפוליזה, או להקל על העיכול, בסופו של דבר תלוי ברגישות שלו לפירוק אנזימטי במערכת העיכול. בתחליבי שמן במים, טיפות השומנים מוקפות בשכבות בין-אישיות, שבהן המתחלבים מייצבים את התחליב ומגנים על התרכובת העטופה. השגת יכולת עיכול מותאמת אישית של תחליבים תלויה בהרכב הראשוני שלהם, אך דורשת גם מעקב אחר האבולוציה של אותן שכבות בין-פאזיות מכיוון שהן נתונות לשלבים שונים של עיכול במערכת העיכול. איזון סרט שטח של טיפת תליון המיושם עם החלפה מרובת תת-פאזות מאפשר לדמות את העיכול במבחנה של תחליבים בטיפה מימית אחת השקועה בשמן על ידי יישום מודל עיכול סטטי מותאם אישית. המעבר דרך מערכת העיכול מחוקה על ידי החלפת תת-פאזה של תמיסת התפזורת המקורית של הטיפות עם מדיה מלאכותית, המחקה את התנאים הפיזיולוגיים של כל תא/שלב במערכת העיכול. האבולוציה הדינמית של המתח הבין-תאי נרשמת באתרה לאורך כל העיכול המדומה של מערכת העיכול. התכונות המכניות של ממשקים מעוכלים, כגון גמישות מורחבת בין-פאזית וצמיגות, נמדדות לאחר כל שלב עיכול (דרך הפה, הקיבה, המעי הדק). ניתן לכוונן את ההרכב של כל מדיה במערכת העיכול כדי להסביר את המאפיינים של תנאי העיכול, כולל פתולוגיות במערכת העיכול ומדיה העיכול של התינוק. המנגנונים הבין-פאזיים הספציפיים המשפיעים על פרוטאוליזה וליפוליזה מזוהים, ומספקים כלים לווסת את העיכול על ידי הנדסה בין-פאזית של תחליבים. ניתן לתמרן את התוצאות המתקבלות לתכנון מטריצות מזון חדשניות עם פונקציות מותאמות אישית כגון אלרגניות נמוכה, צריכת אנרגיה מבוקרת וירידה בעיכול.

Introduction

הבנת אופן העיכול של שומן, הכוללת עיכול תחליבים, חשובה לתכנון רציונלי של מוצרים עם פונקציונליות מותאמת אישית¹. המצע לעיכול שומן הוא תחליב שכן השומן מתחלב עם הצריכה על ידי פעולה מכנית וערבוב עם חומרים פעילי שטח ביולוגיים בפה ובקיבה. כמו כן, רוב השומן הנצרך על ידי בני אדם כבר מתחלב (כגון מוצרי חלב), ובמקרה של תינוקות או כמה קשישים, זוהי צורת הצריכה היחידה. לפיכך, העיצוב של מוצרים מבוססי תחליב עם פרופילי עיכול ספציפיים חשוב מאוד בתזונה¹. יתר על כן, תחליבים יכולים לעטוף ולספק חומרים מזינים, תרופות או פעילות ביולוגית ליפופילית² כדי להתמודד עם מצבים שונים במערכת העיכול כגון השמנת יתר³, חיזוק חומרים מזינים, אלרגיות למזון ומחלות עיכול. בתחליבי שמן במים, טיפות השומנים מוקפות בשכבות בין-פאזיות של מתחלבים כגון חלבונים, חומרים פעילי שטח, פולימרים, חלקיקים ותערובות⁴. תפקידם של מתחלבים הוא כפול: לייצב את האמולסיה⁵ ולהגן/להעביר את התרכובת העטופה לאתר מסוים. השגת יכולת עיכול מותאמת אישית של אמולסיות תלויה בהרכב הראשוני שלהם, אך דורשת גם מעקב אחר האבולוציה המתמשכת של ממשק זה במהלך המעבר דרך מערכת העיכול (איור 1).

figure-introduction-1281
איור 1: יישום הנדסה בין-פאזית של תחליבים כדי להתמודד עם כמה מהמצבים העיקריים במערכת העיכול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

