JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt den skleralen Zugang zur subretinalen Geräteimplantation, eine praktikable Operationstechnik für den Einsatz in Tiermodellen von Netzhauterkrankungen in der Forschung.

Zusammenfassung

Netzhautdegeneration, wie z. B. die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Eine Vielzahl von Ansätzen wurde verfolgt, um auf regenerativer Medizin basierende Therapien für AMD zu entwickeln, einschließlich stammzellbasierter Therapien. Nagetiere als Tiermodelle für die Netzhautdegeneration sind eine Grundlage für die translationale Forschung, da es ein breites Spektrum an Stämmen gibt, die in verschiedenen Stadien Netzhautdegenerationskrankheiten entwickeln. Die Nachahmung der therapeutischen Verabreichung von subretinalen Implantaten beim Menschen bei Nagetieren ist jedoch aufgrund anatomischer Unterschiede wie Linsengröße und Glaskörpervolumen eine Herausforderung. Dieses chirurgische Protokoll zielt darauf ab, eine geführte Methode für die Transplantation von Implantaten in den subretinalen Raum bei Ratten bereitzustellen. Eine benutzerfreundliche, umfassende Beschreibung der kritischen Schritte wurde hinzugefügt. Dieses Protokoll wurde als kosteneffizientes chirurgisches Verfahren zur Reproduzierbarkeit in verschiedenen präklinischen Studien an Ratten entwickelt. Vor der Durchführung des chirurgischen Experiments ist eine ordnungsgemäße Miniaturisierung eines Implantats in menschlicher Größe erforderlich, die Anpassungen der Abmessungen des Implantats umfasst. Anstelle eines intravitrealen Verfahrens wird ein externer Zugang verwendet, um das Implantat in den subretinalen Raum zu bringen. Mit einer kleinen scharfen Nadel wird ein Skleraschnitt im temporalen oberen Quadranten durchgeführt, gefolgt von einer Parazentese, um den Augeninnendruck zu senken und dadurch den Widerstand während der chirurgischen Implantation zu minimieren. Anschließend wird eine Injektion einer balancierten Salzlösung (BSS) durch den Schnitt durchgeführt, um eine fokale Netzhautablösung (RD) zu erreichen. Zuletzt erfolgt das Einsetzen und die Visualisierung des Implantats in den subretinalen Raum. Die postoperative Beurteilung der subretinalen Platzierung des Implantats umfasst die Bildgebung mittels optischer Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich. In bildgebenden Untersuchungen wird die subretinale Stabilität des Implantats festgestellt, bevor die Augen entnommen und für die histologische Analyse fixiert werden.

Einleitung

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Zahl der von AMD betroffenen Menschen wurde im Jahr 2020 auf 196 Millionen geschätzt, und diese Zahl wird bis 2040 voraussichtlich auf etwa 288 Millionen ansteigen. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Therapeutika entwickelt, um die visuellen Veränderungen im Zusammenhang mit den späten Stadien der AMD zu mildern, hauptsächlich zur Behandlung der Entwicklung und des Fortschreitens der choroidalen Neovaskularisation, die bei der feuchten AMD beobachtet wird. Umgekehrt wird die Behandlung der trockenen AMD, bei der die Dysfunktion und der Verlust von retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) zu RPE und Netzhautatrophie führen, schätzungsweise 85 % bis 90 % der AMD ausmachen, mit einer Prävalenz von 0,44 % weltweit 1,2. AMD wurde als multifaktorielle Erkrankung beschrieben, bei der Alter, genetische und umweltbedingte Faktoren zum Ausbruch und Fortschreiten der Erkrankung beitragen. Mehrere Therapien befinden sich in der Entwicklung, um die verschiedenen pathophysiologischen Signalwege zu behandeln, die mit dieser Krankheit verbunden sind3.

Die stammzellbasierte Therapie wurde als neuartige Therapieoption entwickelt, um das versagende RPE bei trockener AMD4 zu ersetzen. Obwohl sich die Verwendung von pluripotenten Stammzellen noch in frühen klinischen Studien befindet, wurde die Sicherheit in mehreren klinischen Studien nachgewiesen 5,6,7. Bisher gibt es zwei Hauptwege, um Stammzellen in den subretinalen Raum zu bringen: die Aufhängung oder das Einsetzen eines Monolayer-Pflasters, das auf ein biokompatibles Implantat gestreutwird 8,9,10,11,12. Neue Strategien, bei denen stammzellbasierte Therapien in präklinischen Studien zum Einsatz kommen, erfordern Tiermodelle, bei denen die stammzellbasierten Therapeutika an die gleiche Zielstelle wie beim Menschen abgegeben werden können. Der Unterschied in der Anatomie kann geringfügige Änderungen an den Verfahren, der chirurgischen Ausrüstung und dem Ansatz im Vergleich zu denen erfordern, die mit dem menschlichen Endprodukt verwendet werden13,14. Die Modifikation der okulären chirurgischen Techniken ist eine der erforderlichen Änderungen, die weithin als erfolgreicher Ansatz für den Einsatz in verschiedenen Tiermodellen beschrieben wurde 15,16,17.

Obwohl in früheren Veröffentlichungen chirurgische Techniken für subretinale Implantate bei Ratten erwähnt wurden, gibt es keine umfassenden Beschreibungen solcher Techniken, um die technischen Schwierigkeiten zu überwinden, auf die Forscher stoßen können. Daher ist es notwendig, die Operationstechniken im Detail richtig zu beschreiben, Best Practices und gewonnene Erkenntnisse zur Vermeidung bereitzustellen und bei Bedarf Probleme in kritischen Schritten des Eingriffs anzugehen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, einen umfassenden Leitfaden für die chirurgische Implantation des Implantats in den subretinalen Raum bei Ratten zu erstellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Southern California genehmigt und gemäß dem Leitfaden der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung durchgeführt. In der vorliegenden Studie wurden insgesamt 12 männliche Ratten des Royal College of Surgeon (RCS) verwendet. Die Tiere wurden in der Tiereinrichtung gezüchtet und in die Studie aufgenommen, sobald sie das Alter von 28 Jahren erreicht hatten ± 1 Tag nach der Geburt. Es wurde eine vollständige Augenuntersuchung durchgeführt, um das Fehlen von Augenanomalien zu überprüfen. Die subretinalen Implantate, ultradünne Membranen aus Parylene C und mit Vitronektin beschichtet, wurden von einer speziellen kommerziellen Organisation entwickelt (siehe Materialtabelle). Diese Membranen replizieren in Bezug auf ihre Dicke und Permeabilität Membranen in Menschengröße (6,0 μm dicker Maschenrahmen mit 20 μm kreisförmigen Poren in den ultradünnen Bereichen). Die Miniaturisierung der Länge und Breite (1,0 mm × 0,4 mm) von Membranen in menschlicher Größe wurde erreicht, um die subretinalen Implantate in den Nagetieraugen unterzubringen18.

1. Tierpflege und chirurgische Vorbereitung

  1. Wiegen Sie das Tier, um die Dosierung der Anästhesie zu berechnen, und betäuben Sie es gemäß Schritt 1.2.
  2. Betäuben Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (35-50 mg/kg bzw. 5-10 mg/kg; siehe Materialtabelle). Injizieren Sie mit einer 1,0-ml-Spritze und einer 30-g-Nadel.
  3. Laden Sie eine weitere 1,0-ml-Spritze mit der Hälfte der Menge der Anästhesiemischung (Ketamin und Xylazin), um das richtige Anästhesieniveau während des Eingriffs aufrechtzuerhalten.
  4. Bestätigen Sie eine adäquate Anästhesie durch das Fehlen eines Pedalreflexes (festes Einklemmen der Zehen).
  5. Um die Glaskörperhöhle und die Netzhaut richtig sichtbar zu machen, erweitern Sie die Pupille durch Instillation von 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin Augentropfen (siehe Materialtabelle) in das behandelte Auge.
    1. Tragen Sie nach 5 Minuten eine zweite Dosis Dilatationsaugentropfen auf.
  6. Tragen Sie alle 5-10 Minuten entweder künstliche Tränen oder Augengleitgel in das nicht-chirurgische Auge auf, während das Tier betäubt wird, um die Hornhaut mit Feuchtigkeit zu versorgen.
  7. Legen Sie ein steriles Tuch über das Heizkissen (siehe Materialtabelle). Legen Sie ein steriles Abdecktuch auf das OP-Tablett.
  8. Bereiten Sie den sterilen Operationsbereich vor, indem Sie die folgenden sterilen Instrumente auf das OP-Tablett legen: OP-Handschuhe, subretinales Implantat und chirurgische Instrumente: Mückenzange (3), mikrochirurgische Feinschere (1), Nadelhalter (1), feine Pinzette mit Zähnen (1), feine gerade Pinzette ohne Zähne (2), Mikroliterspritze (1), 32 G stumpfe Nadel (1), 27 G oder 30 G Nadel (2), 4-0 Seidennaht (3), Wattestäbchen, ausgewogene Salzlösung (BSS) und ein Deckglas (siehe Materialtabelle).
  9. Laden Sie unter sterilen Bedingungen und mit sterilen Handschuhen die Mikroliterspritze mit dem BSS und setzen Sie die stumpfe 32-G-Nadel auf.
  10. Führen Sie das Wattestäbchen in die 27 G oder 30 G Nadelnabe ein, um einen Griff für eine feinfühligere Handhabung der Nadel zu schaffen.
  11. Um während des gesamten Eingriffs sterile Bedingungen zu gewährleisten, wechseln Sie die sterilen Handschuhe, wenn nicht sterile Instrumente oder Bereiche wie das Operationsmikroskop manipuliert werden.

2. Skleraler Zugang zur subretinalen Implantation: Operationstechnik

  1. Legen Sie den Operationsbereich frei, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Sobald das Tier unter Narkose steht und die Pupille erweitert ist (Schritt 1.5), legen Sie das Tier mit dem Bauch nach unten mit dem Kopf in Richtung des Forschers.
      HINWEIS: Lassen Sie die Ratte während der gesamten Operation und bis zur vollständigen Genesung des Tieres auf dem Heizkissen mit einem sterilen Tuch bedeckt.
    2. Tragen Sie 5% Povidon-Tropfen (siehe Materialtabelle) auf das Auge auf und reinigen Sie die Augenoberfläche und die Augenlider mit Wattestäbchen.
    3. Platzieren Sie das Operationsmikroskop (siehe Materialtabelle) über dem chirurgischen Auge und stellen Sie es ein.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, während des gesamten chirurgischen Eingriffs ein chirurgisches Ophthalmomikroskop zu verwenden, um eine schärfere und größere Visualisierung der Augenstrukturen zu erhalten.
    4. Stellen Sie sicher, dass der Operationsbereich ordnungsgemäß freigelegt wird, indem Sie das obere Augenlid anheben und den Augapfel mit nicht resorbierbaren 4-0-Nähten hervortreten.
      1. Heben Sie das obere Augenlid mit einer 4-0-Seidennaht an. Legen Sie die Naht in die vordere Seite der Augenlider auf Höhe der Meibom-Drüsen. Sichern Sie die Zugnaht, indem Sie die Mückenzange an die Operationsoberfläche klemmen.
        HINWEIS: Wenn die Naht höher als die Höhe der Meibom-Drüse platziert wird, kommt es zu einer Eversion des Augenlids anstelle einer Augenliderhöhung.
      2. Führen Sie die Peritomie des temporalen oberen Quadranten mit einer mikrochirurgischen Feinschere durch.
      3. Platzieren Sie zwei Zugnähte, um eine Protrusion und Vorwärtsverschiebung des Augapfels zu ermöglichen. Führen Sie die Isolierung des Musculus rectus superior durch.
        1. Durch sanfte Manipulation des Auges mit einer Zange mit feinen Zähnen (0,12 mm Pinzette) in der oberen Seite des Limbus rollen Sie das Auge nach unten, um die Sklera freizulegen.
        2. Platzieren Sie eine 4-0-Seidennaht hinter dem oberen Limbus in einem Abstand von bis zu 1 mm, wo sich der Musculus extraocularis superior befindet. Klemmen Sie beide Enden der Naht mit einer Mückenzange fest.
      4. Führen Sie eine Isolation des temporalen Rektusmuskels durch. Legen Sie eine zweite Naht (4-0 Seide) bis zu 1 mm vom Limbus entfernt im temporalen Quadranten (im entsprechenden Bereich des temporalen extraookularen Muskels). Klemmen Sie beide Enden der Naht mit einer Mückenzange fest.
      5. Sobald beide extraokulären Muskelnähte richtig platziert und geklemmt sind, ziehen Sie die Nähte nach unten und innen, um den temporalen oberen Quadranten der Sklera freizulegen.
    5. Verlängern Sie die Peritomie mit einer mikrochirurgischen Feinschere in Richtung Augenhintergrund.
    6. Kontrollieren Sie Bindehautblutungen mit Wattestäbchen.
  2. Führen Sie einen Skleralschnitt, eine Netzhautablösung (RD) und das Einsetzen des Implantats durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Führen Sie einen Skleralschnitt mit einer 27-G- oder 30-G-Nadel durch. Stellen Sie sicher, dass die Größe des Schnitts ~1,2 mm und 1,5 mm hinter dem Limbus beträgt.
