Desenvolvimento de uma Técnica Cirúrgica para Implantes Sub-retinianos em Ratos

Resumo

O presente protocolo descreve a abordagem escleral para implante de dispositivo sub-retiniano, uma técnica cirúrgica viável para implementação em modelos animais de doenças retinianas em pesquisa.

Resumo

A degeneração da retina, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo. Uma miríade de abordagens foi realizada para desenvolver terapias baseadas em medicina regenerativa para DMRI, incluindo terapias baseadas em células-tronco. Os roedores como modelos animais para degeneração retiniana são uma base para a pesquisa translacional, devido ao amplo espectro de cepas que desenvolvem doenças de degeneração retiniana em diferentes estágios. No entanto, imitar a entrega terapêutica humana de implantes sub-retinianos em roedores é um desafio, devido a diferenças anatômicas, como tamanho do cristalino e volume vítreo. Este protocolo cirúrgico visa fornecer um método guiado para o transplante de implantes para o espaço sub-retiniano em ratos. Uma descrição abrangente e amigável das etapas críticas foi incluída. Este protocolo foi desenvolvido como um procedimento cirúrgico econômico para reprodutibilidade em diferentes estudos pré-clínicos em ratos. A miniaturização adequada de um implante de tamanho humano é necessária antes da realização do experimento cirúrgico, que inclui ajustes nas dimensões do implante. Uma abordagem externa é usada em vez de um procedimento intravítreo para entregar o implante ao espaço sub-retiniano. Com uma agulha pequena e afiada, é realizada uma incisão escleral no quadrante temporal superior, seguida de paracentese para reduzir a pressão intraocular, minimizando assim a resistência durante o implante cirúrgico. Em seguida, uma injeção de solução salina balanceada (BSS) através da incisão é realizada para atingir o descolamento focal da retina (RD). Por fim, são realizadas a inserção e visualização do implante no espaço sub-retiniano. A avaliação pós-operatória da colocação sub-retiniana do implante inclui imagens por tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT). Os acompanhamentos de imagem verificam a estabilidade sub-retiniana do implante, antes que os olhos sejam colhidos e fixados para análise histológica.

Introdução

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo. O número de pessoas afetadas com DMRI em 2020 foi estimado em 196 milhões, e deve aumentar para cerca de 288 milhões até 2040¹. Na última década, várias terapêuticas foram desenvolvidas para mitigar as alterações visuais associadas aos estágios tardios da DMRI, principalmente para tratar o desenvolvimento e a progressão da neovascularização coroidal observada na DMRI úmida. Por outro lado, estima-se que o tratamento da DMRI seca, em que a disfunção e a perda das células do epitélio pigmentar da retina (EPR) progridem para EPR e atrofia retiniana, sejam responsáveis por 85% a 90% da DMRI, com prevalência de 0,44% em todo o mundo ^1,2. A DMRI tem sido descrita como uma doença multifatorial com idade, fatores genéticos e ambientais que contribuem para o início e progressão da doença; Várias terapias estão em desenvolvimento para abordar as diferentes vias fisiopatológicas associadas a esta doença³.

A terapia baseada em células-tronco foi desenvolvida como uma nova opção terapêutica para substituir a falha do EPR na DMRI^{seca 4}. Embora o uso de células-tronco pluripotentes ainda esteja em ensaios clínicos iniciais, a segurança foi demonstrada em vários ensaios clínicos ^5,6,7. Até o momento, existem duas rotas principais para implantar células-tronco no espaço sub-retiniano: suspensão ou inserção de um adesivo monocamada semeado em um implante biocompatível 8,9,10,11,12. Novas estratégias usando terapias baseadas em células-tronco em estudos pré-clínicos exigem modelos animais em que a terapêutica baseada em células-tronco possa ser entregue no mesmo local-alvo pretendido em humanos. A diferença na anatomia pode exigir pequenas alterações nos procedimentos, equipamentos cirúrgicos e abordagem em comparação com aqueles usados com o produto humano final^13,14. A modificação das técnicas cirúrgicas oculares é uma das mudanças necessárias que tem sido amplamente descrita como uma abordagem bem-sucedida para uso em diferentes modelos animais 15,16,17.

Embora publicações anteriores tenham mencionado técnicas cirúrgicas para implantes sub-retinianos em ratos, não há descrições abrangentes de tais técnicas para superar as dificuldades técnicas que os pesquisadores podem encontrar. Portanto, é necessário descrever adequadamente as técnicas cirúrgicas em detalhes, fornecer as melhores práticas e lições aprendidas a serem evitadas e, se necessário, resolver problemas durante as etapas críticas ao longo do procedimento. O objetivo deste manuscrito é fornecer uma diretriz abrangente para a implantação cirúrgica do implante no espaço sub-retiniano em ratos.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Sul da Califórnia (IACUC) e foram realizados seguindo o Guia do National Institutes of Health (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. Um total de 12 ratos machos do Royal College of Surgeon (RCS) foram usados no presente estudo. Os animais foram criados no biotério e incluídos no estudo assim que atingiram a idade de 28 ± 1 dia após o nascimento. Um exame oftalmológico completo foi realizado para verificar a ausência de anormalidades oculares. Os implantes sub-retinianos, membranas ultrafinas feitas de parileno C e revestidas com vitronectina, foram projetados por uma organização comercial específica (ver Tabela de Materiais). Essas membranas replicam membranas de tamanho humano em termos de espessura e permeabilidade (estrutura de malha de 6,0 μm de espessura com poros circulares de 20 μm nas áreas ultrafinas). A miniaturização do comprimento e da largura (1,0 mm × 0,4 mm) das membranas de tamanho humano foi alcançada para acomodar os implantes sub-retinianos dentro dos olhos dos roedores¹⁸.

1. Cuidados com os animais e preparação cirúrgica

1. Pese o animal para calcular a dosagem de anestesia e anestesiar seguindo o passo 1.2.
2. Anestesiar o animal por meio de injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina e xilazina (35-50 mg/kg e 5-10 mg/kg, respectivamente; ver Tabela de Materiais). Injete com uma seringa de 1,0 ml e uma agulha de 30 G.
3. Carregue outra seringa de 1,0 mL com metade da quantidade da mistura da anestesia (cetamina e xilazina) para manter o nível adequado de anestesia durante o procedimento.
4. Confirme a anestesia adequada pela ausência de reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé).
5. Para visualizar adequadamente a cavidade vítrea e a retina, dilate a pupila com a instilação de tropicamida a 1% e colírio de fenilefrina a 2,5% (consulte a Tabela de Materiais) no olho tratado.
   1. Aplique uma segunda dose de colírio de dilatação após 5 min.
6. Aplique lágrimas artificiais ou gel lubrificante ocular no olho não cirúrgico a cada 5-10 minutos enquanto o animal está anestesiado para hidratar a córnea.
7. Coloque uma cortina estéril sobre a almofada de aquecimento (consulte a Tabela de Materiais). Coloque uma cortina estéril cobrindo a bandeja cirúrgica.
8. Prepare a área cirúrgica estéril colocando os seguintes instrumentos estéreis na bandeja cirúrgica: luvas cirúrgicas, implante sub-retiniano e ferramentas cirúrgicas: pinça mosquiteira (3), tesoura fina microcirúrgica (1), porta-agulha (1), pinça fina com dentes (1), pinça reta fina sem dentes (2), seringa de microlitro (1), agulha romba de 32 G (1), agulha de 27 G ou 30 G (2), Sutura de seda 4-0 (3), cotonetes, solução salina balanceada (BSS) e uma lamínula (ver Tabela de Materiais).
9. Em condições estéreis e usando luvas estéreis, carregue a seringa de microlitro com o BSS e conecte a agulha romba de 32 G.
10. Insira o comutador de algodão no cubo da agulha de 27 G ou 30 G para criar uma alça para uma manipulação mais sensível da agulha.
11. Para manter as condições estéreis durante todo o procedimento, troque as luvas estéreis se instrumentos ou áreas não estéreis forem manipulados, como o microscópio cirúrgico.

2. Abordagem escleral para implante sub-retiniano: técnica cirúrgica

1. Exponha a área cirúrgica seguindo os passos abaixo.
   1. Uma vez que o animal esteja sob anestesia e a pupila esteja dilatada (passo 1.5), coloque o animal de barriga para baixo com a cabeça voltada para o pesquisador.
      NOTA: Mantenha o rato na almofada de aquecimento coberto com uma cortina estéril durante toda a cirurgia e até que o animal esteja totalmente recuperado.
   2. Aplique gotas de povidona a 5% (consulte a Tabela de Materiais) no olho e limpe a superfície dos olhos e as pálpebras com cotonetes.
   3. Coloque e ajuste o microscópio cirúrgico (consulte a Tabela de Materiais) sobre o olho cirúrgico.
      NOTA: Recomenda-se o uso de um microscópio oftalmológico cirúrgico durante todo o procedimento cirúrgico para obter uma visualização mais nítida e maior das estruturas oculares.
   4. Garanta a exposição adequada da área cirúrgica levantando a pálpebra superior e projetando o globo ocular usando suturas inabsorvíveis 4-0.
      1. Eleve a pálpebra superior usando uma sutura de seda 4-0. Coloque a sutura no lado anterior das pálpebras ao nível das glândulas meibomianas. Prenda a sutura tracional prendendo a pinça de mosquito na superfície cirúrgica.
         NOTA: Se a sutura for colocada acima do nível da glândula meibomiana, ocorrerá eversão da pálpebra em vez da elevação da pálpebra.
      2. Realizar peritomia do quadrante temporal superior com tesoura microcirúrgica fina.
      3. Coloque duas suturas tracionais para permitir a protrusão e o deslocamento para a frente do globo ocular. Realize o isolamento do músculo reto superior.
         1. Através da manipulação suave do olho com pinças de dentes finos (pinças de 0,12 mm) na face superior do limbo, role o olho para baixo para expor a esclera.
         2. Coloque uma sutura de seda 4-0 atrás do limbo superior a até 1 mm de distância, que é a localização do músculo extraocular superior. Prenda ambas as caudas da sutura usando uma pinça de mosquito.
      4. Realize o isolamento do músculo reto temporal. Coloque uma segunda sutura (seda 4-0) a até 1 mm de distância do limbo no quadrante temporal (na área correspondente do músculo extraocular temporal). Prenda ambas as caudas da sutura usando uma pinça de mosquito.
      5. Uma vez que ambas as suturas do músculo extraocular estejam devidamente colocadas e presas, puxe as suturas para baixo e para dentro para expor o quadrante temporal superior da esclera.
   5. Estenda a peritomia em direção à parte posterior do olho com uma tesoura microcirúrgica fina.
   6. Controle o sangramento conjuntival usando cotonetes.
2. Realize a incisão escleral, o descolamento de retina (RD) e a inserção do implante seguindo as etapas abaixo.
   1. Realize a incisão escleral usando uma agulha de 27 G ou 30 G. Certifique-se de que o tamanho da incisão seja ~ 1.2 mm e 1.5 mm posterior ao limbo.
      NOTA: O desenvolvimento de uma configuração de incisão escleral em forma de túnel é recomendado para estabilizar as estruturas intraoculares durante a manipulação do olho e a introdução do implante. Esta forma de incisão evitará flutuações repentinas na pressão intraocular.
   2. Às vezes, a configuração adequada requer prática. Portanto, se a configuração adequada não for alcançada, libere alguma tensão das suturas tracionais do músculo extraocular para facilitar a manutenção das estruturas oculares dentro da cavidade vítrea.
   3. Utilizando a mesma agulha utilizada para a incisão escleral (27 G ou 30 G), realizar paracentese na córnea periférica no mesmo quadrante.
   4. Insira a agulha romba de 32 G montada em uma seringa de microlitro através da incisão escleral.
   5. Injete 100 μL de BSS para criar um RD focal.
   6. Solte as suturas tracionais do músculo extraocular para colocar o olho de volta na posição normal.
   7. Para visualização direta do RD, coloque a lamínula, carregada com gel lubrificante oftálmico, na córnea.
   8. Ajuste a objetiva do microscópio para focar na retina.
   9. Se o RD não for observado ou for muito pequeno (menor que o tamanho de um quadrante), execute uma segunda injeção de BSS para atingir o tamanho desejado do RD rolando o olho para baixo e para dentro e repetindo as etapas 2.2.4 a 2.2.8.
   10. Uma vez concluído o RD, verifique o comprimento escleral (conforme mencionado na etapa 2.2.1) com um paquímetro (consulte a Tabela de Materiais).
   11. Corte o tecido coroidal em ambas as direções com uma tesoura microcirúrgica fina.
   12. Passe a agulha romba lateralmente ao longo da incisão escleral para verificar se todas as estruturas esclerais e coroidais foram dissecadas.
   13. Insira o implante no espaço sub-retiniano.
   14. Usando duas pinças cirúrgicas finas, como pinças de amarração (consulte a Tabela de Materiais), segure o implante por trás para não danificar a parte ativa do implante.
   15. Coloque o implante paralelo ao plano de incisão e deslize suavemente o implante.
   16. Assim que o implante estiver completamente introduzido no espaço sub-retiniano, solte-o e empurre o implante ainda mais, introduzindo as mandíbulas de uma das pinças de 1 a 1,5 mm na incisão.
   17. Solte as suturas tracionais do músculo extraocular e verifique a colocação do implante usando o microscópio e a lamínula conforme descrito acima (etapas 2.2.7 e 2.2.8).
3. Solte e remova todas as suturas.
   NOTA: Após a conclusão do procedimento cirúrgico, é realizada a SD-OCT (etapa 3) para validar os achados clínicos. A sessão de imagem SD-OCT é realizada logo após a cirurgia. Se a visualização adequada da localização do implante não for obtida, realize o SD-OCT novamente 7 a 10 dias após a cirurgia.

3. Imagem SD-OCT

1. Clique no ícone do Heidelberg Eye Explorer (um software de gerenciamento de imagens; consulte Tabela de materiais) na tela da área de trabalho.
2. Clique no ícone Novo paciente na parte superior da tela.
   1. Preencha todas as informações solicitadas para gerar o ID do animal e clique em Aceitar.
   2. Selecione o sistema de imagem OCT (HRA + OCT; consulte Tabela de materiais) para o tipo de dispositivo.
   3. Selecione o operador e pressione OK.
   4. Para a opção de curvatura correta da córnea, pressione o botão OK para aceitar os dados padrão do olho.
3. Certifique-se de que a janela de aquisição do SD-OCT esteja iniciada e pronta para o SD-OCT.
4. Ligue a câmera SD-OCT pressionando o botão amarelo Iniciar localizado na tela sensível ao toque ao lado da câmera.
5. Coloque o animal no estágio de animal SD-OCT que foi adaptado em cima do encosto de cabeça SD-OCT.
   NOTA: A adaptação do estágio animal inclui um pedaço de espuma de poliestireno (consulte a Tabela de Materiais) para caber no estágio principal SD-OCT que seja grande o suficiente para colocar o animal, incluindo a almofada de aquecimento.
6. Ajuste a altura da mesa e a posição do animal para alinhar a pupila com o centro da lente SD-OCT.
   NOTA: Assim que o olho estiver alinhado, uma imagem ao vivo infravermelha (IR) aparecerá na tela.
7. Pressione o botão IR + OCT na tela sensível ao toque ou o botão OCT no canto inferior direito do monitor para iniciar a aquisição da imagem.
8. Assim que o SD-OCT for ativado, selecione um único modo de varredura com o maior número (100) de quadros ART. O modo de digitalização 100 ART é o modo padrão.
9. Usando o joystick da câmera, centralize o nervo óptico na imagem IR.
10. Empurre a câmera para frente até que a imagem IR seja preenchida uniformemente com a imagem da retina.
    NOTA: Os cantos escuros indicam que a câmera está muito longe ou perto do olho.
11. Mova a câmera para o lado até que o implante seja visualizado no aspecto temporal da retina. Use a imagem IR para guiar os movimentos.
12. Para visualizar o implante pelo B-scan, pressione CTRL + ALT + SHIFT + O simultaneamente para exibir a janela de ajuste do SD-OCT B-scan.
13. Ajuste o "Braço de Referência" (na parte inferior da janela) até que a retina/implante seja visualizada na imagem SD-OCT.
    NOTA: A imagem SD-OCT deve ser exibida nos cantos de referência azuis.
14. Feche a janela.
15. Usando o joystick e a alça da câmera, deslize e gire a câmera em todas as direções até obter uma imagem de qualidade SD-OCT melhor, mais plana e mais nítida.
16. Arraste a seta azul na imagem IR até que ela seja colocada ao longo do implante.
17. Quando a saturação e o posicionamento do B-scan estiverem ideais, ative o "Rastreamento automático em tempo real (ART)" pressionando o botão preto de controle de ganho abaixo da tela sensível ao toque.
18. Quando o ART atingir 100 quadros, pressione Adquirir na tela sensível ao toque.
19. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, clique em Salvar imagens na parte superior da janela e, em seguida, clique em Sair.
20. Mantenha a córnea úmida durante toda a sessão de imagem aplicando colírios lubrificantes com frequência (a cada 5 minutos).

4. Recuperação de animais

1. No final da sessão de imagem, aplique pomada antibiótica na córnea para prevenir infecções oculares e hidrate a córnea.
2. Mantenha o animal descansando de barriga para baixo na almofada de aquecimento até que esteja totalmente recuperado (~ 20-30 min) e deambulando.
3. Administre analgésicos sistêmicos (1,0-1,2 mg / kg de Buprenorfina SR uma vez por via subcutânea; ver Tabela de Materiais) no final do procedimento cirúrgico.
4. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente.
5. Não devolva o animal à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
6. Depois de totalmente recuperado, coloque o animal de volta na área de alojamento com acesso a comida e água ad libitum.

Resultados

O implante de um implante sub-retiniano em ratos RCS (N = 12) demonstrou a viabilidade e reprodutibilidade da técnica cirúrgica para entrega sub-retiniana em ratos. Neste estudo, o olho direito foi o olho tratado (N = 12) com o implante. Na avaliação clínica realizada ao final do procedimento com o microscópio cirúrgico, nove dos 12 olhos tratados demonstraram localização sub-retiniana do implante (75,00%), dois olhos (16,67%) foram identificados como colocação intrarretiniana...

Discussão

Embora o procedimento tenha sido descrito anteriormente com pequenas variações, o escopo deste manuscrito é fornecer uma descrição abrangente de um procedimento cirúrgico para implantes sub-retinianos em ratos a ser seguido durante o aprendizado da técnica e para superar os desafios cirúrgicos e possíveis complicações que os investigadores podem encontrar. O protocolo cirúrgico descrito aqui inclui o uso da membrana de parileno ultrafina que tem sido amplamente utilizada em n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe	VWR	BD309659
27 G needle 1/2''	VWR	BD305109
30 G needle 1/2''	VWR	BD305106
32 G Blunt needle - Small hub RN	Hamilton	7803-04
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5	Ethicon	1984G
6'' sterile cotton tips	VWR	10805-154
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution	Alcon	8007-1
BSS irrigating solution 15 mL	Accutome	Ax17362
Buprenorphine ER	ZooPharm	N/A
Castroviejo Caliper	Storz	E2405
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm	Storz	E1796
Clayman-Vannas scissors straight	Storz	E3383S
Cover glass, square	WVR	48366-227
EPS Polystyrene block	Silverlake LLC	CFB8x12x2
Gonak 15 mL	Accutome	Ax10968	Eye lubricant
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic	Storz	E6772
Hamilton syringe 700 series 100 µL	Hamilton	7638-01
HEYEX Software	Heidelberg	N/A	an image management software
Kelman-McPherson tying forceps angled	Storz	E1815 AKUS
Ketamine (100 mg/mL)	MWI	501072
Needle holder 9mm curved fine locking	Storz	3-302
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g	Accutome	Ax0720
Ophthalmic surgical microscope	Zeiss	SN: 233922
Phenylephrine 2.5% 15 mL	Accutome	Ax0310
Spectralis SD-OCT	Heidelberg	SPEC-CAM-011210s3600
Sterile Drape	VWR	100229-300
Sterile surgical gloves	VWR	89233-804
T-Pump heating system	Gaymar	TP650
Tropicamide 1% 15 mL	Accutome	Ax0330
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin	Mini Pumps LLC, CA	specifically designed for this study	used as subretinal implants
Xylazine (100 mg/mL)	MWI	510650