שיטת תרבית תלת ממדית של ספרואידים של קווי תאים עובריים ודגי זברה בכבד

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים של שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים).

Abstract

קווי תאי דגים מבטיחים מודלים במבחנה להערכת רעילות אקולוגית; עם זאת, למערכות תרבית חד-שכבתיות קונבנציונליות (תרבית דו-ממדית) יש מגבלות ידועות (למשל, אריכות ימים בתרבית ותחזוקה של חלק מהתפקודים התאיים in vivo ). לפיכך, הוצעו תרביות תלת-ממדיות, כגון ספרואידים, שכן מודלים אלה יכולים לשחזר מבנים דמויי רקמות, וללכוד טוב יותר את תנאי in vivo . מאמר זה מתאר פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים עם שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים). הפרוטוקול מורכב מציפוי התאים בצלחת בעלת תחתית עגולה, נמוכה במיוחד, בעלת 96 בארות. לאחר 5 ימים תחת רעידות מסלוליות (70 סל"ד), נוצר ספרואיד יחיד לכל באר. הספרואידים שנוצרו מציגים גודל וצורה יציבים, ושיטה זו מונעת היווצרות של ספרואידים מרובים בבאר; לכן, אין צורך לבחור ידנית ספרואידים בגדלים דומים. הקלות, המהירות ויכולת השחזור של שיטה ספרואידית זו הופכים אותה לשימושית עבור בדיקות מבחנה בעלות תפוקה גבוהה.

Introduction

ספרואידים הם כדורים קטנים של תאים הנוצרים כאשר תאים מתורבתים במגע קרוב בין תאים בתרבית תלת-ממדית. היכולת של ספרואידים לחקות את סביבת הרקמה in vivo כבר נחקרה במגוון קווי תאים ותאים ראשוניים ^1,2. עם זאת, למרות שספרואידים מפותחים היטב עבור מחקרי רעילות יונקים, הפיתוח של ספרואידים למחקרי רעילות עם בעלי חוליות שאינם יונקים (למשל, דגים) עדיין בעיצומו³. עבור קווי תאי דגים, ספרואידים פותחו במגוון שיטות שונות, כגון טלטול אורביטלי (OS) באמצעות סוגים שונים של לוחות באר 3,4,5,6,7^, ושיטת הריחוף המגנטי באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים ⁸. עם זאת, חלק משיטות התרבית הללו עבור ספרואידים עשויים להיות בעלי חסרונות רבים יותר מאחרים.

לדוגמה, שיטות גירטוריות במיקרו-צלחות גדולות (צלחות של 24 בארות) עשויות ליצור מספר גבוה של ספרואידים השונים זה מזה בגודל ובצורה; ואכן, הודגמה היווצרות מבנה רב-ספרואידי⁷. זה דורש מאמצים אינטנסיביים לבחור ספרואידים עם גודל וצורה דומים לניסוי. שיטת תרבית תלת ממדית של טיפה תלויה משמשת בדרך כלל ליצירת ספרואידים של קווי תאים של יונקים 1,2,9,10,11, לפיה ניתן ליצור ספרואידים בודדים בכל טיפה^, תוך הימנעות מהבעיות שתוארו לעיל. עם זאת, למרות ששיטת נפילה תלויה שונה (טיפה תלויה + טלטול מסלולי) מסוגלת לייצר ספרואידים ZFL בשיטה זולה, יש לה חסרונות¹². הצברים התאיים שנוצרו אינם יכולים להישמר לפרקי זמן ארוכים בטיפות; לכן, הם צריכים להיות מועברים צלחות היטב. תהליך זה דורש טיפול אינטנסיבי ופרקי זמן ארוכים של עבודה במכסה מנוע זרימה למינרית, שכן הוא מבוצע באמצעות מיקרופיפטה¹². בנוסף, שיטה זו דורשת 10 ימים כדי ליצור באופן מלא את הספרואידים ZFL (5 ימים טיפה תלויה + 5 ימים במערכת ההפעלה)¹². חסרונות אלה יכולים להגביל את היישום של כדורי דגים תלת-ממדיים לבדיקת רעילות, במיוחד בהתחשב ביישומים פוטנציאליים לתעדוף כימי וקיימות המוצר.

לפיכך, מאמר זה מתאר פרוטוקול תרבית תלת-ממדי המסוגל ליצור ספרואידים בודדים של קווי תאים ZFL (D. rerio normal hepatocyte) ו-ZEM2S (D. rerio blastula phase fetryo) בהתבסס על שימוש משולב של לוחות חיבור 96 באר ואולטרה-נמוכים (לוחות ULA) ושייקר אורביטלי (קוטר סיבוב של 22 מ"מ). השיטה המיושמת היא פשוטה וניתנת לשחזור, ויכולה ליצור מספר גבוה של ספרואידים בגודל וצורה דומים בתקופה קצרה (5 ימים). היתרונות של שיטה זו יכולים לתמוך ביישום מודלים תלת ממדיים של דגים למחקרי רעילות ימית הן בתעשייה והן באקדמיה, כמו גם בהתקדמות יישום שיטות חלופיות לבדיקת רעילות אקולוגית.

Protocol

שלבי המפתח ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של קווי תאים ZFL ו-ZEM2S בלוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות מוצגים באיור 1.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 עבור פתרונות ומדיית תרבות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. תרביות מדיום וחד-שכבתיות של תרביות תאים

1. לגדל את שני קווי התאים (ZFL, ZEM2S) כחד-שכבות באינקובטור ב-28°C ללא_CO2, ולגדל אותם בתת-גידול ביחס של 1:3 כאשר הם מגיעים למפגש ~80%.
   1. התחל עם בקבוק T75 של תאי דג זברה במפגש ~80%, בתרבית כמתואר לעיל.
   2. הסר את המדיום המלא ושטוף את התאים על ידי הוספת 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) (0.01 M) לבקבוק תרבית בעזרת פיפטה.
   3. בעזרת פיפטה, להוסיף 3 מ"ל של 1x טריפסין-0.5 mM EDTA (0.05% [v/v]) לצלוחיות התרבית, ולדגור ב 28 ° C במשך 3 דקות לניתוק תאים מן הצלוחית.
   4. טפחו בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן עצרו את עיכול הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום תרבית שלם לצלוחית.
   5. באמצעות פיפטה, להעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 100 × גרם במשך 5 דקות.
   6. לאחר היווצרות הכדור, בזהירות להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של המדיום המלא עבור קו התא המתאים בשימוש (ZFL או ZEM2S), ו resuspend באמצעות micropipette. קח aliquot עבור ספירת תאים.

2. ספירת תאים עם בדיקת אי הכללת צבע כחול טריפאן

1. הוסף 10 μL של תרחיף התא ו 10 μL של צבע כחול טריפאן למיקרו-צינורית כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות שלהם. מערבבים את תרחיף התא וצובעים בעזרת פיפטה.
2. לאחר מכן, העבירו 10 μL של תערובת זו (תרחיף תאים + טריפאן כחול) לתא נויבאואר וספרו את התאים בארבעת הריבועים הגדולים (רבעים: Q) הממוקמים בפינות התא, בהתחשב בתאים שאינם תופסים כחול טריפאן כבני קיימא. חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות משוואה (1):
   (1)
3. כדי לחשב את מספר התא הסופי בתרחיף התא, הכפל את מספר התא שנקבע באמצעות משוואה (1) ב- 2 (גורם הדילול עקב השימוש בכחול טריפאן).
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת ספירת תאים אוטומטית.

3. ציפוי תאים בצלחות ULA

1. לאחר חישוב מספר התא, התאם את מתלה התא ללוח 200 μL של תרחיף זה לכל באר של לוחית ULA בעלת תחתית עגולה של 96 בארות עם מספר התאים הדרוש לכל קו תא, כמפורט להלן:
   1. צלחת 7,000 תאי ZFL קיימא / באר; לכן, עבור צלחת ULA כולה, להשתמש 700,000 תאים ב 20 מ"ל של תווך שלם.
   2. צלחת 3,500 תאי ZEM2S קיימא / באר; לכן, עבור צלחת ULA כולה, להשתמש 350,000 תאים ב 20 מ"ל של מדיום שלם.
2. מכינים את תרחיף התא עם ריכוז התאים המותאם במאגר בינוני ומערבבים אותו באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, תוך הקפדה שלא ליצור קצף או בועות. באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוסיף 200 μL של תרחיף התא מותאם לכל באר של צלחת ULA.
   הערה: הצלחת חייבת להיות אטומה עם ציפוי פרפילם או נייר איטום דבק כדי למנוע אידוי בינוני של תרבית מהצלחת בעלת 96 הקידוחים.

4. היווצרות ספרואידים

1. לדגור את צלחת ULA על שייקר מסלול ב 70 סל"ד במשך 5 ימים באינקובטור 28 מעלות צלזיוס. אפשרו לכדוריות להיווצר במשך 5 ימים של רעידות מסלוליות (איור 2), ולהגיע לגודל ממוצע של ~225 מיקרומטר בקוטר (ספרואידים ZFL) וקוטר ~226 מיקרומטר (ספרואידים ZEM2S)¹².
   הערה: לאחר 5 ימי דגירה (מעגליות מרבית), הספרואידים מוכנים לשימוש.
2. כדי לשמור על הספרואידים בתרבית במשך יותר מ -5 ימים, להסיר 100 μL של המדיום בילה כל 5 ימים, ולהוסיף 100 μL של מדיום תרבית שלמה טרי באמצעות micropipette רב ערוצי.
   הערה: יש להיזהר שלא לשאוף את הספרואידים במהלך תהליך זה.

5. מדידת גודל (קוטר) וצורה (אינדקס מעגליות) של ספרואידים

1. רכוש את התמונות.
   1. תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם מערכת לכידת הדמיה, קבל תמונה בקנה מידה מוגדר.
      הערה: השתמש בשקופית כיול שלב במיקרוסקופ או בשקופית נויבאואר (שבה ידועים גדלי הרביע) כדי לקבל את קנה המידה.
   2. תחת המיקרוסקופ ובאמצעות אותה עדשה אובייקטיבית המשמשת לקבלת תמונת הסולם, קבל תמונות של הספרואידים שנוצרו במלואם (כלומר, ספרואידים בני 5 ימים).
      הערה: יש לצלם את כל התמונות באמצעות אותה מערכת לכידת הדמיה, מכיוון שרזולוציית התמונה חשובה לקביעת הגודל והצורה של הספרואידים, והיא עשויה להשתנות בין סוגי המערכות.
2. הגדר את קנה המידה.
   1. באמצעות תוכנת ImageJ, פתח את התמונה של קנה המידה המוגדר (לחץ על קובץ | פתוח).
   2. בחרו בבורר הקו הישר מסרגל הכלים וגררו קו החוצה באמצעות העכבר לאורך ההרחבה של קנה המידה שהוגדר בתמונה.
   3. הגדר את קנה המידה על-ידי בחירה באפשרות נתח | הגדר קנה מידה והמתן לפתיחת החלון הגדר קנה מידה .
   4. בחלון הגדרת קנה מידה , מלא את הריק של המרחק הידוע במרחק הידוע (μm) המתאים לקו הישר; מלא את יחידת האורך ב - um עבור μm. לחץ על אישור.
      הערה: קנה המידה בפיקסלים/מיקרומטר מוצג בתחתית החלון.
3. הגדר את פרמטרי המדידה.
   1. בתוכנת ImageJ, בחר נתח | הגדר מידות כדי לפתוח את החלון הגדרת מדידות .
   2. בחלון Set Measurements, בחרו בתיבות למדידות הרצויות (כלומר, מתארי שטח וצורה). לחץ על אישור.
4. קבל את הקוטר והמעגליות של הספרואידים.
   1. פתח את התמונה של ספרואיד (קובץ | פתוח).
   2. בחרו בכלי הבחירה החופשית בסרגל הכלים ובעזרת העכבר בחרו את הצד החיצוני של הספרואיד, כפי שמודגם באיור 3A.
      הערה: כדי להגדיל או להקטין את התצוגה של התמונה, הקש על מקש Ctrl והשתמש בעכבר כדי לגלול למטה או למעלה, או הקש על מקש Ctrl והשתמש במקשי החצים למעלה או למטה בלוח המקשים.
   3. בחר נתח | מדידה כדי לפתוח את החלון 'תוצאות ', שבו מוצגים הערכים הנמדדים.
   4. באמצעות ערך השטח , חשב את הגודל (קוטר) של הספרואידים באמצעות משוואה (2):
      (2)
   5. מדד המעגליות ניתן בחלון התוצאות כ- "Circ.", ומחושב אוטומטית על ידי התוכנה באמצעות משוואה (3):
      (3)
      הערה: אינדקס המעגליות של 1.0 מייצג צורה כדורית מושלמת, בעוד שערך קרוב ל- 0.0 מציין צורה מוארכת¹³.

תוצאות

ספרואידים בודדים לכל באר עם גודל וצורה יציבים נוצרים בשיטה זו. איור 2 מדגים את תהליך ההיווצרות של ספרואידים בודדים של תאי ZFL ו-ZEM2S בבאר של צלחת ULA תחת טלטול אורביטלי (70 סל"ד). לקווי התאים ZFL ו-ZEM2S יש התנהגויות שונות בתרבית תלת-ממדית. קו התאים ZEM2S מציג תכונות שמעניקות את היכולת ליצ...

Discussion

זוהי שיטה פשוטה, קלה ומהירה ליצירת ספרואידים של קווי תאי כבד ועובר של דגי זברה. שיטה זו פותחה על ידי קבוצה זו בהתבסס על שינויים של שיטות ספרואידים תלת ממדיות קיימות כדי להתגבר על בעיות שדווחו במחקרים מדעיים הקשורים להיווצרות ספרואידים, כמו גם אי ודאויות בדיוק הנתונים מבדיקות ספרואידים תלת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile	Corning	7007
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder	Gibco	21700026
HEPES (1M)	Gibco	15630080
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software	National Institutes of Health, USA		Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powder	Gibco	41300021
Orbital shaker	Warmnest	KLD-350-BI	22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium	Invitrogen	14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-014
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	Gibco	12657-029
Sodium bicarbonate, powder,  bioreagent for molecular biology	Sigma-Aldrich	S5761
Trypan blue stain (0,4%)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
ZEM2S cell line	ATCC	CRL-2147	This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line	BCRJ	256