      HINWEIS: Die Entwicklung einer tunnelartigen Skleraschnittkonfiguration wird empfohlen, um die intraokularen Strukturen zu stabilisieren, während das Auge manipuliert und das Implantat eingeführt wird. Diese Schnittform verhindert plötzliche Schwankungen des Augeninnendrucks.
    2. Manchmal erfordert die richtige Konfiguration Übung. Wenn die richtige Konfiguration nicht erreicht wird, lösen Sie daher einige Spannungen von den extraokularen Muskelzugnähten, um die Augenstrukturen im Glaskörper zu halten.
    3. Mit der gleichen Nadel, die auch für den Skleraschnitt verwendet wurde (27 G oder 30 G), führen Sie die Parazentese in der peripheren Hornhaut im selben Quadranten durch.
    4. Führen Sie die stumpfe 32-G-Nadel, die auf einer Mikroliterspritze montiert ist, durch den Skleralschnitt ein.
    5. Injizieren Sie 100 μl BSS, um eine fokale RD zu erzeugen.
    6. Lösen Sie die extraokulären Muskelzugnähte, um das Auge wieder in die normale Position zu bringen.
    7. Für eine direkte Visualisierung der RD legen Sie den mit ophthalmischem Gleitgel beladenen Deckglas auf die Hornhaut und halten Sie ihn fest.
    8. Stellen Sie das Mikroskopobjektiv so ein, dass es auf die Netzhaut fokussiert.
    9. Wenn die RD nicht beobachtet wird oder zu klein ist (kleiner als die Größe eines Quadranten), führen Sie eine zweite BSS-Injektion durch, um die gewünschte RD-Größe zu erreichen, indem Sie das Auge nach unten und innen rollen und die Schritte 2.2.4 bis 2.2.8 wiederholen.
    10. Sobald die RD abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Sklerallänge (wie in Schritt 2.2.1 erwähnt) mit einem Messschieber (siehe Materialtabelle).
    11. Schneiden Sie das Aderhautgewebe mit einer feinen mikrochirurgischen Schere in beide Richtungen.
    12. Führen Sie die stumpfe Nadel seitlich entlang des Skleralschnitts, um sicherzustellen, dass alle Sklera- und Aderhautstrukturen präpariert wurden.
    13. Setzen Sie das Implantat in den subretinalen Raum ein.
    14. Fassen Sie das Implantat mit zwei feinen chirurgischen Zangen, wie z. B. einer Bindezange (siehe Materialtabelle), von der Rückseite, um den aktiven Teil des Implantats nicht zu beschädigen.
    15. Platzieren Sie das Implantat parallel zur Schnittebene und schieben Sie das Implantat vorsichtig ein.
    16. Sobald das Implantat vollständig in den subretinalen Raum eingeführt ist, lösen Sie es und schieben Sie das Implantat weiter hinein, indem Sie die Kiefer einer der Pinzetten 1-1,5 mm in den Schnitt einführen.
    17. Lösen Sie die extraokulären Muskeltraktionsnähte und überprüfen Sie die Platzierung des Implantats mit dem Mikroskop und dem Deckglas wie oben beschrieben (Schritte 2.2.7 und 2.2.8).
  3. Lösen und entfernen Sie alle Nähte.
    HINWEIS: Nach Abschluss des chirurgischen Eingriffs wird eine SD-OCT (Schritt 3) durchgeführt, um die klinischen Befunde zu validieren. Die SD-OCT-Bildgebung wird direkt nach der Operation durchgeführt. Wenn die korrekte Visualisierung der Implantatposition nicht erreicht wurde, führen Sie die SD-OCT 7-10 Tage nach der Operation erneut durch.

3. SD-OCT-Bildgebung

  1. Klicken Sie auf das Symbol Heidelberg Eye Explorer (eine Bildverwaltungssoftware; siehe Materialtabelle) auf dem Desktop-Bildschirm.
  2. Klicken Sie auf das Symbol Neuer Patient oben auf dem Bildschirm.
    1. Geben Sie alle erforderlichen Informationen ein, um die Tier-ID zu generieren, und klicken Sie auf Akzeptieren.
    2. Wählen Sie als Gerätetyp das OCT-Imaging-System (HRA + OCT; siehe Materialtabelle) aus.
    3. Wählen Sie den Operator aus und drücken Sie OK.
    4. Um die Option für die korrekte Hornhautkrümmung zu erhalten, drücken Sie die OK-Taste, um die Standard-Augendaten zu übernehmen.
  3. Stellen Sie sicher, dass das Erfassungsfenster für das SD-OAT gestartet und für das SD-OAT bereit ist.
  4. Schalten Sie die SD-OCT-Kamera ein, indem Sie die gelbe Start-Taste drücken, die sich auf dem Touchscreen-Display neben der Kamera befindet.
  5. Stellen Sie das Tier auf den SD-OCT-Tiertisch, der auf die SD-OCT-Kopfstütze angepasst wurde.
    HINWEIS: Die Adaption des Tiertisches enthält ein Stück Polystyrolschaum (siehe Materialtabelle), das in den SD-OCT-Kopftisch passt und groß genug ist, um das Tier einschließlich des Heizkissens darauf zu platzieren.
  6. Passen Sie die Tischhöhe und die Position des Tieres an, um die Pupille mit der Mitte des SD-OCT-Objektivs auszurichten.
    HINWEIS: Sobald das Auge ausgerichtet ist, wird ein Infrarot (IR)-Livebild auf dem Bildschirm angezeigt.
  7. Drücken Sie entweder die IR + OCT-Taste auf dem Touchscreen oder die OCT-Taste unten rechts am Monitor, um die Bildaufnahme zu starten.
  8. Sobald das SD-OCT live geht, wählen Sie einen einzelnen Scanmodus mit der höchsten Anzahl (100) von ART-Frames aus. Der 100-ART-Scanmodus ist der Standardmodus.
  9. Zentrieren Sie mit dem Kamera-Joystick den Sehnerv auf dem IR-Bild.
  10. Schieben Sie die Kamera nach vorne, bis das IR-Bild gleichmäßig mit dem Netzhautbild gefüllt ist.
    HINWEIS: Dunkle Ecken zeigen an, dass sich die Kamera entweder zu weit oder zu nah am Auge befindet.
  11. Bewegen Sie die Kamera seitwärts, bis das Implantat in der temporalen Seite der Netzhaut sichtbar ist. Verwenden Sie das IR-Bild, um die Bewegungen zu steuern.
  12. Um das Implantat anhand des B-Bildes zu visualisieren, drücken Sie gleichzeitig STRG + ALT + UMSCHALT + O , um das SD-OCT B-Bild-Anpassungsfenster anzuzeigen.
  13. Stellen Sie den "Referenzarm" (am unteren Rand des Fensters) ein, bis die Netzhaut/das Implantat im SD-OCT-Bild sichtbar ist.
    HINWEIS: Das SD-OCT-Bild muss in den blauen Referenzecken angezeigt werden.
  14. Schließen Sie das Fenster.
  15. Mit dem Joystick und dem Kameragriff können Sie die Kamera in alle Richtungen schieben und drehen, bis ein besseres, flacheres und schärferes Bild in SD-OCT-Qualität erhalten wird.
  16. Ziehen Sie den blauen Pfeil auf dem IR-Bild, bis er entlang des Implantats platziert ist.
  17. Sobald die Sättigung und Platzierung des B-Bildes optimal sind, aktivieren Sie das "Automatic Real-time Tracking (ART)", indem Sie die schwarze Gain Control-Taste unterhalb des Touchscreens drücken.
  18. Sobald der ART 100 Bilder erreicht hat, drücken Sie Acquire auf dem Touchscreen.
  19. Wenn alle Bilder erfasst wurden, klicken Sie oben im Fenster auf Bilder speichern und dann auf Beenden.
  20. Halten Sie die Hornhaut während der gesamten Bildgebung feucht, indem Sie häufig (alle 5 Minuten) Gleitaugentropfen auftragen.

4. Bergung der Tiere

  1. Tragen Sie am Ende der Bildgebung eine antibiotische Salbe auf die Hornhaut auf, um Augeninfektionen vorzubeugen und die Hornhaut mit Feuchtigkeit zu versorgen.
  2. Lassen Sie das Tier auf dem Bauch auf dem Heizkissen ruhen, bis es sich vollständig erholt hat (~20-30 min) und gehfähig ist.
  3. Geben Sie systemische Analgetika (1,0-1,2 mg/kg Buprenorphin SR einmal subkutan; siehe Materialtabelle) am Ende des chirurgischen Eingriffs.
  4. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder ausreichend bei Bewusstsein ist.
  5. Geben Sie das Tier nicht an andere Tiere zurück, bis es vollständig genesen ist.
  6. Sobald es sich vollständig erholt hat, setzen Sie das Tier zurück in den Stallbereich, wo es nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser hat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Die Implantation eines subretinalen Implantats bei RCS-Ratten (N = 12) demonstrierte die Machbarkeit und Reproduzierbarkeit der Operationstechnik für die subretinale Verabreichung bei Ratten. In dieser Studie war das rechte Auge das mit dem Implantat behandelte Auge (N = 12). In der klinischen Beurteilung, die am Ende des Eingriffs mit dem Operationsmikroskop durchgeführt wurde, zeigten neun der 12 behandelten Augen eine subretinale Lokalisation des Implantats (75,00 %), zwei Augen (16...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Obwohl das Verfahren zuvor mit leichten Abweichungen beschrieben wurde, besteht der Zweck dieses Manuskripts darin, eine umfassende Beschreibung eines chirurgischen Verfahrens für subretinale Implantate bei Ratten zu liefern, das beim Erlernen der Technik befolgt werden soll, und um die chirurgischen Herausforderungen und potenziellen Komplikationen zu überwinden, auf die die Forscher stoßen können. Das hier skizzierte chirurgische Protokoll beinhaltet die Verwendung der ultradünnen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

M.S.H., D.R.H. und J.L. sind Mitbegründer und Berater von Regenerative Patch Technologies (RPT). Die anderen Autoren bestätigen, dass sie keine Verbindungen zu oder Beteiligungen an einer Organisation oder Einrichtung haben, die ein finanzielles oder nicht-finanzielles Interesse an dem in diesem Manuskript behandelten Thema oder Material haben.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt von CIRM DT3 (MSH) und Research to Prevent Blindness (USC Roski Eye Institute). Wir danken Fernando Gallardo und Dr. Ying Liu für ihre technische Unterstützung.

Der Sponsor spielte keine Rolle bei der Konzeption oder Durchführung dieser Forschung.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 cc syringeVWRBD309659
27 G needle 1/2''VWRBD305109
30 G needle 1/2''VWRBD305106
32 G Blunt needle - Small hub RNHamilton7803-04
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5Ethicon1984G
6'' sterile cotton tipsVWR10805-154
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solutionAlcon8007-1
BSS irrigating solution 15 mLAccutomeAx17362
Buprenorphine ERZooPharmN/A
Castroviejo CaliperStorzE2405
Castroviejo suturing forceps 0.12 mmStorzE1796
Clayman-Vannas scissors straightStorzE3383S
Cover glass, squareWVR48366-227
EPS Polystyrene blockSilverlake LLCCFB8x12x2
Gonak 15 mLAccutomeAx10968Eye lubricant
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magneticStorzE6772
Hamilton syringe 700 series 100 µL Hamilton7638-01
HEYEX SoftwareHeidelberg N/Aan image management software
Kelman-McPherson tying forceps angledStorzE1815 AKUS
Ketamine (100 mg/mL)MWI501072
Needle holder 9mm curved fine lockingStorz3-302
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 gAccutomeAx0720
Ophthalmic surgical microscopeZeissSN: 233922
Phenylephrine 2.5% 15 mLAccutomeAx0310
Spectralis SD-OCTHeidelberg SPEC-CAM-011210s3600
Sterile DrapeVWR100229-300
Sterile surgical glovesVWR89233-804
T-Pump heating systemGaymarTP650
Tropicamide 1% 15 mLAccutomeAx0330
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectinMini Pumps LLC, CAspecifically designed for this studyused as subretinal implants 
Xylazine (100 mg/mL)MWI510650

