Sviluppo di una tecnica chirurgica per impianti sottoretinici nei ratti

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'approccio sclerale per l'impianto di dispositivi sottoretinici, una tecnica chirurgica fattibile per l'implementazione in modelli animali di malattie retiniche in ricerca.

Abstract

La degenerazione retinica, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Sono stati intrapresi una miriade di approcci per sviluppare terapie basate sulla medicina rigenerativa per l'AMD, comprese le terapie basate sulle cellule staminali. I roditori come modelli animali per la degenerazione retinica sono una base per la ricerca traslazionale, a causa dell'ampio spettro di ceppi che sviluppano malattie da degenerazione retinica in diversi stadi. Tuttavia, imitare la somministrazione terapeutica umana di impianti sottoretinici nei roditori è impegnativa, a causa di differenze anatomiche come le dimensioni della lente e il volume del vitreo. Questo protocollo chirurgico mira a fornire un metodo guidato per il trapianto di impianti nello spazio sottoretinico nei ratti. È stata inclusa una descrizione completa e di facile utilizzo dei passaggi critici. Questo protocollo è stato sviluppato come procedura chirurgica efficiente in termini di costi per la riproducibilità in diversi studi preclinici sui ratti. Prima di condurre l'esperimento chirurgico è necessaria un'adeguata miniaturizzazione di un impianto di dimensioni umane, che include la regolazione delle dimensioni dell'impianto. Viene utilizzato un approccio esterno invece di una procedura intravitreale per consegnare l'impianto nello spazio sottoretinico. Utilizzando un piccolo ago affilato, viene eseguita un'incisione sclerale nel quadrante temporale superiore, seguita da paracentesi per ridurre la pressione intraoculare, riducendo così al minimo la resistenza durante l'impianto chirurgico. Successivamente, viene eseguita un'iniezione di soluzione salina bilanciata (BSS) attraverso l'incisione per ottenere il distacco focale della retina (RD). Infine, vengono condotti l'inserimento e la visualizzazione dell'impianto nello spazio sottoretinico. La valutazione post-operatoria del posizionamento sottoretinico dell'impianto include l'imaging mediante tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT). I follow-up di imaging accertano la stabilità sottoretinica dell'impianto, prima che gli occhi vengano prelevati e fissati per l'analisi istologica.

Introduzione

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Il numero di persone affette da AMD nel 2020 è stato stimato a 196 milioni e si prevede che aumenterà a circa 288 milioni entro il 2040¹. Nell'ultimo decennio, sono state sviluppate diverse terapie per mitigare i cambiamenti visivi associati agli stadi tardivi dell'AMD, principalmente per trattare lo sviluppo e la progressione della neovascolarizzazione coroideale osservata nell'AMD umida. Al contrario, si stima che il trattamento dell'AMD secca, in cui la disfunzione e la perdita delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) progrediscono verso l'RPE e l'atrofia retinica, rappresenti dall'85% al 90% dell'AMD, con una prevalenza dello 0,44% in tutto il mondo ^1,2. L'AMD è stata descritta come una malattia multifattoriale con fattori di età, genetici e ambientali che contribuiscono all'insorgenza e alla progressione della malattia; Diverse terapie sono in fase di sviluppo per affrontare i diversi percorsi fisiopatologici associati a questa malattia³.

La terapia a base di cellule staminali è stata sviluppata come nuova opzione terapeutica per sostituire l'RPE fallimentare nell'AMD⁴ secca. Sebbene l'uso di cellule staminali pluripotenti sia ancora in fase di studi clinici iniziali, la sicurezza è stata dimostrata in diversi studi clinici ^5,6,7. Ad oggi, ci sono due percorsi principali per distribuire le cellule staminali nello spazio sottoretinico: la sospensione o l'inserimento di un cerotto monostrato seminato su un impianto biocompatibile 8,9,10,11,12. Le nuove strategie che utilizzano terapie basate su cellule staminali negli studi preclinici richiedono modelli animali in cui le terapie basate su cellule staminali possono essere somministrate nello stesso sito mirato previsto negli esseri umani. La differenza di anatomia potrebbe richiedere piccole modifiche alle procedure, alle attrezzature chirurgiche e all'approccio rispetto a quelli utilizzati con il prodotto umano finale^13,14. La modifica delle tecniche chirurgiche oculari è uno dei cambiamenti necessari che è stato ampiamente descritto come un approccio di successo per l'uso in diversi modelli animali 15,16,17.

Sebbene precedenti pubblicazioni abbiano menzionato tecniche chirurgiche per impianti sottoretinici nei ratti, non ci sono descrizioni complete di tali tecniche per superare le difficoltà tecniche che i ricercatori possono incontrare. Pertanto, è necessario descrivere adeguatamente le tecniche chirurgiche in dettaglio, fornire le migliori pratiche e le lezioni apprese per evitare e, se necessario, affrontare i problemi durante le fasi critiche della procedura. Lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire una linea guida completa per l'impianto chirurgico dell'impianto nello spazio sottoretinico nei ratti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della University of Southern California e sono stati eseguiti seguendo la Guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la Dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. Nel presente studio sono stati utilizzati un totale di 12 ratti maschi del Royal College of Surgeon (RCS). Gli animali sono stati allevati nella struttura per animali e inclusi nello studio una volta raggiunta l'età di 28 anni ± 1 giorni dopo la nascita. È stato eseguito un esame oculistico completo per verificare l'assenza di anomalie oculari. Gli impianti sottoretinici, membrane ultrasottili realizzate in Parylene C e rivestite con vitronectina, sono state progettate da una specifica organizzazione commerciale (vedi Tabella dei Materiali). Queste membrane replicano membrane di dimensioni umane in termini di spessore e permeabilità (telaio a rete di 6,0 μm di spessore con pori circolari di 20 μm nelle aree ultrasottili). La miniaturizzazione della lunghezza e della larghezza (1,0 mm × 0,4 mm) delle membrane di dimensioni umane è stata ottenuta per accogliere gli impianti sottoretinici all'interno degli occhi dei roditori¹⁸.

1. Cura degli animali e preparazione chirurgica

1. Pesare l'animale per calcolare il dosaggio di anestesia e anestetizzare seguendo il passaggio 1.2.
2. Anestetizzare l'animale mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina e xilazina (35-50 mg/kg e 5-10 mg/kg, rispettivamente; vedi Tabella dei materiali). Iniettare con una siringa da 1,0 ml e un ago da 30 G.
3. Caricare un'altra siringa da 1,0 ml con metà della quantità della miscela di anestesia (ketamina e xilazina) per mantenere il corretto livello di anestesia durante la procedura.
4. Confermare un'anestesia adeguata dall'assenza di un riflesso del pedale (pizzicamento deciso delle dita).
5. Per visualizzare correttamente la cavità vitreale e la retina, dilatare la pupilla mediante l'instillazione di un collirio tropicammide all'1% e di fenilefrina al 2,5% (vedi Tabella dei materiali) nell'occhio trattato.
   1. Applicare una seconda dose di collirio dilatatore dopo 5 minuti.
6. Applicare lacrime artificiali o gel lubrificante oculare nell'occhio non chirurgico ogni 5-10 minuti mentre l'animale è anestetizzato per idratare la cornea.
7. Posizionare un telo sterile sul termoforo (vedi Tabella dei materiali). Posizionare un telo sterile che copra il vassoio chirurgico.
8. Preparare l'area chirurgica sterile posizionando i seguenti strumenti sterili sul vassoio chirurgico: guanti chirurgici, impianto sottoretinico e strumenti chirurgici: pinza per zanzare (3), forbici fini microchirurgiche (1), portaaghi (1), pinza fine con denti (1), pinza fine dritta senza denti (2), siringa da microlitro (1), ago smussato da 32 G (1), ago da 27 G o 30 G (2), Sutura di seta 4-0 (3), tamponi di cotone, soluzione salina bilanciata (BSS) e vetrino coprioggetto (vedi Tabella dei materiali).
9. In condizioni sterili e utilizzando guanti sterili, caricare la siringa da microlitri con il BSS e inserire l'ago smussato da 32 G.
10. Inserisci il batuffolo di cotone nel mozzo dell'ago da 27 g o 30 g per creare un'impugnatura per una manipolazione più sensibile dell'ago.
11. Per mantenere le condizioni di sterilità durante tutta la procedura, sostituire i guanti sterili se vengono manipolati strumenti o aree non sterili, come il microscopio operatorio.

2. Approccio sclerale per l'impianto sottoretinico: tecnica chirurgica

1. Esporre l'area chirurgica seguendo i passaggi seguenti.
   1. Una volta che l'animale è sotto anestesia e la pupilla è dilatata (passaggio 1.5), posiziona l'animale a pancia in giù con la testa rivolta verso il ricercatore.
      NOTA: Tenere il ratto sul termoforo coperto con un telo sterile durante l'intero intervento chirurgico e fino a quando l'animale non si è completamente ripreso.
   2. Applicare gocce di povidone al 5% (vedi Tabella dei materiali) sull'occhio e pulire la superficie oculare e le palpebre con tamponi di cotone.
   3. Posizionare e regolare il microscopio operatorio (vedere la Tabella dei materiali) sull'occhio operatorio.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare un microscopio oftalmico chirurgico durante l'intera procedura chirurgica per ottenere una visualizzazione più nitida e più ampia delle strutture oculari.
   4. Garantire una corretta esposizione dell'area chirurgica sollevando la palpebra superiore e sporgendo il bulbo oculare utilizzando suture 4-0 non assorbibili.
      1. Sollevare la palpebra superiore utilizzando una sutura di seta 4-0. Posizionare la sutura nella parte anteriore delle palpebre a livello delle ghiandole di Meibomio. Fissare la sutura trazionale bloccando le pinze antizanzare alla superficie chirurgica.
         NOTA: Se la sutura è posizionata più in alto del livello della ghiandola di Meibomio, si verificherà l'eversione della palpebra invece dell'elevazione della palpebra.
      2. Eseguire la peritomia del quadrante temporale superiore utilizzando le forbici fini microchirurgiche.
      3. Posizionare due suture di trazione per consentire la sporgenza e lo spostamento in avanti del bulbo oculare. Eseguire l'isolamento del muscolo retto superiore.
         1. Attraverso una delicata manipolazione dell'occhio con una pinza a denti sottili (pinza da 0,12 mm) nella parte superiore del limbus, ruotare l'occhio verso il basso per esporre la sclera.
         2. Posizionare una sutura di seta 4-0 dietro il limbus superiore fino a 1 mm di distanza, che è la posizione del muscolo extraoculare superiore. Bloccare entrambe le code della sutura utilizzando una pinza per zanzare.
      4. Eseguire l'isolamento del muscolo retto temporale. Posizionare una seconda sutura (seta 4-0) fino a 1 mm di distanza dal limbus nel quadrante temporale (nell'area corrispondente del muscolo extraoculare temporale). Bloccare entrambe le code della sutura utilizzando una pinza per zanzare.
      5. Una volta che entrambe le suture muscolari extraoculari sono posizionate e bloccate correttamente, tirare le suture verso il basso e verso l'interno per esporre il quadrante temporale superiore della sclera.
   5. Estendere la peritomia verso la parte posteriore dell'occhio con le forbici fini microchirurgiche.
   6. Controllare il sanguinamento congiuntivale utilizzando tamponi di cotone.
2. Eseguire l'incisione sclerale, il distacco della retina (RD) e l'inserimento dell'impianto seguendo i passaggi seguenti.
   1. Eseguire l'incisione sclerale utilizzando un ago da 27 G o 30 G. Assicurarsi che la dimensione dell'incisione sia di ~1,2 mm e di 1,5 mm posteriormente al limbus.
      NOTA: Si raccomanda lo sviluppo di una configurazione di incisione sclerale a tunnel per stabilizzare le strutture intraoculari durante la manipolazione dell'occhio e l'introduzione dell'impianto. Questa forma di incisione impedirà improvvise fluttuazioni della pressione intraoculare.
   2. A volte, una corretta configurazione richiede pratica. Pertanto, se non si ottiene una configurazione corretta, rilasciare un po' di tensione dalle suture di trazione del muscolo extraoculare per facilitare il mantenimento delle strutture oculari all'interno della cavità vitreale.
   3. Utilizzando lo stesso ago utilizzato per l'incisione sclerale (27 G o 30 G), eseguire la paracentesi nella cornea periferica nello stesso quadrante.
   4. Inserire l'ago smussato da 32 G montato su una siringa da microlitri attraverso l'incisione sclerale.
   5. Iniettare 100 μL di BSS per creare una RD focale.
   6. Rilasciare le suture di trazione del muscolo extraoculare per riportare l'occhio nella posizione regolare.
   7. Per la visualizzazione diretta dell'RD, appoggiare e tenere premuto il vetrino coprioggetti, caricato con gel lubrificante oftalmico, sulla cornea.
   8. Regolare l'obiettivo del microscopio per mettere a fuoco la retina.
   9. Se la RD non viene osservata o è troppo piccola (più piccola della dimensione di un quadrante), eseguire una seconda iniezione di BSS per ottenere la dimensione RD desiderata ruotando l'occhio verso il basso e verso l'interno e ripetendo i passaggi da 2.2.4 a 2.2.8.
   10. Una volta completata la RD, verificare la lunghezza sclerale (come indicato al punto 2.2.1) con un calibro (vedi Tabella dei Materiali).
   11. Tagliare il tessuto coroideale in entrambe le direzioni con sottili forbici microchirurgiche.
   12. Far scorrere l'ago smussato lateralmente lungo l'incisione sclerale per verificare che tutte le strutture sclerali e coroideali siano state sezionate.
   13. Inserire l'impianto nello spazio sottoretinico.
   14. Utilizzando due pinze chirurgiche sottili, come le pinze da legatura (vedi Tabella dei materiali), afferrare l'impianto dalla parte posteriore in modo da non danneggiare la parte attiva dell'impianto.
   15. Posizionare l'impianto parallelamente al piano di incisione e farlo scorrere delicatamente nell'impianto.
   16. Una volta che l'impianto è stato completamente introdotto nello spazio sottoretinico, rilasciarlo e spingere ulteriormente l'impianto all'interno introducendo le mascelle di una delle pinze di 1-1,5 mm nell'incisione.
   17. Rilasciare le suture trazionali del muscolo extraoculare e verificare il posizionamento dell'impianto utilizzando il microscopio e il vetrino coprioggetti come descritto sopra (passaggi 2.2.7 e 2.2.8).
3. Rilasciare e rimuovere tutti i punti di sutura.
   NOTA: Dopo aver concluso la procedura chirurgica, viene eseguita la SD-OCT (fase 3) per convalidare i risultati clinici. La sessione di imaging SD-OCT viene condotta subito dopo l'intervento. Se non è stata ottenuta una corretta visualizzazione della posizione dell'impianto, eseguire nuovamente l'SD-OCT 7-10 giorni dopo l'intervento.

3. Imaging SD-OCT

1. Fare clic sull'icona Heidelberg Eye Explorer (un software di gestione delle immagini; vedere Tabella dei materiali) sullo schermo del desktop.
2. Fare clic sull'icona Nuovo paziente nella parte superiore dello schermo.
   1. Completa tutte le informazioni richieste per generare l'ID dell'animale e clicca su Accetta.
   2. Selezionare il sistema di imaging OCT (HRA + OCT; vedere Tabella dei materiali) per il tipo di dispositivo.
   3. Selezionare l'operatore e premere OK.
   4. Per l'opzione di curvatura della cornea corretta, premere il pulsante OK per accettare i dati oculari predefiniti.
3. Assicurarsi che la finestra di acquisizione SD-OCT sia avviata e pronta per SD-OCT.
4. Accendere la fotocamera SD-OCT premendo il pulsante Start giallo situato sul display touchscreen accanto alla fotocamera.
5. Posizionare l'animale sul tavolino per animali SD-OCT che è stato adattato sopra il poggiatesta SD-OCT.
   NOTA: L'adattamento del tavolino per animali include un pezzo di polistirene espanso (vedi Tabella dei materiali) per adattarsi all'interno del tavolino di testa SD-OCT che è abbastanza grande da poter posizionare l'animale, compreso il termoforo.
6. Regolare l'altezza del tavolo e la posizione dell'animale per allineare la pupilla con il centro della lente SD-OCT.
   NOTA: Una volta che l'occhio è allineato, sullo schermo apparirà un'immagine dal vivo a infrarossi (IR).
7. Premere il pulsante IR + OCT sul touch screen o il pulsante OCT in basso a destra del monitor per avviare l'acquisizione dell'immagine.
8. Una volta che l'SD-OCT è attivo, selezionare una modalità di scansione singola con il numero più alto (100) di fotogrammi ART. La modalità di scansione 100 ART è la modalità predefinita.
9. Utilizzando il joystick della telecamera, centrare il nervo ottico sull'immagine IR.
10. Spingere la fotocamera in avanti fino a quando l'immagine IR non è riempita uniformemente con l'immagine retinica.
    NOTA: Gli angoli scuri indicano che la fotocamera è troppo lontana o vicina all'occhio.
11. Spostare la telecamera lateralmente fino a quando l'impianto non viene visualizzato nell'aspetto temporale della retina. Usa l'immagine IR per guidare i movimenti.
12. Per visualizzare l'impianto tramite il B-scan, premere contemporaneamente CTRL + ALT + SHIFT + O per visualizzare la finestra di regolazione del B-scan SD-OCT.
13. Regolare il "Braccio di riferimento" (nella parte inferiore della finestra) fino a quando la retina/impianto non viene visualizzato nell'immagine SD-OCT.
    NOTA: L'immagine SD-OCT deve essere visualizzata all'interno degli angoli di riferimento blu.
14. Chiudi la finestra.
15. Utilizzando il joystick e l'impugnatura della telecamera, far scorrere e ruotare la telecamera in tutte le direzioni fino a ottenere un'immagine di qualità SD-OCT migliore, più piatta e più nitida.
16. Trascinare la freccia blu sull'immagine IR fino a posizionarla lungo l'impianto.
17. Una volta che la saturazione e il posizionamento del B-scan sono ottimali, attivare l'"Automatic Real-time Tracking (ART)" premendo il pulsante nero Gain Control sotto il touch screen.
18. Una volta che l'ART raggiunge i 100 fotogrammi, premere Acquisisci sul touch screen.
19. Quando tutte le immagini sono state acquisite, fai clic su Salva immagini nella parte superiore della finestra e quindi fai clic su Esci.
20. Mantenere la cornea umida durante l'intera sessione di imaging applicando frequentemente colliri lubrificanti (ogni 5 minuti).

4. Recupero degli animali

1. Al termine della sessione di imaging, applicare un unguento antibiotico sulla cornea per prevenire l'infezione oculare e idratare la cornea.
2. Tenere l'animale a riposo a pancia in giù sul termoforo fino a quando non si riprende completamente (~20-30 min) e ambulamenta.
3. Somministrare analgesici sistemici (1,0-1,2 mg/kg di buprenorfina SR una volta sottocutaneo; vedere Tabella dei materiali) al termine della procedura chirurgica.
4. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso sufficiente conoscenza.
5. Non restituire l'animale alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
6. Una volta completamente recuperato, riposizionare l'animale nell'area di stabulazione con accesso a cibo e acqua ad libitum.

Risultati

L'impianto di un impianto sottoretinico in ratti RCS (N = 12) ha dimostrato la fattibilità e la riproducibilità della tecnica chirurgica per il rilascio sottoretinico nei ratti. In questo studio, l'occhio destro era l'occhio trattato (N = 12) con l'impianto. Nella valutazione clinica condotta al termine della procedura con il microscopio operatorio, nove dei 12 occhi trattati hanno dimostrato una localizzazione sottoretinica dell'impianto (75,00%), due occhi (16,67%) sono stati identif...

Discussione

Sebbene la procedura sia stata precedentemente descritta con lievi variazioni, lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire una descrizione completa di una procedura chirurgica per impianti sottoretinici nei ratti da seguire durante l'apprendimento della tecnica e per superare le sfide chirurgiche e le potenziali complicanze che gli investigatori possono incontrare. Il protocollo chirurgico qui descritto include l'uso della membrana ultrasottile in parylene che è stata ampiamente...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe	VWR	BD309659
27 G needle 1/2''	VWR	BD305109
30 G needle 1/2''	VWR	BD305106
32 G Blunt needle - Small hub RN	Hamilton	7803-04
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5	Ethicon	1984G
6'' sterile cotton tips	VWR	10805-154
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution	Alcon	8007-1
BSS irrigating solution 15 mL	Accutome	Ax17362
Buprenorphine ER	ZooPharm	N/A
Castroviejo Caliper	Storz	E2405
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm	Storz	E1796
Clayman-Vannas scissors straight	Storz	E3383S
Cover glass, square	WVR	48366-227
EPS Polystyrene block	Silverlake LLC	CFB8x12x2
Gonak 15 mL	Accutome	Ax10968	Eye lubricant
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic	Storz	E6772
Hamilton syringe 700 series 100 µL	Hamilton	7638-01
HEYEX Software	Heidelberg	N/A	an image management software
Kelman-McPherson tying forceps angled	Storz	E1815 AKUS
Ketamine (100 mg/mL)	MWI	501072
Needle holder 9mm curved fine locking	Storz	3-302
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g	Accutome	Ax0720
Ophthalmic surgical microscope	Zeiss	SN: 233922
Phenylephrine 2.5% 15 mL	Accutome	Ax0310
Spectralis SD-OCT	Heidelberg	SPEC-CAM-011210s3600
Sterile Drape	VWR	100229-300
Sterile surgical gloves	VWR	89233-804
T-Pump heating system	Gaymar	TP650
Tropicamide 1% 15 mL	Accutome	Ax0330
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin	Mini Pumps LLC, CA	specifically designed for this study	used as subretinal implants
Xylazine (100 mg/mL)	MWI	510650