Desarrollo de una técnica quirúrgica para implantes subretinianos en ratas

Resumen

El presente protocolo describe el abordaje escleral para el implante de dispositivos subretinianos, una técnica quirúrgica factible para su implementación en modelos animales de enfermedades de la retina en investigación.

Resumen

La degeneración de la retina, como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Se han llevado a cabo una gran cantidad de enfoques para desarrollar terapias basadas en la medicina regenerativa para la DMAE, incluidas las terapias basadas en células madre. Los roedores como modelos animales para la degeneración de la retina son una base para la investigación traslacional, debido al amplio espectro de cepas que desarrollan enfermedades de degeneración de la retina en diferentes etapas. Sin embargo, imitar la administración terapéutica humana de implantes subretinianos en roedores es un desafío, debido a diferencias anatómicas como el tamaño del cristalino y el volumen vítreo. Este protocolo quirúrgico tiene como objetivo proporcionar un método guiado para el trasplante de implantes en el espacio subretiniano en ratas. Se ha incluido una descripción completa y fácil de usar de los pasos críticos. Este protocolo se ha desarrollado como un procedimiento quirúrgico rentable para la reproducibilidad en diferentes estudios preclínicos en ratas. Se requiere una miniaturización adecuada de un implante de tamaño humano antes de realizar el experimento quirúrgico, que incluye ajustes en las dimensiones del implante. Se utiliza un enfoque externo en lugar de un procedimiento intravítreo para colocar el implante en el espacio subretiniano. Con ayuda de una pequeña aguja afilada, se realiza una incisión escleral en el cuadrante temporal superior, seguida de una paracentesis para reducir la presión intraocular, minimizando así la resistencia durante la implantación quirúrgica. A continuación, se lleva a cabo una inyección de solución salina equilibrada (BSS) a través de la incisión para lograr el desprendimiento focal de retina (RD). Por último, se lleva a cabo la inserción y visualización del implante en el espacio subretiniano. La evaluación postoperatoria de la colocación subretiniana del implante incluye imágenes mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT). Los seguimientos por imágenes determinan la estabilidad subretiniana del implante, antes de que los ojos sean extraídos y fijados para el análisis histológico.

Introducción

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. El número de personas afectadas por la DMAE en 2020 se estimó en 196 millones, y se prevé que aumente a unos 288 millones en 2040¹. En la última década, se han desarrollado varias terapias para mitigar los cambios visuales asociados con las etapas tardías de la DMAE, principalmente para tratar el desarrollo y la progresión de la neovascularización coroidea observada en la DMAE húmeda. Por el contrario, se ha estimado que el tratamiento de la DMAE seca, en la que la disfunción y la pérdida de las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) progresan a EPR y atrofia de la retina, representa entre el 85% y el 90% de la DMAE, con una prevalencia del 0,44% en todo el mundo ^1,2. La DMAE se ha descrito como una enfermedad multifactorial con factores de la edad, la genética y el entorno que contribuyen a la aparición y progresión de la enfermedad; Se están desarrollando varias terapias para abordar las diferentes vías fisiopatológicas asociadas a esta enfermedad³.

La terapia basada en células madre se ha desarrollado como una nueva opción terapéutica para reemplazar el EPR fallido en la DMAE^{seca 4}. A pesar de que el uso de células madre pluripotentes aún se encuentra en ensayos clínicos tempranos, la seguridad ha sido demostrada en varios ensayos clínicos ^5,6,7. Hasta la fecha, existen dos vías principales para desplegar las células madre en el espacio subretiniano: la suspensión o la inserción de un parche monocapa sembrado sobre un implante biocompatible 8,9,10,11,12. Las nuevas estrategias que utilizan terapias basadas en células madre en estudios preclínicos requieren modelos animales en los que las terapias basadas en células madre puedan administrarse en el mismo sitio objetivo que se prevé en los seres humanos. La diferencia en la anatomía podría exigir cambios menores en los procedimientos, el equipo quirúrgico y el enfoque en comparación con los utilizados con el producto humano final^13,14. La modificación de las técnicas quirúrgicas oculares es uno de los cambios necesarios que ha sido ampliamente descrito como un abordaje exitoso para su uso en diferentes modelos animales 15,16,17.

Aunque publicaciones anteriores han mencionado técnicas quirúrgicas para implantes subretinianos en ratas, no hay descripciones exhaustivas de dichas técnicas para superar las dificultades técnicas que los investigadores pueden encontrar. Por lo tanto, es necesario describir adecuadamente las técnicas quirúrgicas en detalle, proporcionar las mejores prácticas y lecciones aprendidas para evitar y, si es necesario, abordar los problemas durante los pasos críticos a lo largo del procedimiento. El propósito de este manuscrito es proporcionar una guía completa para la implantación quirúrgica del implante en el espacio subretiniano en ratas.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de California (IACUC) y se realizaron siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. En el presente estudio se utilizaron un total de 12 ratas macho del Royal College of Surgeon (RCS). Los animales se criaron en el animalario y se incluyeron en el estudio una vez que alcanzaron la edad de 28 ± 1 días después del parto. Se realizó un examen ocular completo para verificar la ausencia de anomalías oculares. Los implantes subretinianos, membranas ultrafinas hechas de parileno C y recubiertas con vitronectina, fueron diseñados por una organización comercial específica (ver Tabla de Materiales). Estas membranas replican las membranas de tamaño humano en términos de espesor y permeabilidad (marco de malla de 6,0 μm de espesor con poros circulares de 20 μm en las áreas ultrafinas). Se logró miniaturizar la longitud y el ancho (1,0 mm × 0,4 mm) de membranas de tamaño humano para acomodar los implantes subretinianos dentro de los ojos de los roedores¹⁸.

1. Cuidado de los animales y preparación quirúrgica

1. Pesar al animal para calcular la dosis de anestesia y anestesiar siguiendo el paso 1.2.
2. Anestesiar al animal mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y xilacina (35-50 mg/kg y 5-10 mg/kg, respectivamente; ver Tabla de Materiales). Inyecte con una jeringa de 1,0 ml y una aguja de 30 g.
3. Cargue otra jeringa de 1.0 mL con la mitad de la cantidad de la mezcla de la anestesia (ketamina y xilacina) para mantener el nivel adecuado de anestesia durante el procedimiento.
4. Confirmar una anestesia adecuada por la ausencia de un reflejo pedal (pellizco firme de los dedos del pie).
5. Para visualizar correctamente la cavidad vítrea y la retina, dilatar la pupila mediante la instilación de gotas oftálmicas de tropicamida al 1% y fenilefrina al 2,5% (ver Tabla de materiales) en el ojo tratado.
   1. Aplicar una segunda dosis de colirio dilatador a los 5 min.
6. Aplique lágrimas artificiales o gel lubricante ocular en el ojo no quirúrgico cada 5-10 minutos mientras el animal está anestesiado para hidratar la córnea.
7. Coloque un paño estéril sobre la almohadilla térmica (consulte la Tabla de materiales). Coloque un paño estéril cubriendo la bandeja quirúrgica.
8. Prepare el área quirúrgica estéril colocando los siguientes instrumentos estériles en la bandeja quirúrgica: guantes quirúrgicos, implante subretiniano y herramientas quirúrgicas: pinzas para mosquitos (3), tijeras finas microquirúrgicas (1), portaagujas (1), pinzas finas con dientes (1), pinzas rectas finas sin dientes (2), jeringa de microlitros (1), aguja roma de 32 G (1), aguja de 27 G o 30 G (2), Sutura de seda 4-0 (3), hisopos de algodón, solución salina equilibrada (BSS) y un cubreobjetos (ver Tabla de Materiales).
9. En condiciones estériles y con guantes estériles, cargue la jeringa de microlitros con el BSS y coloque la aguja roma de 32 G.
10. Inserte el intercambiador de algodón en el cubo de la aguja de 27 G o 30 G para crear un mango para una manipulación más sensible de la aguja.
11. Para mantener las condiciones estériles durante todo el procedimiento, cambie los guantes estériles si se manipulan instrumentos o áreas no estériles, como el microscopio quirúrgico.

2. Abordaje escleral para el implante subretiniano: técnica quirúrgica

1. Exponga el área quirúrgica siguiendo los pasos a continuación.
   1. Una vez que el animal esté bajo anestesia y la pupila esté dilatada (paso 1.5), coloque el animal boca abajo con la cabeza hacia el investigador.
      NOTA: Mantenga a la rata en la almohadilla térmica cubierta con un paño estéril durante toda la cirugía y hasta que el animal esté completamente recuperado.
   2. Aplique gotas de povidona al 5% (ver Tabla de materiales) sobre el ojo y limpie la superficie del ojo y los párpados con hisopos de algodón.
   3. Coloque y ajuste el microscopio quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) sobre el ojo quirúrgico.
      NOTA: Se recomienda utilizar un microscopio oftálmico quirúrgico durante todo el procedimiento quirúrgico para obtener una visualización más nítida y grande de las estructuras oculares.
   4. Asegure la exposición adecuada del área quirúrgica levantando el párpado superior y sobresaliendo el globo ocular con suturas 4-0 no absorbibles.
      1. Eleve el párpado superior con una sutura de seda 4-0. Colocar la sutura en la cara anterior de los párpados a la altura de las glándulas de Meibomio. Asegure la sutura de tracción sujetando las pinzas antimosquitos a la superficie quirúrgica.
         NOTA: Si la sutura se coloca más alto que el nivel de la glándula de Meibomio, se producirá una eversión del párpado en lugar de una elevación del párpado.
      2. Realizar la peritomía del cuadrante temporal superior con tijera fina microquirúrgica.
      3. Colocar dos suturas de tracción para permitir la protrusión y el desplazamiento hacia adelante del globo ocular. Realizar el aislamiento del músculo recto superior.
         1. Mediante la manipulación suave del ojo con pinzas de dientes finos (pinzas de 0,12 mm) en la cara superior del limbo, gire el ojo hacia abajo para exponer la esclerótica.
         2. Coloque una sutura de seda 4-0 detrás del limbo superior hasta 1 mm de distancia, que es la ubicación del músculo extraocular superior. Sujete ambas colas de la sutura con pinzas para mosquitos.
      4. Realizar el aislamiento del músculo recto temporal. Colocar una segunda sutura (seda 4-0) a una distancia de hasta 1 mm del limbo en el cuadrante temporal (en la zona correspondiente del músculo extraocular temporal). Sujete ambas colas de la sutura con pinzas para mosquitos.
      5. Una vez que ambas suturas del músculo extraocular estén correctamente colocadas y sujetadas, tire de las suturas hacia abajo y hacia adentro para exponer el cuadrante temporal superior de la esclerótica.
   5. Extienda la peritomía hacia la parte posterior del ojo con tijeras finas microquirúrgicas.
   6. Controle el sangrado conjuntival mediante el uso de hisopos de algodón.
2. Realice la incisión escleral, el desprendimiento de retina (RD) y la inserción del implante siguiendo los pasos a continuación.
   1. Realice la incisión escleral con una aguja de 27 G o 30 G. Asegúrese de que el tamaño de la incisión sea de ~ 1,2 mm y sea de 1,5 mm posterior al limbo.
      NOTA: Se recomienda el desarrollo de una configuración de incisión escleral en forma de túnel para estabilizar las estructuras intraoculares mientras se manipula el ojo y se introduce el implante. Esta forma de incisión evitará fluctuaciones bruscas en la presión intraocular.
   2. A veces, la configuración adecuada requiere práctica. Por lo tanto, si no se logra una configuración adecuada, se libera algo de tensión de las suturas de tracción del músculo extraocular para facilitar el mantenimiento de las estructuras oculares dentro de la cavidad vítrea.
   3. Utilizando la misma aguja utilizada para la incisión escleral (27 G o 30 G), se realiza una paracentesis en la córnea periférica en el mismo cuadrante.
   4. Inserte la aguja roma de 32 G montada en una jeringa de microlitros a través de la incisión escleral.
   5. Inyecte 100 μL de BSS para crear un RD focal.
   6. Suelte las suturas de tracción del músculo extraocular para que el ojo vuelva a su posición normal.
   7. Para la visualización directa de la RD, apoye y sostenga el cubreobjetos, cargado con gel lubricante oftálmico, sobre la córnea.
   8. Ajuste el objetivo del microscopio para enfocar la retina.
   9. Si el RD no se observa o es demasiado pequeño (menor que el tamaño de un cuadrante), realice una segunda inyección de BSS para lograr el tamaño de RD deseado girando el ojo hacia abajo y hacia adentro y repitiendo los pasos 2.2.4 a 2.2.8.
   10. Una vez completado el RD, verifique la longitud escleral (como se mencionó en el paso 2.2.1) con un calibrador (ver Tabla de Materiales).
   11. Cortar el tejido coroideo en ambas direcciones con unas tijeras microquirúrgicas finas.
   12. Pase la aguja roma hacia los lados a lo largo de la incisión escleral para verificar que se hayan diseccionado todas las estructuras esclerales y coroideas.
   13. Inserte el implante en el espacio subretiniano.
   14. Con dos pinzas quirúrgicas finas, como pinzas de atar (consulte la Tabla de materiales), agarre el implante por la parte posterior para no dañar la parte activa del implante.
   15. Coloque el implante paralelo al plano de incisión y deslícelo suavemente en el implante.
   16. Una vez que el implante esté completamente introducido en el espacio subretiniano, suéltelo y empuje el implante más adentro introduciendo los maxilares de una de las pinzas de 1-1,5 mm en la incisión.
   17. Liberar las suturas traccionales del músculo extraocular y verificar la colocación del implante utilizando el microscopio y el cubreobjetos como se ha descrito anteriormente (pasos 2.2.7 y 2.2.8).
3. Suelta y retira todas las suturas.
   NOTA: Una vez concluido el procedimiento quirúrgico, se realiza la SD-OCT (paso 3) para validar los hallazgos clínicos. La sesión de imágenes SD-OCT se lleva a cabo inmediatamente después de la cirugía. Si no se obtuvo una visualización adecuada de la ubicación del implante, se debe realizar nuevamente la SD-OCT 7-10 días después de la cirugía.

3. Imágenes SD-OCT

1. Haga clic en el icono de Heidelberg Eye Explorer (un software de gestión de imágenes; consulte la tabla de materiales) en la pantalla del escritorio.
2. Haga clic en el icono Nuevo paciente en la parte superior de la pantalla.
   1. Complete toda la información solicitada para generar la identificación del animal y haga clic en Aceptar.
   2. Seleccione el sistema de imágenes OCT (HRA + OCT; consulte la tabla de materiales) para el tipo de dispositivo.
   3. Seleccione el operador y pulse OK.
   4. Para obtener la opción correcta de curvatura de la córnea, presione el botón OK para aceptar los datos oculares predeterminados.
3. Asegúrese de que la ventana de adquisición de SD-OCT esté iniciada y lista para SD-OCT.
4. Encienda la cámara SD-OCT presionando el botón amarillo de inicio ubicado en la pantalla táctil junto a la cámara.
5. Coloque al animal en el escenario para animales SD-OCT que se ha adaptado encima del reposacabezas SD-OCT.
   NOTA: La adaptación de la etapa del animal incluye una pieza de espuma de poliestireno (ver Tabla de Materiales) para que quepa dentro de la etapa de la cabeza SD-OCT que sea lo suficientemente grande como para colocar al animal, incluida la almohadilla térmica.
6. Ajuste la altura de la mesa y la posición del animal para alinear la pupila con el centro de la lente SD-OCT.
   NOTA: Una vez que el ojo esté alineado, aparecerá una imagen infrarroja (IR) en vivo en la pantalla.
7. Presione el botón IR + OCT en la pantalla táctil o el botón OCT en la parte inferior derecha del monitor para iniciar la adquisición de imágenes.
8. Una vez que la SD-OCT se ponga en marcha, seleccione un único modo de escaneo con el número más alto (100) de fotogramas ART. El modo de escaneo 100 ART es el modo predeterminado.
9. Con el joystick de la cámara, centre el nervio óptico en la imagen infrarroja.
10. Empuje la cámara hacia adelante hasta que la imagen infrarroja se llene uniformemente con la imagen de la retina.
    NOTA: Las esquinas oscuras indican que la cámara está demasiado lejos o cerca del ojo.
11. Mueva la cámara hacia los lados hasta que el implante se visualice en la cara temporal de la retina. Utilice la imagen IR para guiar los movimientos.
12. Para visualizar el implante mediante el B-scan, presione CTRL + ALT + SHIFT + O simultáneamente para mostrar la ventana de ajuste del B-scan SD-OCTA.
13. Ajuste el "Brazo de referencia" (en la parte inferior de la ventana) hasta que la retina/implante se visualice en la imagen SD-OCT.
    NOTA: La imagen SD-OCT debe mostrarse dentro de las esquinas de referencia azules.
14. Cierre la ventana.
15. Con el joystick y el mango de la cámara, deslice y gire la cámara en todas las direcciones hasta obtener una imagen de calidad SD-OCT mejor, más plana y más nítida.
16. Arrastre la flecha azul en la imagen IR hasta que se coloque a lo largo del implante.
17. Una vez que la saturación y la ubicación del B-scan sean óptimas, active el "Seguimiento automático en tiempo real (ART)" presionando el botón negro de control de ganancia debajo de la pantalla táctil.
18. Una vez que el ART alcance los 100 fotogramas, pulse Adquirir en la pantalla táctil.
19. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, haga clic en Guardar imágenes en la parte superior de la ventana y luego haga clic en Salir.
20. Mantenga la córnea húmeda durante toda la sesión de imágenes aplicando gotas lubricantes para los ojos con frecuencia (cada 5 minutos).

4. Recuperación de animales

1. Al final de la sesión de imagen, aplique una pomada antibiótica en la córnea para prevenir la infección ocular e hidratar la córnea.
2. Mantenga al animal descansando sobre su vientre en la almohadilla térmica hasta que esté completamente recuperado (~ 20-30 min) y deambulatorio.
3. Administre analgésicos sistémicos (1,0-1,2 mg/kg de buprenorfina SR una vez subcutáneo; ver Tabla de materiales) al final del procedimiento quirúrgico.
4. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente.
5. No devuelva el animal a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
6. Una vez que esté completamente recuperado, vuelva a colocar al animal en el área de alojamiento con acceso a comida y agua ad libitum.

Resultados

La implantación de un implante subretiniano en ratas RCS (N = 12) demostró la viabilidad y reproducibilidad de la técnica quirúrgica para el parto subretiniano en ratas. En este estudio, el ojo derecho fue el ojo tratado (N = 12) con el implante. En la evaluación clínica realizada al final del procedimiento con el microscopio quirúrgico, nueve de los 12 ojos tratados mostraron una localización subretiniana del implante (75,00%), dos ojos (16,67%) se identificaron como una colocac...

Discusión

Aunque el procedimiento se ha descrito previamente con ligeras variaciones, el objetivo de este manuscrito es proporcionar una descripción completa de un procedimiento quirúrgico para implantes subretinianos en ratas que se debe seguir mientras se aprende la técnica y para superar los desafíos quirúrgicos y las posibles complicaciones que los investigadores pueden encontrar. El protocolo quirúrgico descrito aquí incluye el uso de la membrana de parileno ultradelgada que ha sido am...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe	VWR	BD309659
27 G needle 1/2''	VWR	BD305109
30 G needle 1/2''	VWR	BD305106
32 G Blunt needle - Small hub RN	Hamilton	7803-04
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5	Ethicon	1984G
6'' sterile cotton tips	VWR	10805-154
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution	Alcon	8007-1
BSS irrigating solution 15 mL	Accutome	Ax17362
Buprenorphine ER	ZooPharm	N/A
Castroviejo Caliper	Storz	E2405
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm	Storz	E1796
Clayman-Vannas scissors straight	Storz	E3383S
Cover glass, square	WVR	48366-227
EPS Polystyrene block	Silverlake LLC	CFB8x12x2
Gonak 15 mL	Accutome	Ax10968	Eye lubricant
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic	Storz	E6772
Hamilton syringe 700 series 100 µL	Hamilton	7638-01
HEYEX Software	Heidelberg	N/A	an image management software
Kelman-McPherson tying forceps angled	Storz	E1815 AKUS
Ketamine (100 mg/mL)	MWI	501072
Needle holder 9mm curved fine locking	Storz	3-302
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g	Accutome	Ax0720
Ophthalmic surgical microscope	Zeiss	SN: 233922
Phenylephrine 2.5% 15 mL	Accutome	Ax0310
Spectralis SD-OCT	Heidelberg	SPEC-CAM-011210s3600
Sterile Drape	VWR	100229-300
Sterile surgical gloves	VWR	89233-804
T-Pump heating system	Gaymar	TP650
Tropicamide 1% 15 mL	Accutome	Ax0330
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin	Mini Pumps LLC, CA	specifically designed for this study	used as subretinal implants
Xylazine (100 mg/mL)	MWI	510650