Referenzen

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Schultz, N. M., Bhardwaj, S., Barclay, C., Gaspar, L., Schwartz, J. Global burden of dry age-related macular degeneration: a targeted literature review. Clinical Therapeutics. 43 (10), 1792-1818 (2021).
  3. Deng, Y., et al. Age-related macular degeneration: Epidemiology, genetics, pathophysiology, diagnosis, and targeted therapy. Genes & Diseases. 9 (1), 62-79 (2021).
  4. Nazari, H., et al. Stem cell-based therapies for age-related macular degeneration: The promises and the challenges. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 1-39 (2015).
  5. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  6. Kashani, A. H., et al. Survival of an HLA-mismatched, bioengineered RPE implant in dry age-related macular degeneration. Stem Cell Reports. 17 (3), 448-458 (2022).
  7. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  8. Da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (6), 598-635 (2017).
  9. Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  10. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  11. Antognazza, M. R., et al. Characterization of a polymer-based, fully organic prosthesis for implantation into the subretinal space of the rat. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2271-2282 (2016).
  12. Pennington, B. O., et al. Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).
  13. Thomas, B. B., et al. A new immunodeficient retinal dystrophic rat model for transplantation studies using human-derived cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (11), 2113-2125 (2018).
  14. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatán minipigs. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  15. Yu, W., et al. Biocompatibility of subretinal parylene-based Ti/Pt microelectrode array in rabbit for further artificial vision studies. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 2 (1), 33-36 (2009).
  16. Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
  17. Adekunle, A. N., et al. Integration of perforated subretinal prostheses with retinal tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5(2015).
  18. Lu, B., et al. Semipermeable parylene membrane as an artificial Bruch's membrane. 2011 16th International Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference. IEEE. , 950-953 (2011).
  19. Hu, Y., et al. Subretinal implantation of gelatin films with stem cells derived RPE in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 1763(2013).
  20. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Retinal transplantation-advantages of intact fetal sheets. Progress in Retinal and Eye Research. 21 (1), 57-73 (2002).
  21. Peng, Q., et al. Structure and function of embryonic rat retinal sheet transplants. Current Eye Research. 32 (9), 781-789 (2007).
  22. Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (2), 674-682 (2005).
  23. Ho, E., et al. Characteristics of prosthetic vision in rats with subretinal flat and pillar electrode arrays. Journal of Neural Engineering. 16 (6), 066027(2019).
  24. Thomas, B. B., et al. Co-grafts of human embryonic stem cell derived retina organoids and retinal pigment epithelium for retinal reconstruction in immunodeficient retinal degenerate Royal College of Surgeons rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 752958(2021).
  25. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  26. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  27. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  28. Matsuo, T., Hosoya, O., Tsutsui, K. M., Uchida, T. Behavior tests and immunohistochemical retinal response analyses in RCS rats with subretinal implantation of Okayama-University-type retinal prosthesis. Journal of Artificial Organs. 16 (3), 343-351 (2013).
  29. Seiler, M. J., et al. A new immunodeficient pigmented retinal degenerate rat strain to study transplantation of human cells without immunosuppression. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (7), 1079-1092 (2014).
  30. Stanzel, B. V. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 490-500 (2012).
  31. Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. The British Journal of Ophthalmology. 51 (2), 124-129 (1976).
  32. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Experimental Eye Research. 42 (4), 331-337 (1986).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

OperationstechnikSubretinale ImplantateNetzhautdegenerationAltersbedingte MakuladegenerationAMDNagetiermodelleRegenerative MedizinPr klinische StudienMiniaturisierungSkleralschnittAugeninnendruckNetzhautabl sungBalanced Salt SolutionSpektralbereich Optische Koh renztomographieHistologische Analyse

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten