ラットにおける網膜下インプラントの手術技術の開発

要約

現在のプロトコルは、網膜下デバイスの移植のための強膜アプローチ、研究中の網膜疾患の動物モデルでの実装のための実行可能な外科的技術について説明します。

要約

加齢黄斑変性症(AMD)などの網膜変性症は、世界中で失明の主な原因となっています。幹細胞ベースの治療を含む、AMDの再生医療ベースの治療法を開発するために、無数のアプローチが行われています。網膜変性の動物モデルとしてのげっ歯類は、さまざまな段階で網膜変性疾患を発症する幅広い株があるため、トランスレーショナルリサーチの基盤です。しかし、げっ歯類における網膜下インプラントのヒト治療送達を模倣することは、レンズサイズや硝子体容積などの解剖学的な違いにより困難です。この外科的プロトコルは、ラットの網膜下腔にインプラントを移植するためのガイド付き方法を提供することを目的としています。重要なステップのユーザーフレンドリーな包括的な説明が含まれています。このプロトコルは、ラットのさまざまな前臨床試験で再現性を高めるための費用対効果の高い外科的処置として開発されました。手術実験を行う前に、インプラントの寸法の調整など、人間サイズのインプラントの適切な小型化が必要です。硝子体内処置の代わりに外部アプローチを使用して、インプラントを網膜下腔に送達します。小さな鋭い針を使用して、側頭上象限で強膜切開を行い、続いて眼圧を下げるための穿刺を行い、それによって外科的移植中の抵抗を最小限に抑えます。次に、切開部からの平衡塩溶液(BSS)注入を行い、限局性網膜剥離(RD)を達成します。最後に、インプラントの網膜下腔への挿入と視覚化が行われます。インプラントの網膜下配置の術後評価には、スペクトル領域光干渉断層撮影法 (SD-OCT) によるイメージングが含まれます。イメージングのフォローアップでは、組織学的分析のために眼球を採取して固定する前に、インプラントの網膜下安定性を確認します。

概要

加齢性黄斑変性症(AMD)は、世界中で失明の主な原因です。2020年にAMDに罹患した人の数は1億9,600万人と推定され、これが2040年までに約2億8,800万人に増加すると予測^{されています1}。過去 10 年間で、AMD の後期段階に関連する視覚変化を緩和するためのいくつかの治療法が開発されてきました。これは主に、滲出型 AMD で観察される脈絡膜新生血管の進行と進行を治療するためです。逆に、網膜色素上皮(RPE)細胞の機能不全と喪失がRPEと網膜萎縮に進行する乾性AMDの治療は、AMDの85%から90%を占めると推定されており、世界中での有病率は0.44%です^1,2。AMDは、年齢、遺伝的、および環境的要因が疾患の発症と進行に寄与する多因子性疾患として説明されています。この疾患に関連するさまざまな病態生理学的経路に対処するために、いくつかの治療法が開発されています³。

幹細胞ベースの治療は、乾性AMD⁴のRPEの失敗を置き換える新しい治療オプションとして開発されました。多能性幹細胞の使用はまだ初期の臨床試験段階にありますが、安全性はいくつかの臨床試験で実証されています^5,6,7。今日まで、幹細胞を網膜下腔に展開するための2つの主要な経路がある:懸濁液または生体適合性インプラント8,9,10,11,12に播種された単層パッチの挿入である。前臨床試験で幹細胞ベースの治療を使用する新しい戦略には、幹細胞ベースの治療薬をヒトで意図したのと同じ標的部位に送達できる動物モデルが必要です。解剖学的構造の違いは、最終的な人間の製品^13,14で使用されるものと比較して、手順、手術器具、およびアプローチにわずかな変更を必要とするかもしれません。眼科手術技術の変更は、異なる動物モデル15,16,17で使用するための成功したアプローチとして広く説明されている必要な変更の1つである。

以前の出版物では、ラットの網膜下インプラントの外科的技術について言及されていますが、研究者が遭遇する可能性のある技術的困難を克服するためのそのような技術についての包括的な説明はありません。したがって、外科的技術を詳細に適切に説明し、回避するためのベストプラクティスと学んだ教訓を提供し、必要に応じて、手順全体の重要なステップ中の問題に対処する必要があります。この原稿の目的は、ラットの網膜下腔へのインプラントの外科的移植に関する包括的なガイドラインを提供することです。

プロトコル

すべての実験は、南カリフォルニア大学の動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所(NIH)の実験動物の管理と使用に関するガイドおよび眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO(The Association for Research in Vision and Ophthalmology)の声明に従って実施されました。本研究では、合計12匹のRoyal College of Surgeon(RCS)雄ラットが使用されました。動物は動物施設で飼育され、生後1日±28歳に達すると研究に含まれました。眼科の完全検査を実施し、眼の異常がないことを確認しました。網膜下インプラントは、パリレンCから作られ、ビトロネクチンでコーティングされた極薄の膜で、特定の商業組織によって設計されました( 材料の表を参照)。これらの膜は、その厚さと透過性の点で人間サイズの膜を再現しています(厚さ6.0μmのメッシュフレームと極薄領域に20μmの円形の細孔)。ヒトサイズの膜からの長さと幅(1.0mm×0.4mm)の小型化は、げっ歯類の眼¹⁸内の網膜下インプラントを収容するために達成された。

1.動物の世話と手術の準備

1. 動物の体重を量り、麻酔の投与量を計算し、ステップ1.2に従って麻酔をかけます。
2. ケタミンとキシラジンの混合物(それぞれ35-50 mg / kgおよび5-10 mg / kg)の腹腔内注射により動物に麻酔をかけます。1.0mLのシリンジと30Gの針で注入します。
3. 処置中に適切な麻酔レベルを維持するために、麻酔の混合物(ケタミンとキシラジン)の半分の量で別の1.0mLシリンジをロードします。.
4. ペダル反射(つま先をしっかりとつまむ)がないことにより、適切な麻酔を確認します。
5. 硝子体腔と網膜を適切に視覚化するには、治療した眼に1%トロピカミドと2.5%フェニレフリン点眼薬( 材料の表を参照)を点眼して ?? 孔を拡張します。.
   1. 5分後に2回目の拡張点眼薬を塗布します。
6. 動物が角膜に潤いを与えるために麻酔をかけられている間、5〜10分ごとに非外科的眼に人工涙液または眼潤滑剤ジェルを塗布します。
7. 加熱パッドの上に滅菌ドレープを置きます( 材料の表を参照)。手術用トレイを覆う滅菌ドレープを置きます。
8. 手術用手袋、網膜下インプラント、手術器具:蚊鉗子(3)、顕微手術用ハサミ(1)、ニードルホルダー(1)、歯付き細い鉗子(1)、歯のない細いストレート鉗子(2)、マイクロリットル注射器(1)、32Gの鈍い針(1)、27Gまたは30Gの針(2)、 4-0シルク縫合糸(3)、綿棒、バランス塩溶液(BSS)、およびカバースリップ( 材料の表を参照)。
9. 滅菌条件下で滅菌手袋を使用して、マイクロリットルシリンジにBSSをロードし、32Gの鈍針を取り付けます。
10. コットンスワップを27Gまたは30Gのニードルハブに挿入して、針をより敏感に操作するためのハンドルを作成します。
11. 手術中ずっと無菌状態を維持するために、手術用顕微鏡など、非滅菌器具や領域を操作する場合は、滅菌手袋を交換してください。

2. 網膜下移植のための強膜アプローチ:外科的手技

1. 以下の手順に従って手術部位を露出させます。
   1. 動物が麻酔下に置かれ、瞳孔が拡張したら(ステップ1.5)、動物の腹を下にして、頭を研究者に向けて置きます。
      注:手術全体を通して、動物が完全に回復するまで、ラットを加熱パッドに滅菌ドレープで覆ったままにしてください。
   2. 5%ポビドンドロップ( 材料の表を参照)を目に塗り、綿棒で目の表面とまぶたをきれいにします。.
   3. 手術用顕微鏡( 材料の表を参照)を手術用眼の上に置いて調整します。
      注:眼の構造をより鮮明で大きく視覚化するために、外科的処置全体を通して外科用眼科用顕微鏡を使用することをお勧めします。
   4. 上まぶたを持ち上げ、4-0非吸収性縫合糸を使用して眼球を突き出すことにより、手術領域の適切な露出を確保します。
      1. 4-0シルク縫合糸を使用して上まぶたを持ち上げます。縫合糸をまぶたの前面のマイボーム腺のレベルに配置します。蚊の鉗子を手術面に固定して、牽引縫合糸を固定します。
         注:縫合糸がマイボーム腺のレベルよりも高い位置に配置されると、まぶたの隆起ではなく、まぶたの外転が発生します。
      2. 顕微鏡手術用細いハサミを使用して、側頭上象限のペリトミーを行います。
      3. 眼球の突出と前方への変位を可能にするために、2つの牽引縫合糸を配置します。上直筋の分離を行います。
         1. リンバスの上面にある細い歯の鉗子(0.12mm鉗子)で目を優しく操作することにより、目を下に転がして強膜を露出させます。
         2. 上眼球筋の位置である上輪部の後ろに、最大1mm離れた場所に4-0シルク縫合糸を配置します。蚊の鉗子を使用して縫合糸の両側をクランプします。
      4. 側頭直筋の分離を行います。2番目の縫合糸(4-0シルク)を、側頭象限(側頭外眼筋の対応する領域)の輪部から最大1 mm離して配置します。蚊の鉗子を使用して縫合糸の両側をクランプします。
      5. 両方の外眼筋縫合糸が適切に配置され、固定されたら、縫合糸を内側に引き下げて、強膜の側頭上象限を露出させます。
   5. マイクロサージェリーの細いハサミで眼の後ろに向かってペリトミーを伸ばします。
   6. 綿棒を使用して結膜出血を制御します。
2. 以下の手順に従って、強膜切開、網膜剥離(RD)、およびインプラント挿入を行います。
   1. 27Gまたは30Gの針を使用して強膜切開を行います。切開部のサイズが ~1.2 mm で、辺縁部の後方 1.5 mm にあることを確認します。
      注:眼を操作してインプラントを導入しながら眼内構造を安定させるために、トンネル状の強膜切開構成の開発が推奨されます。この切開形状により、眼圧の急激な変動を防ぐことができます。
   2. 適切な構成には練習が必要な場合があります。したがって、適切な構成が達成されない場合は、眼球構造を硝子体腔内に保持するのを容易にするために、外眼筋牽引縫合糸からいくらかの張力を解放します。
   3. 強膜切開に使用したのと同じ針(27Gまたは30G)を使用して、同じ象限の角膜末梢で穿刺を行います。
   4. マイクロリットルの注射器に取り付けられた32Gの鈍い針を強膜切開部に挿入します。
   5. 100 μL の BSS を注入して、フォーカル RD を作成します。
   6. 外眼筋牽引縫合糸を離して、目を通常の位置に戻します。
   7. RDを直接視覚化するには、眼科用潤滑剤ゲルを充填したカバースリップを角膜に載せて保持します。
   8. 顕微鏡の対物レンズを調整して、網膜に焦点を合わせます。
   9. RDが観察されないか、小さすぎる(1つの象限のサイズより小さい)場合は、BSSの2回目の注入を実行して、アイを内側に回転させ、手順2.2.4から2.2.8を繰り返すことにより、目的のRDサイズを達成します。
   10. RDが完了したら、キャリパー( 材料の表を参照)で強膜の長さ(ステップ2.2.1で説明したように)を確認します。
   11. 細い顕微手術用ハサミで脈絡膜組織を両方向に切断します。
   12. 鈍い針を強膜切開部に沿って横に走らせて、すべての強膜および脈絡膜の構造が解剖されたことを確認します。
   13. インプラントを網膜下腔に挿入します。
   14. 結束鉗子( 材料の表を参照)などの2つの細かい外科用鉗子を使用して、インプラントのアクティブ部分を損傷しないように、インプラントを背面からつかみます。
   15. インプラントを切開面と平行に置き、インプラントをそっとスライドさせます。
   16. インプラントが網膜下腔に完全に導入されたら、インプラントを解放し、鉗子の1つの顎を切開部に1〜1.5mm導入してインプラントをさらに押し込みます。
   17. 外眼筋牽引縫合糸をリリースし、上記のように顕微鏡とカバーガラスを使用してインプラントの配置を確認します(ステップ2.2.7および2.2.8)。
3. すべての縫合糸を解放して取り外します。
   注: 外科的処置の終了後、SD-OCT が実行され (ステップ 3)、臨床所見が検証されます。SD-OCTイメージングセッションは、手術直後に行われます。インプラントの位置を適切に視覚化できなかった場合は、手術後7〜10日後に再度SD-OCTを実施します。

3. SD-OCTイメージング

1. デスクトップ画面の Heidelberg Eye Explorer アイコン(画像管理ソフトウェア、 資料表を参照)をクリックします。
2. 画面上部の 「新規患者 」アイコンをクリックします。
   1. 動物IDを生成するために要求されたすべての情報を入力し、[同意する]をクリックします。
   2. デバイスタイプとして、OCTイメージングシステム(HRA + OCT、 材料表を参照)を選択します。
   3. オペレーターを選択し、[ OK]を押します。
   4. 角膜の湾曲を正しいオプションにするには、 OK ボタンを押してデフォルトの目のデータを受け入れます。
3. SD-OCT 取得ウィンドウが起動し、SD-OCT の準備ができていることを確認します。
4. カメラの横にあるタッチスクリーンディスプレイにある黄色の スタート ボタンを押して、SD-OCTカメラの電源を入れます。
5. SD-OCTヘッドレストの上に装着されたSD-OCTアニマルステージに動物を置きます。
   注:動物ステージの適応には、加熱パッドを含む動物を置くのに十分な大きさのSD-OCTヘッドステージ内に収まる発泡スチロール( 材料の表を参照)が含まれています。
6. テーブルの高さと動物の位置を調整して、瞳孔をSD-OCTレンズの中心に合わせます。
   注意: 目の位置が揃うと、赤外線(IR)ライブ画像が画面に表示されます。
7. タッチスクリーンの IR + OCT ボタンまたはモニターの右下にある OCT ボタンを押して、画像取得を開始します。
8. SD-OCT がライブになったら、ART フレームの数が最も多い 100 の 1 つのスキャン モードを選択します。100 ARTスキャンモードがデフォルトのモードです。
9. カメラのジョイスティックを使用して、視神経をIR画像の中央に配置します。
10. IR画像が網膜画像で均一に満たされるまで、カメラを前方に押します。
    注意: 暗いコーナーは、カメラが遠すぎるか、目に近すぎることを示しています。
11. インプラントが網膜の時間的側面で視覚化されるまで、カメラを横に動かします。IR画像を使用して動きをガイドします。
12. B-スキャンでインプラントを視覚化するには、 CTRL + ALT + SHIFT + O を同時に押して、SD-OCT B-スキャン調整ウィンドウを表示します。
13. SD-OCT画像に網膜/インプラントが視覚化されるまで、「リファレンスアーム」(ウィンドウ下部)を調整します。
    メモ: SD-OCT 画像は、青色の参照コーナー内に表示する必要があります。
14. ウィンドウを閉じます。
15. ジョイスティックとカメラハンドルを使用して、カメラをあらゆる方向にスライドさせて回転させ、より良く、より平らで、より鮮明なSD-OCT品質の画像が得られます。
16. IR画像の青い矢印をドラッグして、インプラントに沿って配置します。
17. B-スキャンの彩度と配置が最適になったら、タッチスクリーンの下にある黒い ゲインコントロール ボタンを押して、「自動リアルタイムトラッキング(ART)」をアクティブにします。
18. ARTが100フレームに達したら、タッチスクリーンの Acquire を押します。
19. すべての画像を取得したら、ウィンドウ上部の[ 画像を保存 ]をクリックし、[ 終了]をクリックします。
20. イメージングセッション全体を通して、潤滑剤の点眼薬を頻繁に(5分ごとに)塗布することにより、角膜を湿らせておきます。

4. 動物の回復

1. イメージングセッションの最後に、角膜に抗生物質軟膏を塗布して、眼の感染を防ぎ、角膜に潤いを与えます。
2. 動物を完全に回復するまで(~20-30分)、歩行できるようになるまで、動物を温熱パッドの上で腹ばいにしてください。
3. 外科的処置の最後に全身性鎮痛薬(1.0-1.2 mg / kgブプレノルフィンSRを皮下投与; 材料の表を参照)を投与します。.
4. 動物が十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
5. 完全に回復するまで、動物を他の動物と一緒に戻さないでください。
6. 完全に回復したら、動物を住宅エリアに戻し、自由に餌 と水を手に入れることができます。

結果

RCSラット(N = 12)における網膜下インプラントの移植は、ラットにおける網膜下送達のための外科的技術の実現可能性および再現性を実証した。この研究では、右目をインプラントで治療した目(N = 12)でした。手術用顕微鏡を使用した処置の最後に実施された臨床評価では、治療された 12 個の眼のうち 9 個がインプラントの網膜下局在を示し (75.00%)、2 つの眼 (16.67%) が?...

ディスカッション

この手順は以前にわずかなバリエーションで説明されていましたが、この原稿の範囲は、技術を学びながら追跡するラットの網膜下インプラントの外科的手順の包括的な説明を提供し、研究者が遭遇する可能性のある外科的課題と潜在的な合併症を克服することです。ここで概説する外科的プロトコルには、数年前から私たちの研究室で広く利用されてきた極薄のパ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe	VWR	BD309659
27 G needle 1/2''	VWR	BD305109
30 G needle 1/2''	VWR	BD305106
32 G Blunt needle - Small hub RN	Hamilton	7803-04
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5	Ethicon	1984G
6'' sterile cotton tips	VWR	10805-154
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution	Alcon	8007-1
BSS irrigating solution 15 mL	Accutome	Ax17362
Buprenorphine ER	ZooPharm	N/A
Castroviejo Caliper	Storz	E2405
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm	Storz	E1796
Clayman-Vannas scissors straight	Storz	E3383S
Cover glass, square	WVR	48366-227
EPS Polystyrene block	Silverlake LLC	CFB8x12x2
Gonak 15 mL	Accutome	Ax10968	Eye lubricant
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic	Storz	E6772
Hamilton syringe 700 series 100 µL	Hamilton	7638-01
HEYEX Software	Heidelberg	N/A	an image management software
Kelman-McPherson tying forceps angled	Storz	E1815 AKUS
Ketamine (100 mg/mL)	MWI	501072
Needle holder 9mm curved fine locking	Storz	3-302
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g	Accutome	Ax0720
Ophthalmic surgical microscope	Zeiss	SN: 233922
Phenylephrine 2.5% 15 mL	Accutome	Ax0310
Spectralis SD-OCT	Heidelberg	SPEC-CAM-011210s3600
Sterile Drape	VWR	100229-300
Sterile surgical gloves	VWR	89233-804
T-Pump heating system	Gaymar	TP650
Tropicamide 1% 15 mL	Accutome	Ax0330
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin	Mini Pumps LLC, CA	specifically designed for this study	used as subretinal implants
Xylazine (100 mg/mL)	MWI	510650