עיכול שומנים הוא בסופו של דבר תהליך בין-פאזי מכיוון שהוא דורש ספיחה של ליפאזות (קיבה או לבלב) על ממשק מי השמן של טיפות שומנים מתחלבות דרך השכבה הבין-פאזית כדי להגיע ולהידרוליזה של הטריגליצרידים הכלולים בשמן לחומצות שומן חופשיות ומונואצילגליצרידים⁶. זה מתואר באיור 2. ליפאז קיבה מתחרה עם פפסין ופוספוליפידים בקיבה על ממשק שמן-מים (איור 2, עיכול קיבה). לאחר מכן, ליפאז/קוליפאז בלבלב מתחרים בטריפסין/כימוטריפסין, פוספוליפידים, מלחי מרה ומוצרי עיכול במעי הדק. פרוטאזות יכולות לשנות את הכיסוי הבין-מרחבי, למנוע או להעדיף ספיחת ליפאז, בעוד שמלחי מרה פעילים מאוד על פני השטח ודוחקים את רוב המתחלב שנותר כדי לקדם ספיחת ליפאז (איור 2, עיכול מעיים). בסופו של דבר, הקצב וההיקף של ליפוליזה תלויים בתכונות הבין-פאזיות של התחליב המעוכל הראשוני/קיבה, כגון עובי, קשרים בין-מולקולריים ואינטראקציות אלקטרוסטטיות וסטריות. בהתאם לכך, מעקב אחר האבולוציה של השכבה הבין-פאזית בזמן שהיא מתעכלת מציע פלטפורמה ניסיונית לזיהוי מנגנונים ואירועים בין-פאזיים המשפיעים על ספיחת ליפאז, ומכאן על עיכול השומנים.

figure-introduction-2840
איור 2: דיאגרמה סכמטית הממחישה את תפקידם של ממשקים בעיכול שומנים במערכת העיכול. הידרוליזה של פפסין משנה את ההרכב הבין-פאזי בשלב הקיבה, בעוד שליפאז קיבה מבצע הידרוליזה של טריגליצרידים. במעי הדק, טריפסין/כימוטריפסין מבצעים הידרוליזה נוספת של הסרט הבין-מרחבי, בעוד שליפוליזה ממשיכה על ידי ספיחה של BS/ליפאזות, הידרוליזה של טריגליצרידים, וספיגה של מוצרים ליפוליטיים על ידי סולוביזציה במיקלות/קומפלקס BS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ציוד הטלת התליון באוניברסיטת גרנדה (UGR) מיושם בטכנולוגיה מוגנת בפטנט, הנימים הכפולים הקואקסיאליים, המאפשרת החלפה תת-פאזית של הפתרון בתפזורת⁷. הנימי, המחזיק את טיפת התליון, מורכב מסידור של שני נימים קואקסיאליים המחוברים באופן עצמאי לכל ערוץ של מיקרו-אינז'קטור כפול. כל מיקרו-אינז'קטור יכול לפעול באופן עצמאי, מה שמאפשר להחליף את התוכן שנשמט על ידי זרימה^{דרך 7}. לפיכך, חילופי subphase מורכב הזרקה בו זמנית של הפתרון החדש עם נימי הפנימי ואת מיצוי של תמיסה בתפזורת עם נימי החיצוני באמצעות אותו קצב זרימה. תהליך זה מאפשר החלפת התמיסה בתפזורת ללא הפרעה לאזור הבין-תאי או לנפח הטיפות. הליך זה שודרג מאוחר יותר להחלפה מרובת תת-פאזות, המאפשרת עד שמונה החלפות תת-פאזיות רצופות של פתרון תפזורת הטיפות⁸. זה מאפשר סימולציה של תהליך העיכול בטיפה מימית אחת המרחפת במדיה ליפידית על ידי החלפה רציפה של התמיסה בתפזורת עם מדיה מלאכותית המחקה את התאים השונים (פה, קיבה, מעי דק). המערך כולו מיוצג באיור 3, כולל פרטי הרכיבים. המזרקים במיקרו-אינז'קטור מחוברים לשמונת שסתומי ה-vias, שכל אחד מהם מתחבר לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את נוזל העיכול המלאכותי עם רכיבים המתוארים באיור 2.

