פיתוח טכניקה כירורגית לשתלים תת-רשתית בחולדות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הגישה הסקלרית להשתלת התקן תת-רשתית, טכניקה כירורגית אפשרית ליישום במודלים של מחלות רשתית בבעלי חיים במחקר.

Abstract

ניוון רשתית, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), הוא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם. מספר עצום של גישות ננקטו לפיתוח טיפולים מבוססי רפואה רגנרטיבית ל-AMD, כולל טיפולים מבוססי תאי גזע. מכרסמים כמודלים של בעלי חיים לניוון רשתית הם בסיס למחקר תרגומי, בשל הספקטרום הרחב של זנים המפתחים מחלות ניוון רשתית בשלבים שונים. עם זאת, חיקוי מתן טיפולי אנושי של שתלים תת-רשתית במכרסמים הוא מאתגר, בשל הבדלים אנטומיים כגון גודל העדשה ונפח הזגוגית. פרוטוקול כירורגי זה נועד לספק שיטה מונחית להשתלת שתלים בחלל התת-רשתית בחולדות. נכלל תיאור מקיף וידידותי למשתמש של השלבים הקריטיים. פרוטוקול זה פותח כהליך כירורגי חסכוני לשחזור במחקרים פרה-קליניים שונים בחולדות. נדרש מזעור נכון של שתל בגודל אנושי לפני ביצוע הניסוי הכירורגי, הכולל התאמות למידות השתל. נעשה שימוש בגישה חיצונית במקום הליך תוך-זגוגי כדי להעביר את השתל לחלל התת-רשתית. באמצעות מחט חדה קטנה מבוצע חתך סקלרלי ברביע העליון הטמפורלי, ואחריו פרצנטזיס להפחתת הלחץ התוך עיני, ובכך למזער את ההתנגדות במהלך ההשתלה הניתוחית. לאחר מכן, מתבצעת הזרקת תמיסת מלח מאוזנת (BSS) דרך החתך כדי להשיג היפרדות רשתית מוקדית (RD). לבסוף, מתבצעת החדרה והדמיה של השתל לחלל התת-רשתית. הערכה לאחר הניתוח של המיקום התת-רשתית של השתל כוללת הדמיה על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי (SD-OCT). מעקבי הדמיה מוודאים את היציבות התת-רשתית של השתל, לפני שהעיניים נקצרות ומקובעות לניתוח היסטולוגי.

Introduction

ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם. מספר האנשים שנפגעו מ-AMD בשנת 2020 נאמד ב-196 מיליון, וזה צפוי לגדול לכ-288 מיליון עד 2040¹. במהלך העשור האחרון, פותחו מספר טיפולים כדי להפחית את השינויים החזותיים הקשורים לשלבים המאוחרים של AMD, בעיקר כדי לטפל בהתפתחות והתקדמות הניאו-וסקולריזציה הכורואידית שנצפתה ב-AMD רטוב. לעומת זאת, הטיפול ב-AMD יבש, שבו תפקוד לקוי ואובדן של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) מתקדמים ל-RPE וניוון רשתית, הוערך כאחראי ל-85% עד 90% מ-AMD, עם שכיחות של 0.44% ברחבי העולם ^1,2. AMD תוארה כמחלה רב-גורמית עם גורמי גיל, גנטיקה וסביבה התורמים להופעת המחלה והתקדמותה; מספר טיפולים נמצאים בפיתוח כדי לטפל במסלולים הפתופיזיולוגיים השונים הקשורים למחלה זו³.

טיפול מבוסס תאי גזע פותח כאופציה טיפולית חדשה להחלפת ה-RPE הכושל ב-AMD⁴ יבש. למרות שהשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים עדיין נמצא בניסויים קליניים מוקדמים, הבטיחות הוכחה במספר ניסויים קליניים ^5,6,7. נכון להיום, ישנם שני מסלולים עיקריים לפריסת תאי גזע בחלל התת-רשתית: השעיה או החדרת מדבקה חד-שכבתית שנזרעה על שתל תואם ביולוגית 8,9,10,11,12. אסטרטגיות חדשות המשתמשות בטיפולים מבוססי תאי גזע במחקרים פרה-קליניים דורשות מודלים של בעלי חיים שבהם ניתן להעביר את הטיפולים המבוססים על תאי גזע לאותו אתר ממוקד כפי שתוכנן בבני אדם. ההבדל באנטומיה עשוי לחייב שינויים קלים בהליכים, בציוד הכירורגי ובגישה בהשוואה לאלה ששימשו במוצר האנושי הסופי^13,14. שינוי הטכניקות הכירורגיות של העיניים הוא אחד השינויים הנדרשים שתוארו באופן נרחב כגישה מוצלחת לשימוש במודלים שונים של בעלי חיים 15,16,17.

למרות שפרסומים קודמים הזכירו טכניקות כירורגיות לשתלים תת-רשתית בחולדות, אין תיאורים מקיפים של טכניקות כאלה כדי להתגבר על הקשיים הטכניים שחוקרים עלולים להיתקל בהם. לכן, יש צורך לתאר כראוי את הטכניקות הכירורגיות בפירוט, לספק שיטות עבודה מומלצות ולקחים שיש להימנע מהם, ובמידת הצורך לטפל בבעיות במהלך שלבים קריטיים לאורך ההליך. מטרת כתב יד זה היא לספק הנחיה מקיפה להשתלה כירורגית של השתל בחלל התת-רשתית בחולדות.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דרום קליפורניה (IACUC) ובוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והצהרת האגודה לחקר ראייה ורפואת עיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. בסך הכל נעשה שימוש ב-12 חולדות זכרות של הקולג' המלכותי לכירורגיה (RCS) במחקר הנוכחי. בעלי החיים גודלו במתקן בעלי החיים ונכללו במחקר לאחר שהגיעו לגיל 28 ± יום אחד לאחר הלידה. בוצעה בדיקת עיניים מלאה כדי לוודא את היעדר חריגות בעיניים. השתלים התת-רשתיים, ממברנות אולטרה-דקות העשויות מפארילן C ומצופות בוויטרונקטין, תוכננו על ידי ארגון מסחרי ספציפי (ראה טבלת חומרים). ממברנות אלו משכפלות ממברנות בגודל אנושי מבחינת העובי והחדירות שלהן (מסגרת רשת בעובי 6.0 מיקרומטר עם נקבוביות עגולות של 20 מיקרומטר באזורים האולטרה-דקים). מזעור האורך והרוחב (1.0 מ"מ × 0.4 מ"מ) מממברנות בגודל אנושי הושג כדי להתאים את השתלים התת-רשתית בתוך עיני המכרסמים¹⁸.

1. טיפול בבעלי חיים והכנה כירורגית

1. שקלו את החיה כדי לחשב את מינון ההרדמה והרדימו לפי שלב 1.2.
2. להרדים את בעל החיים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת של קטמין וקסילזין (35-50 מ"ג/ק"ג ו-5-10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה; ראה טבלת חומרים). יש להזריק עם מזרק של 1.0 מ"ל ומחט של 30 גרם.
3. טען מזרק נוסף של 1.0 מ"ל עם מחצית מכמות תערובת ההרדמה (קטמין וקסילזין) כדי לשמור על רמת ההרדמה הנכונה במהלך ההליך.
4. אשר הרדמה נאותה על ידי היעדר רפלקס דוושה (צביטת בוהן מוצקה).
5. כדי לדמיין כראוי את חלל הזגוגית והרשתית, יש להרחיב את האישון על ידי החדרת טיפות עיניים של 1% טרופיקמיד ו-2.5% פנילפרין (ראה טבלת חומרים) בעין המטופלת.
   1. יש למרוח מנה שנייה של טיפות עיניים להרחבה לאחר 5 דקות.
6. מרחו דמעות מלאכותיות או ג'ל סיכה לעיניים בעין הלא ניתוחית כל 5-10 דקות בזמן שהחיה מורדמת כדי להרטיב את הקרנית.
7. הניחו וילון סטרילי מעל כרית החימום (ראו טבלת חומרים). הניחו וילון סטרילי המכסה את מגש הניתוח.
8. הכן את אזור הניתוח הסטרילי על ידי הנחת המכשירים הסטריליים הבאים על מגש הניתוח: כפפות כירורגיות, שתל תת-רשתית וכלים כירורגיים: מלקחיים נגד יתושים (3), מספריים עדינים מיקרו-כירורגיים (1), מחזיק מחט (1), מלקחיים עדינים עם שיניים (1), מלקחיים ישרים עדינים ללא שיניים (2), מזרק מיקרוליטר (1), מחט קהה 32 גרם (1), מחט 27 גרם או 30 גרם (2), 4-0 תפר משי (3), צמר גפן, תמיסת מלח מאוזנת (BSS) והחלקת כיסוי (ראה טבלת חומרים).
9. בתנאים סטריליים ובאמצעות כפפות סטריליות, טען את מזרק המיקרוליטר עם ה-BSS והצמד את המחט הקהה 32 G.
10. הכנס את החלפת הכותנה לרכזת המחט של 27 גרם או 30 גרם כדי ליצור ידית למניפולציה רגישה יותר של המחט.
11. כדי לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל ההליך, החלף את הכפפות הסטריליות אם מבצעים מניפולציות על מכשירים או אזורים לא סטריליים, כגון המיקרוסקופ הכירורגי.

2. גישה סקלרלית להשתלה תת-רשתית: טכניקה כירורגית

1. חשוף את אזור הניתוח לפי השלבים הבאים.
   1. ברגע שהחיה נמצאת תחת הרדמה והאישון מורחב (שלב 1.5), הניחו את בטן החיה כלפי מטה עם הראש לכיוון החוקר.
      הערה: שמור את החולדה על כרית החימום מכוסה בווילון סטרילי במהלך כל הניתוח ועד שהחיה תתאושש לחלוטין.
   2. יש למרוח טיפות 5% פובידון (ראו טבלת חומרים) על העין ולנקות את פני העין והעפעפיים בעזרת צמר גפן.
   3. הנח והתאם את המיקרוסקופ הכירורגי (ראה טבלת חומרים) מעל העין הניתוחית.
      הערה: מומלץ להשתמש במיקרוסקופ עיניים כירורגי לאורך כל ההליך הכירורגי כדי לקבל הדמיה חדה וגדולה יותר של מבני העין.
   4. הקפידו על חשיפה נכונה של אזור הניתוח על ידי הרמת העפעף העליון והבלטת גלגל העין באמצעות 4-0 תפרים שאינם נספגים.
      1. הרם את העפעף העליון באמצעות תפר משי 4-0. הנח את התפר בצד הקדמי של העפעפיים בגובה בלוטות המייבומיאן. אבטח את תפר המתיחה על ידי הידוק מלקחיים נגד יתושים למשטח הניתוח.
         הערה: אם התפר ממוקם גבוה יותר ממפלס בלוטת המייבומיאן, תתרחש היפוך של העפעף במקום הרמת העפעפיים.
      2. בצע פריטומיה של הרביע העליון הטמפורלי באמצעות מספריים עדינים מיקרו-כירורגיים.
      3. הנח שני תפרי מתיחה כדי לאפשר בליטה ותזוזה קדימה של גלגל העין. בצע בידוד של שריר פי הטבעת העליון.
         1. באמצעות מניפולציה עדינה של העין עם מלקחיים עדינים (מלקחיים של 0.12 מ"מ) בהיבט העליון של הלימבוס, גלגל את העין כלפי מטה כדי לחשוף את הסקלרה.
         2. הנח תפר משי 4-0 מאחורי הלימבוס העליון במרחק של עד 1 מ"מ, שהוא המיקום של השריר החוץ עיני העליון. מהדקים את שני זנבות התפר באמצעות מלקחיים נגד יתושים.
      4. בצע בידוד שרירי פי הטבעת הטמפורלי. הניחו תפר שני (4-0 משי) במרחק של עד 1 מ"מ מהלימבוס ברביע הטמפורלי (באזור המתאים של השריר החוץ-עיני הטמפורלי). מהדקים את שני זנבות התפר באמצעות מלקחיים נגד יתושים.
      5. לאחר ששני תפרי השרירים החוץ-עיניים ממוקמים כראוי ומהודקים, משוך את התפרים כלפי מטה ופנימה כדי לחשוף את הרביע העליון הטמפורלי של הסקלרה.
   5. הרחב את הצפק לכיוון החלק האחורי של העין בעזרת מספריים עדינים מיקרו-כירורגיים.
   6. שלוט בדימום הלחמית באמצעות צמר גפן.
2. בצע חתך סקלרלי, ניתוק רשתית (RD) והחדרת שתל לפי השלבים הבאים.
   1. בצע חתך סקלרלי באמצעות מחט של 27 גרם או 30 גרם. ודא שגודל החתך הוא ~1.2 מ"מ והוא 1.5 מ"מ אחורי הלימבוס.
      הערה: מומלץ לפתח תצורת חתך סקלרלי דמוי מנהרה כדי לייצב מבנים תוך עיניים תוך מניפולציה של העין והחדרת השתל. צורת חתך זו תמנע תנודות פתאומיות בלחץ התוך עיני.
   2. לפעמים, תצורה נכונה דורשת תרגול. לכן, אם לא מושגת תצורה נכונה, שחרר מתח מסוים מתפרי המתיחה של השרירים החוץ-עיניים כדי להקל על שמירת מבני העיניים בתוך חלל הזגוגית.
   3. על ידי שימוש באותה מחט המשמשת לחתך הסקלרי (27 גרם או 30 גרם), בצע פרצנטזיס בקרנית ההיקפית באותו רבע.
   4. הכנס את המחט הקהה 32 G המותקנת על מזרק מיקרוליטר דרך החתך הסקלרלי.
   5. הזרקת 100 מיקרוליטר של BSS ליצירת RD מוקדי.
   6. שחרר את תפרי המתיחה של השרירים החוץ-עיניים כדי להחזיר את העין למצב הרגיל.
   7. להדמיה ישירה של ה-RD, הניחו והחזיקו את החלקה של הכיסוי, עמוסה בג'ל סיכה עיניים, על הקרנית.
   8. כוונן את מטרת המיקרוסקופ כדי להתמקד ברשתית.
   9. אם ה-RD לא נצפה או שהוא קטן מדי (קטן מגודל של רבע אחד), בצע הזרקה שנייה של BSS כדי להשיג את גודל ה-RD הרצוי על ידי גלגול העין כלפי מטה ופנימה וחזרה על שלבים 2.2.4 עד 2.2.8.
   10. לאחר השלמת ה-RD, ודא את אורך הסקלר (כפי שהוזכר בשלב 2.2.1) עם קליפר (ראה טבלת חומרים).
   11. חותכים את הרקמה הכורואידית לשני הכיוונים בעזרת מספריים מיקרוכירורגיים עדינים.
   12. העבירו את המחט הקהה הצידה לאורך החתך הסקלרלי כדי לוודא שכל המבנים הסקלריים והכורואידליים נותחו.
   13. הכנס את השתל לחלל התת-רשתית.
   14. בעזרת שני מלקחיים כירורגיים עדינים, כגון קשירת מלקחיים (ראה טבלת חומרים), תפסו את השתל מאחור כדי לא לפגוע בחלק הפעיל של השתל.
   15. הנח את השתל במקביל למישור החתך והחלק בעדינות פנימה את השתל.
   16. לאחר שהשתל הוכנס במלואו לחלל התת-רשתית, שחרר אותו ודחף את השתל פנימה על ידי החדרת הלסתות של אחד המלקחיים 1-1.5 מ"מ לתוך החתך.
   17. שחרר את תפרי המתיחה של השריר החוץ-עיני וודא את מיקום השתל באמצעות המיקרוסקופ וכיסוי הכיסוי כמתואר לעיל (שלבים 2.2.7 ו-2.2.8).
3. שחרר והסר את כל התפרים.
   הערה: לאחר סיום ההליך הכירורגי, מבוצע SD-OCT (שלב 3) כדי לאמת את הממצאים הקליניים. מפגש ההדמיה SD-OCT מתבצע מיד לאחר הניתוח. אם לא הושגה הדמיה נכונה של מיקום השתל, יש לבצע את ה-SD-OCT שוב 7-10 ימים לאחר הניתוח.

3. הדמיית SD-OCT

1. לחץ על סמל Heidelberg Eye Explorer (תוכנה לניהול תמונות; ראה טבלת חומרים) במסך שולחן העבודה.
2. לחץ על סמל המטופל החדש בחלק העליון של המסך.
   1. מלא את כל המידע המבוקש כדי להפיק את מזהה החיה ולחץ על קבל.
   2. בחר את מערכת ההדמיה OCT (HRA + OCT; ראה טבלת חומרים) עבור סוג המכשיר.
   3. בחר את המפעיל ולחץ על אישור.
   4. לאפשרות העקמומיות הנכונה של הקרנית, לחץ על כפתור אישור כדי לקבל נתוני עין המוגדרים כברירת מחדל.
3. ודא שחלון הרכישה של SD-OCT מופעל ומוכן ל-SD-OCT.
4. הפעל את מצלמת SD-OCT על ידי לחיצה על כפתור התחל הצהוב הממוקם בתצוגת מסך המגע לצד המצלמה.
5. הנח את בעל החיים על במת בעלי החיים SD-OCT שהותאמה על גבי משענת הראש SD-OCT.
   הערה: התאמת שלב בעלי החיים כוללת חתיכת קצף פוליסטירן (ראה טבלת חומרים) כדי להתאים לראש SD-OCT stage גדול מספיק כדי להניח עליו את החיה, כולל כרית החימום.
6. כוונן את גובה השולחן ואת מיקום החיה כדי ליישר את האישון עם מרכז עדשת SD-OCT.
   הערה: לאחר יישור העין, תופיע תמונה חיה אינפרא אדום (IR) על המסך.
7. לחץ על כפתור IR + OCT במסך המגע או על כפתור OCT בפינה השמאלית התחתונה של הצג כדי להתחיל ברכישת התמונה.
8. לאחר שה-SD-OCT עולה לאוויר, בחר מצב סריקה יחיד עם המספר הגבוה ביותר (100) של מסגרות ART. מצב הסריקה של 100 ART הוא מצב ברירת המחדל.
9. באמצעות הג'ויסטיק של המצלמה, מרכז את עצב הראייה על תמונת ה-IR.
10. דחוף את המצלמה קדימה עד שתמונת ה-IR תתמלא באופן שווה בתמונת הרשתית.
    הערה: פינות כהות מצביעות על כך שהמצלמה רחוקה מדי או קרובה מדי לעין.
11. הזז את המצלמה הצידה עד שהשתל נראה בהיבט הטמפורלי של הרשתית. השתמש בתמונת ה-IR כדי להנחות את התנועות.
12. כדי לדמיין את השתל על ידי סריקת B, לחץ על CTRL + ALT + SHIFT + O בו-זמנית כדי להציג את חלון התאמת סריקת B SD-OCT.
13. כוונן את "זרוע הייחוס" (בתחתית החלון) עד שהרשתית/השתל יודגמו בתמונת SD-OCT.
    הערה: יש להציג את תמונת SD-OCT בפינות הייחוס הכחולות.
14. סגור את החלון.
15. באמצעות הג'ויסטיק וידית המצלמה, החלק וסובב את המצלמה לכל הכיוונים עד לקבלת תמונה טובה יותר, שטוחה וחדה יותר באיכות SD-OCT.
16. גרור את החץ הכחול בתמונת ה-IR עד שהוא מונח לאורך השתל.
17. לאחר שהרוויה והמיקום של סריקת B אופטימליים, הפעל את "מעקב אוטומטי בזמן אמת (ART)" על ידי לחיצה על כפתור בקרת הרווח השחור מתחת למסך המגע.
18. ברגע שה-ART מגיע ל-100 פריימים, לחץ על Acquire במסך המגע.
19. לאחר שכל התמונות נרכשו, לחץ על שמור תמונות בחלק העליון של החלון ולאחר מכן לחץ על יציאה.
20. שמור על לחות הקרנית במהלך כל סשן ההדמיה על ידי מריחת טיפות עיניים סיכה לעתים קרובות (כל 5 דקות).

4. התאוששות בעלי חיים

1. בתום מפגש ההדמיה יש למרוח משחה אנטיביוטית על הקרנית כדי למנוע זיהום בעיניים ולהרטיב את הקרנית.
2. השאר את החיה מונחת על בטנה על כרית החימום עד להתאוששות מלאה (~20-30 דקות) ואמבולטורית.
3. תן משככי כאבים סיסטמיים (1.0-1.2 מ"ג/ק"ג בופרנורפין SR לאחר תת עורית; ראה טבלת חומרים) בסוף ההליך הכירורגי.
4. אל תשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת.
5. אין להחזיר את החיה לחברת בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
6. לאחר התאוששות מלאה, החזירו את החיה לאזור המגורים עם גישה למזון ומים אד ליביטום.

תוצאות

השתלת שתל תת-רשתית בחולדות RCS (N = 12) הדגימה את ההיתכנות והשחזור של הטכניקה הכירורגית ללידה תת-רשתית בחולדות. במחקר זה, העין הימנית הייתה העין המטופלת (N = 12) עם השתל. בהערכה הקלינית שבוצעה בתום ההליך באמצעות המיקרוסקופ הכירורגי, תשע מתוך 12 העיניים שטופלו הדגימו לוקליזציה תת-?...

Discussion

למרות שההליך תואר בעבר בשינויים קלים, היקף כתב היד הזה הוא לספק תיאור מקיף של הליך כירורגי לשתלים תת-רשתית בחולדות שיש לעקוב אחריו תוך כדי לימוד הטכניקה ולהתגבר על האתגרים הכירורגיים והסיבוכים הפוטנציאליים שהחוקרים עלולים להיתקל בהם. הפרוטוקול הכירורגי המתואר כאן כולל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe	VWR	BD309659
27 G needle 1/2''	VWR	BD305109
30 G needle 1/2''	VWR	BD305106
32 G Blunt needle - Small hub RN	Hamilton	7803-04
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5	Ethicon	1984G
6'' sterile cotton tips	VWR	10805-154
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution	Alcon	8007-1
BSS irrigating solution 15 mL	Accutome	Ax17362
Buprenorphine ER	ZooPharm	N/A
Castroviejo Caliper	Storz	E2405
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm	Storz	E1796
Clayman-Vannas scissors straight	Storz	E3383S
Cover glass, square	WVR	48366-227
EPS Polystyrene block	Silverlake LLC	CFB8x12x2
Gonak 15 mL	Accutome	Ax10968	Eye lubricant
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic	Storz	E6772
Hamilton syringe 700 series 100 µL	Hamilton	7638-01
HEYEX Software	Heidelberg	N/A	an image management software
Kelman-McPherson tying forceps angled	Storz	E1815 AKUS
Ketamine (100 mg/mL)	MWI	501072
Needle holder 9mm curved fine locking	Storz	3-302
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g	Accutome	Ax0720
Ophthalmic surgical microscope	Zeiss	SN: 233922
Phenylephrine 2.5% 15 mL	Accutome	Ax0310
Spectralis SD-OCT	Heidelberg	SPEC-CAM-011210s3600
Sterile Drape	VWR	100229-300
Sterile surgical gloves	VWR	89233-804
T-Pump heating system	Gaymar	TP650
Tropicamide 1% 15 mL	Accutome	Ax0330
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin	Mini Pumps LLC, CA	specifically designed for this study	used as subretinal implants
Xylazine (100 mg/mL)	MWI	510650