Un metodo di coltura 3D di sferoidi di linee cellulari embrionali e epatiche di zebrafish

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi di due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale).

Abstract

Le linee cellulari di pesce sono promettenti modelli in vitro per la valutazione dell'ecotossicità; tuttavia, i sistemi di coltura monostrato convenzionali (coltura 2D) hanno limitazioni ben note (ad esempio, la longevità della coltura e il mantenimento di alcune funzioni cellulari in vivo ). Pertanto, sono state proposte colture 3D, come gli sferoidi, poiché questi modelli possono riprodurre strutture simili a tessuti, ricatturando meglio le condizioni in vivo . Questo articolo descrive un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi con due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale). Il protocollo consiste nel placcare le celle in una piastra a 96 pozzetti con attacco a fondo tondo, ultra-basso. Dopo 5 giorni sotto scuotimento orbitale (70 giri / min), si forma un singolo sferoide per pozzetto. Gli sferoidi formati presentano dimensioni e forma stabili, e questo metodo evita la formazione di più sferoidi in un pozzo; Pertanto, non è necessario selezionare a mano sferoidi di dimensioni simili. La facilità, la velocità e la riproducibilità di questo metodo sferoidale lo rendono utile per test in vitro ad alta produttività.

Introduzione

Gli sferoidi sono piccole sfere di cellule formate quando le cellule vengono coltivate in stretto contatto cellula-cellula in coltura 3D. La capacità degli sferoidi di imitare l'ambiente tissutale in vivo è già stata studiata in una varietà di linee cellulari e cellule primarie ^1,2. Tuttavia, sebbene gli sferoidi siano ben sviluppati per gli studi di tossicità sui mammiferi, lo sviluppo di sferoidi per studi di tossicità con vertebrati non mammiferi (ad esempio pesci) è ancora in corso³. Per le linee cellulari di pesce, gli sferoidi sono stati sviluppati con una varietà di metodi diversi, come lo scuotimento orbitale (OS) utilizzando diversi tipi di piastre di pozzo 3,4,5,6,7 e il metodo di levitazione magnetica che utilizza nanoparticelle magnetiche ⁸. Tuttavia, alcuni di questi metodi di coltura per gli sferoidi possono avere più svantaggi di altri.

Ad esempio, i metodi giratori in micropiastre di grandi dimensioni (piastre a 24 pozzetti) possono generare un numero elevato di sferoidi diversi per dimensioni e forma; In effetti, è stata dimostrata la formazione di strutture multi-sferoidi⁷. Ciò richiede sforzi intensi per selezionare a mano sferoidi con dimensioni e forma simili per un esperimento. Il metodo di coltura 3D a goccia sospesa è comunemente usato per generare sferoidi di linee cellulari di mammifero 1,2,9,10,11, per cui possono essere generati singoli sferoidi per goccia^, evitando i problemi sopra descritti. Tuttavia, sebbene un metodo di goccia sospesa modificato (goccia sospesa + scuotimento orbitale) sia in grado di generare sferoidi ZFL utilizzando un metodo economico, ha i suoi svantaggi¹². Gli aggregati cellulari formati non possono essere mantenuti per lunghi periodi nelle gocce; Pertanto, devono essere trasferiti in piastre di pozzo. Questo processo richiede una manipolazione intensa e lunghi periodi di lavoro in una cappa a flusso laminare, poiché viene eseguito a goccia utilizzando una micropipetta¹². Inoltre, questo metodo richiede 10 giorni per formare completamente gli sferoidi ZFL (5 giorni in goccia sospesa + 5 giorni in OS)¹². Questi svantaggi possono limitare l'applicazione di sferoidi di pesce 3D per i test di tossicità, soprattutto considerando le potenziali applicazioni per la prioritizzazione chimica e la sostenibilità del prodotto.

Pertanto, questo articolo descrive un protocollo di coltura 3D in grado di generare singoli sferoidi di ZFL (Epatocita normale D. rerio) e ZEM2S (embrione fase D. rerio blastula ) basato sull'uso combinato di piastre di attacco ultra-basse a 96 pozzetti (piastre ULA) e uno shaker orbitale (diametro rotazionale 22 mm). Il metodo applicato è semplice e riproducibile e può generare un numero elevato di sferoidi di dimensioni e forma simili in un breve periodo (5 giorni). I vantaggi di questo metodo possono supportare l'applicazione di modelli 3D di pesci per studi di tossicità acquatica sia nell'industria che nel mondo accademico, nonché il progresso dell'implementazione di metodi alternativi per i test di ecotossicità.

Protocollo

I passaggi chiave per generare sferoidi 3D di linee cellulari ZFL e ZEM2S in una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo sono presentati nella Figura 1.

NOTA: vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo protocollo e la Tabella 1 per le soluzioni e i terreni di coltura utilizzati in questo protocollo.

1. Terreno di coltura cellulare e colture monostrato

1. Coltiva entrambe le linee cellulari (ZFL, ZEM2S) come monostrati in un incubatore a 28 ° C senza CO₂ e sottocoltivali con un rapporto di subcoltivazione di 1: 3 quando raggiungono ~ 80% di confluenza.
   1. Inizia con un pallone T75 di cellule di zebrafish a ~ 80% di confluenza, coltivato come descritto sopra.
   2. Prelevare il mezzo completo e lavare le cellule aggiungendo 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (0,01 M) al matraccio di coltura con l'aiuto di una pipetta.
   3. Con l'aiuto di una pipetta, aggiungere 3 mL di 1x tripsina-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) ai palloni di coltura e incubare a 28 °C per 3 minuti per il distacco delle cellule dal pallone.
   4. Picchiettare delicatamente il matraccio per rilasciare le cellule, quindi interrompere la digestione della tripsina aggiungendo 3 ml di terreno di coltura completo al pallone.
   5. Utilizzando una pipetta, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 100 × g per 5 minuti.
   6. Dopo la formazione del pellet, rimuovere con attenzione il surnatante, aggiungere 1 mL del mezzo completo per la rispettiva linea cellulare in uso (ZFL o ZEM2S) e risospendere utilizzando una micropipetta. Prendi un'aliquota per il conteggio delle cellule.

2. Conteggio delle cellule con test di esclusione del colorante blu tripano

1. Aggiungere 10 μL della sospensione cellulare e 10 μL di colorante blu tripano a un microtubo per contare le cellule e valutarne la vitalità. Mescolare la sospensione cellulare e colorare usando una pipetta.
2. Quindi, trasferire 10 μL di questa miscela (sospensione cellulare + blu tripano) in una camera di Neubauer e contare le cellule nei quattro grandi quadrati (quadranti: Q) posti agli angoli della camera, considerando vitali le cellule che non assorbono il blu tripano. Calcola il numero di celle vitali usando l'equazione (1):
   (1)
3. Per calcolare il numero finale di celle nella sospensione cellulare, moltiplicare il numero di celle determinato utilizzando l'equazione (1) per 2 (il fattore di diluizione dovuto all'uso del blu di tripano).
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un sistema automatico di conteggio delle celle.

3. Placcatura cellulare in piastre ULA

1. Dopo aver calcolato il numero di celle, regolare la sospensione della cella sulla piastra 200 μL di questa sospensione per pozzetto di una piastra ULA a fondo rotondo a 96 pozzetti con il numero di celle richiesto per ciascuna linea cellulare, come indicato di seguito:
   1. Piastra 7.000 celle ZFL vitali / pozzetto; quindi, per l'intera piastra ULA, utilizzare 700.000 celle in 20 ml di mezzo completo.
   2. Piastra 3.500 cellule/pozzetto ZEM2S vitali; quindi, per l'intera piastra ULA, utilizzare 350.000 celle in 20 ml di mezzo completo.
2. Preparare la sospensione cellulare con la concentrazione regolata di cellule in un serbatoio medio e mescolarla utilizzando una micropipetta multicanale, facendo attenzione a non formare schiuma o bolle. Utilizzando la micropipetta multicanale, aggiungere 200 μL della sospensione cellulare regolata a ciascun pozzetto della piastra ULA.
   NOTA: La piastra deve essere sigillata con parafilm o pellicola sigillante adesiva per evitare l'evaporazione del terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti.

4. Formazione sferoidale

1. Incubare la piastra ULA su uno shaker orbitale a 70 rpm per 5 giorni in un incubatore a 28 °C. Lasciare che gli sferoidi si formino in 5 giorni di scuotimento orbitale (Figura 2), raggiungendo una dimensione media di ~225 μm di diametro (sferoidi ZFL) e ~226 μm di diametro (sferoidi ZEM2S)¹².
   NOTA: Dopo 5 giorni di incubazione (circolarità massima), gli sferoidi sono pronti per essere utilizzati.
2. Per mantenere gli sferoidi in coltura per più di 5 giorni, rimuovere 100 μL del mezzo esaurito ogni 5 giorni e aggiungere 100 μL di terreno di coltura completo fresco utilizzando una micropipetta multicanale.
   NOTA: Fare attenzione a non aspirare gli sferoidi durante questo processo.

5. Misura delle dimensioni (diametro) e della forma (indice di circolarità) degli sferoidi

1. Acquisisci le immagini.
   1. Sotto un microscopio a luce invertita con un sistema di acquisizione delle immagini, ottenere un'immagine di una scala definita.
      NOTA: Utilizzare un vetrino di calibrazione dello stadio del microscopio o un vetrino Neubauer (in cui sono note le dimensioni del quadrante) per ottenere la scala.
   2. Al microscopio e utilizzando la stessa lente obiettiva utilizzata per ottenere l'immagine della scala, ottenere immagini degli sferoidi completamente formati (cioè sferoidi di 5 giorni).
      NOTA: Tutte le immagini devono essere scattate utilizzando lo stesso sistema di acquisizione delle immagini, poiché la risoluzione dell'immagine è importante per determinare le dimensioni e la forma degli sferoidi e può differire tra i tipi di sistemi.
2. Imposta la scala.
   1. Utilizzando il software ImageJ, aprire l'immagine della scala definita (fare clic su File | apri).
   2. Selezionare il selettore a linea retta dalla barra degli strumenti e, utilizzando il mouse, trascinare una linea attraverso l'estensione della scala definita nell'immagine.
   3. Impostare la scala selezionando Analizza | Impostate la scala e attendete l'apertura della finestra Imposta scala .
   4. Nella finestra Imposta scala, riempire lo spazio vuoto di Distanza nota con la distanza nota (μm) corrispondente alla linea retta; riempire l'unità di lunghezza con um per μm. Fare clic su OK.
      NOTA: la scala in pixel/μm viene visualizzata nella parte inferiore della finestra.
3. Impostare i parametri di misurazione.
   1. Nel software ImageJ, selezionare Analizza | Impostare le misure per aprire la finestra Imposta misure .
   2. Nella finestra Imposta misure, selezionare le caselle per le misure desiderate (ad esempio, Descrittori di area e forma). Fare clic su OK.
4. Ottenere il diametro e la circolarità degli sferoidi.
   1. Aprire l'immagine di uno sferoide (File | Aperto).
   2. Selezionare lo strumento di selezione a mano libera nella barra degli strumenti e, utilizzando il mouse, selezionare il lato esterno dello sferoide, come illustrato nella Figura 3A.
      NOTA: per ingrandire o ridurre l'immagine, premere CTRL e utilizzare il mouse per scorrere verso il basso o verso l'alto oppure premere il tasto CTRL e utilizzare i tasti freccia su o giù sulla tastiera.
   3. Seleziona Analizza | Misura per aprire la finestra Risultati , in cui vengono visualizzati i valori misurati.
   4. Utilizzando il valore Area , calcolare la dimensione (diametro) degli sferoidi usando l'equazione (2):
      (2)
   5. L'indice di circolarità è dato nella finestra Risultati come "Circ.", e viene calcolato automaticamente dal software utilizzando l'equazione (3):
      (3)
      NOTA: L'indice di circolarità di 1,0 rappresenta una forma sferoidale perfetta, mentre un valore vicino a 0,0 indica una forma allungata¹³.

Risultati

I singoli sferoidi per pozzetto con dimensioni e forma stabili sono formati con questo metodo. La Figura 2 illustra il processo di formazione di singoli sferoidi di cellule ZFL e ZEM2S in un pozzetto di una piastra ULA sotto scuotimento orbitale (70 rpm). Le linee cellulari ZFL e ZEM2S hanno comportamenti diversi nella coltura 3D. La linea cellulare ZEM2S presenta caratteristiche che conferiscono la capacità di formare prontamente una forma sferoidale fin dal primo giorno dello scuotimento ...

Discussione

Questo è un metodo semplice, facile e veloce per generare sferoidi di fegato zebrafish e linee cellulari embrionali. Questo metodo è stato sviluppato da questo gruppo sulla base di modifiche dei metodi sferoidi 3D esistenti per superare i problemi riportati negli studi scientifici relativi alla formazione di sferoidi, nonché le incertezze nell'accuratezza dei dati dai saggi sferoidi 3D. Ad esempio, i problemi segnalati risiedono nelle difficoltà di manipolazione, nella natura dispendiosa in termini di tempo della gen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile	Corning	7007
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder	Gibco	21700026
HEPES (1M)	Gibco	15630080
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software	National Institutes of Health, USA		Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powder	Gibco	41300021
Orbital shaker	Warmnest	KLD-350-BI	22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium	Invitrogen	14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-014
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	Gibco	12657-029
Sodium bicarbonate, powder,  bioreagent for molecular biology	Sigma-Aldrich	S5761
Trypan blue stain (0,4%)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
ZEM2S cell line	ATCC	CRL-2147	This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line	BCRJ	256