figure-introduction-4805
איור 3: מבט כללי על התמנון עם כל הרכיבים. מצלמת ה-CCD, המיקרוסקופ, המיקרו-מייצב, התא התרמו-יציב והנימים הכפולים מחוברים באופן עצמאי למיקרו-מזרק כפול עם שני מזרקים המחוברים לשמונה שסתומי ויאס. כל מזרק מתחבר עם נימי, ארבעה צינורות microcentrifuge עם דגימה פריקה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4A מראה כיצד כל אחד מנוזלי העיכול המלאכותיים מוזרק לתוך טיפת התליון על ידי חילוף תת-פאזי דרך הנימים הכפולים. כל תרכובת עיכול המפורטת באיור 2 ניתנת ליישום בו-זמנית/ברצף, תוך הדמיה של המעבר דרך מערכת העיכול. נוזלי העיכול המלאכותיים מכילים אנזימים שונים וחומרים פעילי שטח ביולוגיים, שמשנים את המתח הבין-תאי של המתחלב הראשוני, כפי שמתואר באיור 4B. התוכנה DINATEN (ראה טבלת חומרים), שפותחה גם היא ב- UGR, מתעדת את האבולוציה של המתח הבין-פאזי בזמן אמת כאשר השכבה הבין-פאזית הראשונית מתעכלת במבחנה. כמו כן, לאחר כל שלב עיכול, מחושבת האלסטיות הרחיבה של השכבה הבין-פאזית על ידי הטלת תנודות מחזוריות של נפח/אזור בין-פאזי על השכבה הבין-פאזית המיוצבת ורישום התגובה של המתח הבין-מרחבי. התקופה/תדר והמשרעת של התנודה יכולים להיות מגוונים, ועיבוד תמונה עם התוכנה CONTACTO מספק את הפרמטרים הריאולוגיים המרחיבים⁸.

figure-introduction-6386
איור 4: דוגמאות לפרופילי עיכול . (A) שכבת התחליב הראשונית נתונה למדיית עיכול מלאכותית הממוקמת במיקרוצנטריפוגה על ידי החלפת תת-פאזה רציפה של התמיסות השונות לתוך טיפת התליון. (B) האבולוציה הכללית של המתח הבין-פאזי (ציר y) של המתחלב הראשוני כפונקציה של הזמן (ציר x) כפי שהוא מתעכל במבחנה על ידי האנזימים/ביו-חומרים פעילי שטח שונים במדיה המלאכותית. חילוף תת-פאזי סופי עם נוזל מעיים רגיל מודד את הספיגה של שומנים מעוכלים על ידי סולוביזציה במיצלות מעורבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מחקר זה מציג את הפרוטוקול הכללי שנועד למדוד עיכול במבחנה של שכבות בין-מרחביות באמצעות ציוד לנפילת תליון⁹. השכבה הבין-פאזית הראשונית נתונה ברצף לתנאים המחקים את המעבר דרך מערכת העיכול, כפי שמתואר באיור 2. מדיות העיכול השונות האלה מוזרקות לתוך טיפת התליון על ידי החלפה תת-פאזית של התמיסות השונות הכלולות בצינורות המיקרוצנטריפוגה (איור 4A). ההרכב של מדיה זו יכול להיות מותאם אישית בהתאם לתנאי העיכול שיוערכו, כלומר, פרוטאוליזה קיבה / מעיים / ליפוליזה, המאפשר מדידת השפעות מצטברות ו sinergies¹⁰. תנאי הניסוי המשמשים לחיקוי תהליך העיכול בכל תא תואמים את פרוטוקול הקונצנזוס הבינלאומי שפורסם על ידי INFOGEST המפרט את ה- pH ואת כמויות האלקטרוליטים והאנזימים¹¹. המכשיר הניסיוני המבוסס על נפילת תליון מאפשר הקלטה של המתח הבין-פאזי באתרו לאורך כל תהליך העיכול המדומה. הריאולוגיה המתרחבת של השכבה הבין-פאזית מחושבת בסוף כל שלב עיכול. בדרך זו, כל מתחלב מציע פרופיל עיכול הממחיש את התכונות של הממשקים המעוכלים, כפי שמתואר באיור 4B. זה מאפשר מיצוי של מסקנות לגבי רגישות או התנגדות לשלבים שונים של תהליך העיכול. באופן כללי, מדיית העיכול המלאכותית מכילה חומצה/pH בסיסית, אלקטרוליטים, פרוטאזות (קיבה ומעי), ליפאזות (קיבה ומעי), מלחי מרה ופוספוליפידים, המומסים בנוזלי העיכול שלהם (קיבה או מעיים). איור 4B מראה פרופיל גנרי של האבולוציה של המתח הבין-פאזי של המתחלב, תחילה נתון לפעולת פרוטאזות, ולאחר מכן ליפאזות. באופן כללי, פרוטאוליזה של השכבה הבין-פאזית מקדמת עלייה במתח הבין-פאזלי עקב ספיגה של פפטידים שעברו הידרוליזה^9,12^, בעוד שליפוליזה גורמת לירידה תלולה מאוד במתח הבין-פאזי עקב ספיחה של מלחי מרה וליפאזות ¹³. החלפה תת-פאזית סופית עם נוזל מעיים מדלדלת את התמיסה הגדולה של חומר לא מעוכל/מעוכל ומקדמת ספיגה של תרכובות מסיסות וסילוק שומנים מעוכלים במיקסים של מיצלות. ניתן לכמת זאת על-ידי העלייה במתח הבין-פאזי שנרשמה (איור 4B).

לסיכום, התכנון הניסיוני המיושם בטיפת התליון כדי לדמות עיכול במבחנה בטיפה בודדת מאפשר למדוד השפעות מצטברות וסינרגיות כאשר תהליך העיכול מוחל ברצף על שכבת הביניים^{הראשונית 10}. הרכב של כל מדיה העיכול ניתן לכוונן בקלות כדי להסביר את המאפיינים של תנאי העיכול, כולל פתולוגיות במערכת העיכול או מדיה העיכול התינוק¹⁴. לאחר מכן, ניתן להשתמש בזיהוי המנגנונים הבין-פאזיים המשפיעים על פרוטאוליזה וליפוליזה כדי לווסת את העיכול על ידי הנדסה בין-פאזית של תחליבים. ניתן ליישם את התוצאות המתקבלות בתכנון מטריצות מזון חדשניות עם פונקציות מותאמות אישית כגון אלרגניות נמוכה, צריכת אנרגיה מבוקרת וירידה בעיכול 15,16,17,18,19^.

Protocol

1. רצף ניקוי לכל כלי הזכוכית המשמשים בניסויים מדעיים על פני השטח

קרצפו את כלי הזכוכית בתמיסת ניקוי מרוכזת (ראו טבלת חומרים) מדוללת במים (10%).
יש לשטוף היטב עם רצף של מי ברז, פרופנול, מים מזוקקים ומים אולטרה-טהורים. יש לייבש בתא ולאחסן בארון סגור עד לשימוש.

2. הכנת דוגמאות

הכינו מדיית עיכול מלאכותית בהתאם לפרוטוקולים המתוקננים^של INFOGEST ^11,20 (ראו טבלת חומרים). לפרטים, ראו טבלה 1 וכללו התאמות קטנות לדרישות העבודה הבין-פאזית למניעת זיהום פעיל של פני השטח ודילול דגימות (1:10)¹⁰.
הכן את פתרון האמולסיפייר לפי השלבים הבאים.
1. יש להכין 0.01 ליטר תמיסה מרוכזת של (1 ק"ג· L⁻¹) מתחלב או תערובת של מתחלבים (ראו טבלת חומרים) במאגר ראשוני (טבלה 1) ולשמור תחת תסיסה קלה למשך הלילה.
2. מדלל ל-0.1 ק"ג· L⁻¹ (או כנדרש) כדי להרוות את הממשק; להגיע לרמה מדומה במתח הבין-תאי לאחר שעה אחת של ספיחה באזור בין-פאזי קבוע בעקבות דו"ח²¹ שפורסם קודם לכן.
3. יש לשמור תחת תסיסה קלה במשך 15 דקות לפני השימוש.
לטהר את שלב השמן.
1. הכינו תערובת של שמן צמחי (חמניות, זית, טריולאין וכו ') ושרפים מטסיליקט מגנזיום (ראו טבלת חומרים) ביחס של 2:1 w/w בכוס גדולה. יש לשמור תחת תסיסה מכנית קלה למשך 3 שעות לפחות.
2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה מסחרית (ראו טבלת חומרים).
3. סנן את תערובת השמן תחת ואקום באמצעות מסנן מזרק (גודל נקבוביות 0.2 מיקרומטר) (ראו טבלת חומרים). יש לאחסן בבקבוקי ענבר נקיים אטומים ומבעבעים בחנקן עד לשימוש.

3. כיול וניקוי התמנון

יש לשטוף את כל הצינורות במים טהורים במיוחד על ידי קביעת רצף של ניקוי שני המזרקים וכל השסתומים דרך נימי (שסתומים 6/4) וליציאה החיצונית (שסתום 8-צבע כחול). בצע זאת על-ידי לחיצה על לחצן הניקוי בתיבת הדו-שיח השמאלית (איור משלים 1A).
בדקו את מתח הפנים⁷ של המים בטמפרטורת החדר על ידי יצירת טיפת מים ומדידה בזמן אמת במשך 5 דקות (איור משלים 1B, C).
1. הגדר את הצפיפות הדיפרנציאלית לאוויר-מים (0.9982 ק"ג· L⁻¹) בתיבת הדו-שיח השמאלית, איור משלים 1B.
מלאו את הקובט הנקי (זכוכית אופטית) ב-0.002 ליטר שמן צמחי נקי והניחו אותו במחזיק הקובט בתא התרמוסטטי (איור 3).
מכוונים את התרמוסטט ומאפשרים שיווי משקל טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
בדוק את המתח הבין-פאזי של שמן מים בטמפרטורת החדר⁷.
1. הגדר את הצפיפות הדיפרנציאלית למי שמן צמחיים (שמן זית: 0.800 ק"ג· L⁻¹) (איור משלים 1C).
2. להזריק 40 μL בקצב של 0.5 μL·s⁻¹ ולמדוד בזמן אמת כל שנייה עד סוף ההזרקה. זהו תהליך דינמי פשוט (איור משלים 1B, D).
3. התווה את המתח הבין-מרחבי כפונקציה של נפח טיפות בגיליון נתונים.
4. בדוק שטווח עוצמת הקול של הטיפות מספק ערך עבור המתח הבין-מרחבי ללא תלות בנפח הטיפות. התווה את האזור הבין-פאזלי כפונקציה של נפח טיפה.
5. תכנן תהליך המכיל שני שלבים (איור משלים 1B ואיור משלים 2A) בהתאם לשלבים הבאים.
  1. עם מזרק פנימי, להזריק נפח הכלול בטווח זה של מתח הדדי קבוע.
  2. שמור על האזור הבין-מרחבי קבוע בערך שנבחר בשלב 3.5.4 ורשום את המתח הבין-פאזי למשך 5 דקות⁷.

4. תכנות תהליך ניסיוני אחד ב-DINATEN לכל שלב במערכת העיכול

הערה: לפרמטרים של התהליך, ראה איור משלים 1B.

בצע את הבקרה הראשונית.
1. לצורך היווצרות טיפות, הזריקו 10 μL (±5 μL) של תמיסת מתחלב לתוך הנימי (שסתום 6) (איור משלים 2A).
2. רשום את הספיחה באזור בין-פאזי קבוע 21 מתוך 20 מ"מ 2 (±10 מ"מ²) למשך שעה אחת (איור משלים 2B).
3. רשום את הריאולוגיה המרחיבה⁸ (איור משלים 2C).
  1. הגדר את המשרעת של תנודה ל 1.25 μL, נקודה 10 שניות.
  2. הקלט את הספיחה באזור הבין-פאזי שנבחר (שלב 4.1.2) במשך 10 שניות.
  3. חזור על שלב 4.1.3 בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות ו- 100 שניות.
שיא עיכול קיבה.
1. הקלט את הספיחה²¹ באזור הבין-פאזי שנבחר במשך 10 שניות.
2. חילוף תת-פאזי⁷ עם נוזל בשסתום 2 (sSGF) ובאנזימי קיבה (טבלה 1) (איור משלים 2D).
  1. מלא את המזרק השמאלי משסתום 2. להזריק 125 μL לתוך שסתום 6-נימי עם מזרק שמאל ב 5 μL·s⁻¹.
  2. חלץ 125 μL מהנימי עם המזרק הימני ב-5 μL·s⁻¹. פרקו את המזרק הימני כדי לצאת משסתום 8. חזור על שלבים 4.2.2.1-4.2.2.2 10 פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה.
3. רשום את ספיחה²¹ באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך שעה אחת (איור משלים 2B).
4. רשום את הריאולוגיה המרחיבה⁸ (איור משלים 2C).
  1. הגדר את המשרעת של תנודה ל 1.25 μL, נקודה 10 שניות.
  2. רשום את ספיחת האזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 עבור 10 שניות. חוזרים על הפעולה בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות, 100 שניות.
שיא עיכול מעיים.
1. רשום את ספיחה²¹ באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 עבור 10 שניות (איור משלים 2B).
2. חילוף תת-פאזי⁷ עם נוזל בשסתום 3 (sSIF) ובאנזימי מעיים/מלחי מרה/פוספוליפידים (טבלה 1) (איור משלים 2D).
  1. מלא את המזרק השמאלי משסתום 2. להזריק 125 μL לתוך שסתום 6-נימי עם מזרק שמאל ב 5 μL·s⁻¹. חלץ 125 μL מהנימי עם המזרק הימני ב-5 μL·s⁻¹.
  2. פרקו את המזרק הימני כדי לצאת משסתום 8. חזור על שלבים 4.3.2.1-4.3.2.2 10 פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה.
3. רשום את ספיחה²¹ באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך שעה אחת.
4. רשום את הריאולוגיה המרחיבה⁸ (איור משלים 2C).
  1. הגדר את המשרעת של תנודה ל 1.25 μL, נקודה 10 שניות.
  2. רשום את הספיחה באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך 10 שניות.
  3. חוזרים על הפעולה בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות, 100 שניות.
הקלט את הספיגה בעקבות השלבים הבאים.
1. רשום את ספיחה²¹ באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 עבור 10 שניות (איור משלים 2B).
2. חילוף תת-פאזי⁷ עם נוזל בשסתום 5 (sSIF) (טבלה 1, איור משלים 2D).
  1. מלא את המזרק השמאלי משסתום 5. להזריק 125 μL לתוך שסתום 5-נימי עם מזרק שמאל ב 5 μL·s⁻¹.
  2. חלץ 125 μL מהנימי עם המזרק הימני ב-5 μL·s⁻¹. פרקו את המזרק הימני כדי לצאת משסתום 8. חזור על שלבים 4.4.2.1-4.4.2.2 10 פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה.
3. רשום את ספיחה²¹ באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך שעה אחת (איור משלים 2B).
4. רשום את הריאולוגיה המרחיבה⁸ (איור משלים 2C).
  1. לשמור על משרעת של 1.25 μL, תקופה 10 שניות.
  2. רשום את הספיחה באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך 10 שניות.
  3. חזור על שלב 4.4.4 בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות, 100 שניות.

5. הגדרת הניסוי

מלא את צינורות microcentrifuge עם מדיה העיכול המלאכותי ולחבר כל אחד מהם לשסתום המתאים על ידי צינורות המתאים.
מלאו את הצינורות בשסתומים 2-5 על ידי ניקוי משסתום 2, שסתום 3, שסתום 4 ושסתום 5 ליציאה החיצונית (שסתום 8) (איור משלים 1A).
מלאו את הצינורות בשסתום 1 על ידי ניקוי משסתום 1 לשסתום 6-נימי 5 פעמים.
מכניסים את הנימים לשלב השמן. טען את המזרק השמאלי עם שסתום 1 (פתרון ראשוני, טבלה 1).
התחל לעבד ברצף את שלב 4.1 הראשוני, שלב 4.2-קיבה, שלב 4.3-מעיים ושלב 4.4-ספיגה, תוך שמירת הנתונים בסוף כל תהליך.

6. חישוב הפרמטרים הריאולוגיים המרחיבים באמצעות תוכנת עיבוד התמונה CONTACTO⁸

הערה: לפרטים, ראה מלדונדו-ולדרמה ואח '⁸.

טען את התמונות המתאימות לתנודת האזור בתדר ואמפליטודה נתונה (איור משלים 3A).
לחץ על ריאולוגיה (איור משלים 3B) וקבל את הפרמטרים המרחיבים (איור משלים 3C).
העתק והדבק את התוצאות לתוך גיליון פריסת הנתונים.

7. התוויית תוצאות הניסוי

חשב מחדש את עמודת הזמן בכל אחד מהשלבים של תהליך העיכול על ידי הוספת הנתונים האחרונים של הזמן של השלב הקודם.
התווה את המתח הבין-תאי לעומת זמן התוסף עבור כל אחד משלבי תהליך העיכול שבו נעשה שימוש.
שרטטו את המתח הבין-מרחבי/גמישות וצמיגות הבין-פאזיים הסופיים המתקבלים בסוף כל שלב לעומת שלב העיכול: ראשוני, עיכול קיבה, עיכול תריסריון וספיגוע.

תוצאות

חלק זה מציג דוגמאות שונות לפרופילי עיכול שנמדדו באמצעות התמנון. המראה הכללי של התאמות פרופיל העיכול המדומה מוצג באיור 4B. המתח הבין-אישי מיוצג בדרך כלל כנגד הזמן בפרופיל העיכול. שלבי הפאזה/עיכול השונים הנחשבים מיוצגים בצבעים שונים. השלב הראשון יוצר את השכבה הראשונית ומתאים...

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול כללי למדידת עיכול במבחנה של שכבות בין-מרחביות באמצעות ציוד להטלת תליון. ניתן להתאים את הפרוטוקול לדרישות הספציפיות של הניסוי על ידי כוונון הרכב מאגרי העיכול, המבוססים על פרוטוקול INFOGEST^11,20 הרמוני כדי להקל על ההשוואה לספרות. ניתן לה?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי לא ידוע להם על אינטרסים כלכליים מתחרים או על קשרים אישיים שיכלו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי פרויקטים RTI2018-101309-B-C21 ו- PID2020-631-116615RAI00, במימון MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ועל ידי "ERDF דרך ליצור את אירופה". עבודה זו נתמכה (חלקית) על ידי הקבוצה לפיזיקה ביוקולואידית וזורמים (ref. PAI-FQM115) של אוניברסיטת גרנדה (ספרד).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	C4129	Enzyme
Beta-lactoglobulin	Sigma-Aldrich	L0130	Emulsfier
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Emulsfier
CaCl₂	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Electrolyte
Centrifuge	Kronton instruments	Centrikon T-124	For separating oil and resins
Citrus pectin	Sigma-Aldrich	P9135	Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS	Sigma	C3028	Enzyme
CONTACTO	University of Granada (UGR)		https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN	University of Granada (UGR)		https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase	Lipolytech	RGE15-1G	Enzyme
Human Serum Albumin	Sigma-Aldrich	70024-90-7	Emulsifier
INFOGEST			http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II	Sigma-Aldrich	L33126	Enzyme
Magnesium metasilicate resins	Fluka	1343-88-0	Resins to purify oil
Micro 90	International products	M-9051-04	Cleaner
NaCl	Sigma	7647-14-5	Electrolyte
NaH₂PO₄	Scharlau	10049-21-5	To prepare buffer
OCTOPUS	Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain)		Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil	Sigma-Aldrich	1514	oil
Pancreatic from porcine pancreas	Sigma	P7545-25 g	Enzyme
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	Enzyme
Pluronic F127	Sigma	P2443	Emulsifier
Pluronic F68	Sigma	P1300	Emulsfier
Sodium deoxycholate	Sigma		Bile salts
Sodium glycodeoxycholate	Sigma	C9910	Bile salts
Sodium taurocholate	Sigma	86339	Bile salts
Syringe Filter	Millex-DP	SLGP033R	Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426	Enzyme

References

McClements, D. J. The biophysics of digestion: Lipids. Current Opinion in Food Science. 21, 1-6 (2018).
McClements, D. J., Li, Y. Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components. Advances in Colloid and Interface Science. 159 (2), 213-228 (2010).
Corstens, M. N., et al. Food-grade micro-encapsulation systems that may induce satiety via delayed lipolysis: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2218-2244 (2017).
Aguilera-Garrido, A., del Castillo-Santaella, T., Galisteo-González, F., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Investigating the role of hyaluronic acid in improving curcumin bioaccessibility from nanoemulsions. Food Chemistry. 351, 129301 (2021).
Rodríguez Patino, J. M., Carrera Sánchez, C., Rodríguez Niño, M. R. Implications of interfacial characteristics of food foaming agents in foam formulations. Advances in Colloid and Interface Science. 140 (2), 95-113 (2008).
Wilde, P. J., Chu, B. S. Interfacial & colloidal aspects of lipid digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 165 (1), 14-22 (2011).
Cabrerizo-Vílchez, M. A., Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Neumann, A. W. Axisymmetric drop shape analysis as penetration Langmuir balance. Review of Scientific Instruments. 70 (5), 2438-2444 (1999).
Maldonado-Valderrama, J., Muros-Cobos, J. L., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Bile salts at the air-water interface: Adsorption and desorption. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 120, 176-183 (2014).
Maldonado-Valderrama, J., Terriza, J. A. H., Torcello-Gómez, A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. In vitro digestion of interfacial protein structures. Soft Matter. 9, 1043-1053 (2013).
Maldonado-Valderrama, J. Probing in vitro digestion at oil-water interfaces. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 39, 51-60 (2019).
Brodkorb, A., et al. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols. 14 (4), 991-1014 (2019).
del Castillo-Santaella, T., Maldonado-Valderrama, J., Molina-Bolivar, J. A., Galisteo-Gonzalez, F. Effect of cross-linker glutaraldehyde on gastric digestion of emulsified albumin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 145, 899-905 (2016).
Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C., Maldonado-Valderrama, J. Bile salts in digestion and transport of lipids. Advances in Colloid and Interface Science. 274, 102045 (2019).
Maldonado-Valderrama, J., Torcello-Gómez, A., del Castillo-Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Subphase exchange experiments with the pendant drop technique. Advances in Colloid and Interface Science. 222, 488-501 (2015).
Bellesi, F. A., Ruiz-Henestrosa, V. M. P., Maldonado-Valderrama, J., Del Castillo Santaella, T., Pilosof, A. M. R. Comparative interfacial in vitro digestion of protein and polysaccharide oil/water films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 161, 547-554 (2018).
Del Castillo-Santaella, T., Sanmartín, E., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Arboleya, J. C., Maldonado-Valderrama, J. Improved digestibility of β-lactoglobulin by pulsed light processing: A dilatational and shear study. Soft Matter. 10 (48), 9702-9714 (2014).
Infantes-Garcia, M. R., et al. In vitro gastric lipid digestion of emulsions with mixed emulsifiers: Correlation between lipolysis kinetics and interfacial characteristics. Food Hydrocolloids. 128, 107576 (2022).
del Castillo-Santaella, T., Cebrián, R., Maqueda, M., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Assessing in vitro digestibility of food biopreservative AS-48. Food Chemistry. 246, 249-257 (2018).
Torcello-Gómez, A., Maldonado-Valderrama, J., Jódar-Reyes, A. B., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Martín-Rodríguez, A. Pluronic-covered oil-water interfaces under simulated duodenal conditions. Food Hydrocolloids. 34, 54-61 (2014).
Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5 (6), 1113-1124 (2014).
Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Development of a constant surface pressure penetration langmuir balance based on axisymmetric drop shape analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 249 (2), 263-273 (2002).
del Castillo-Santaella, T., et al. Hyaluronic acid and human/bovine serum albumin shelled nanocapsules: Interaction with mucins and in vitro digestibility of interfacial films. Food Chemistry. 383, 132330 (2022).
Aguilera-Garrido, A., et al. Applications of serum albumins in delivery systems: Differences in interfacial behaviour and interacting abilities with polysaccharides. Advances in Colloid and Interface Science. 290 (5), 102365 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: