Une méthode de culture 3D de sphéroïdes de lignées cellulaires de poissons-zèbres embryonnaires et hépatiques

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de culture 3D efficace, facile et rapide pour la formation de sphéroïdes de deux lignées cellulaires de poisson zèbre (Danio rerio): ZEM2S (embryon) et ZFL (hépatocytes normaux).

Résumé

Les lignées cellulaires de poissons sont des modèles in vitro prometteurs pour l’évaluation de l’écotoxicité; cependant, les systèmes de culture monocouche conventionnels (culture 2D) ont des limites bien connues (p. ex. longévité de la culture et maintien de certaines fonctions cellulaires in vivo ). Ainsi, des cultures 3D, telles que des sphéroïdes, ont été proposées, car ces modèles peuvent reproduire des structures tissulaires, mieux recapturer les conditions in vivo . Cet article décrit un protocole de culture 3D efficace, facile et rapide pour la formation de sphéroïdes avec deux lignées cellulaires de poisson zèbre (Danio rerio) : ZEM2S (embryon) et ZFL (hépatocytes normaux). Le protocole consiste à plaquer les cellules dans une plaque à fond rond, à fixation ultra-basse, à 96 puits. Après 5 jours sous agitation orbitale (70 rpm), un seul sphéroïde par puits est formé. Les sphéroïdes formés présentent une taille et une forme stables, et cette méthode évite la formation de plusieurs sphéroïdes dans un puits; Ainsi, il n’est pas nécessaire de choisir à la main des sphéroïdes de tailles similaires. La facilité, la rapidité et la reproductibilité de cette méthode sphéroïde la rendent utile pour les tests in vitro à haut débit.

Introduction

Les sphéroïdes sont de petites sphères de cellules formées lorsque les cellules sont cultivées en contact étroit de cellule à cellule en culture 3D. La capacité des sphéroïdes à imiter l’environnement tissulaire in vivo a déjà été étudiée dans une variété de lignées cellulaires et de cellules primaires ^1,2. Cependant, bien que les sphéroïdes soient bien développés pour les études de toxicité chez les mammifères, le développement de sphéroïdes pour les études de toxicité avec des vertébrés non mammifères (p. ex. poissons) est toujours en cours³. Pour les lignées cellulaires de poissons, les sphéroïdes ont été développés par une variété de méthodes différentes, telles que l’agitation orbitale (OS) en utilisant différents types de plaques de puits 3,4,5,6,7^, et la méthode de lévitation magnétique utilisant des nanoparticules magnétiques⁸. Cependant, certaines de ces méthodes de culture pour les sphéroïdes peuvent avoir plus d’inconvénients que d’autres.

Par exemple, les méthodes giratoires dans de grandes microplaques (plaques à 24 puits) peuvent générer un nombre élevé de sphéroïdes de taille et de forme différentes; En effet, la formation de structures multi-sphéroïdes a été démontrée⁷. Cela nécessite des efforts intenses pour sélectionner des sphéroïdes de taille et de forme similaires pour une expérience. La méthode de culture 3D à gouttes suspendues est couramment utilisée pour générer des sphéroïdes de lignées cellulaires de mammifères 1,2,9,10,11^, ce qui permet de générer des sphéroïdes uniques par goutte, évitant ainsi les problèmes décrits ci-dessus. Cependant, bien qu’une méthode de goutte suspendue modifiée (goutte suspendue + secousse orbitale) soit capable de générer des sphéroïdes ZFL en utilisant une méthode peu coûteuse, elle présente ses inconvénients¹². Les agrégats cellulaires formés ne peuvent pas être maintenus pendant de longues périodes dans les gouttes; Ainsi, ils doivent être transférés sur des plaques de puits. Ce processus nécessite une manipulation intense et de longues périodes de travail dans une hotte à flux laminaire, car il est effectué goutte à goutte à l’aide d’une micropipette¹². De plus, cette méthode nécessite 10 jours pour former complètement les sphéroïdes ZFL (5 jours en goutte suspendue + 5 jours en SG)¹². Ces inconvénients peuvent limiter l’application de sphéroïdes de poissons 3D pour les tests de toxicité, en particulier compte tenu des applications potentielles pour la priorisation des produits chimiques et la durabilité des produits.

Ainsi, cet article décrit un protocole de culture 3D capable de générer des sphéroïdes uniques de lignées cellulaires ZFL (hépatocytes normaux de D. rerio) et ZEM2S (embryon en phase blastula de D. rerio) basés sur l’utilisation combinée de plaques de fixation ultra-basses à 96 puits (plaques ULA) et d’un agitateur orbital (diamètre de rotation de 22 mm). La méthode appliquée est simple et reproductible, et peut générer un grand nombre de sphéroïdes de taille et de forme similaires en peu de temps (5 jours). Les avantages de cette méthode peuvent soutenir l’application de modèles 3D de poissons pour les études de toxicité aquatique dans l’industrie et le milieu universitaire, ainsi que les progrès de la mise en œuvre de méthodes alternatives pour les essais d’écotoxicité.

Protocole

Les étapes clés pour générer des sphéroïdes 3D de lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans une plaque à fond rond de 96 puits sont présentées à la figure 1.

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole et le tableau 1 pour les solutions et les milieux de culture utilisés dans ce protocole.

1. Milieu de culture cellulaire et cultures monocouches

1. Cultiver les deux lignées cellulaires (ZFL, ZEM2S) en monocouches dans un incubateur à 28 °C sans CO₂, et les sous-cultiver à un rapport de sous-culture de 1:3 lorsqu’elles atteignent ~80% de confluence.
   1. Commencez avec une fiole T75 de cellules de poisson zèbre à ~80% de confluence, cultivées comme décrit ci-dessus.
   2. Retirer le milieu complet et laver les cellules en ajoutant 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (0,01 M) dans la fiole de culture à l’aide d’une pipette.
   3. À l’aide d’une pipette, ajouter 3 mL de 1x trypsine-0,5 mM EDTA (0,05 % [v/v]) dans les fioles de culture et incuber à 28 °C pendant 3 min pour détacher les cellules de la fiole.
   4. Tapoter doucement la fiole pour libérer les cellules, puis arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de culture complet dans la fiole.
   5. À l’aide d’une pipette, transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 mL et centrifuger à 100 × g pendant 5 min.
   6. Après la formation de la pastille, retirez soigneusement le surnageant, ajoutez 1 mL du milieu complet pour la lignée cellulaire respective utilisée (ZFL ou ZEM2S) et remettez en suspension à l’aide d’une micropipette. Prenez une partie aliquote pour le comptage cellulaire.

2. Comptage des cellules avec test d’exclusion du colorant bleu trypan

1. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire et 10 μL de colorant bleu de trypan à un microtube pour compter les cellules et évaluer leur viabilité. Mélanger la suspension cellulaire et le colorant à l’aide d’une pipette.
2. Ensuite, transférez 10 μL de ce mélange (suspension cellulaire + bleu de trypan) dans une chambre de Neubauer et comptez les cellules dans les quatre grands carrés (quadrants: Q) placés aux coins de la chambre, en considérant les cellules qui n’absorbent pas le bleu de trypan comme viables. Calculer le nombre de cellules viables à l’aide de l’équation (1) :
   (1)
3. Pour calculer le nombre final de cellules dans la suspension cellulaire, multipliez le nombre de cellules déterminé à l’aide de l’équation (1) par 2 (le facteur de dilution dû à l’utilisation du bleu de trypan).
   REMARQUE: Alternativement, un système automatisé de comptage de cellules peut être utilisé.

3. Placage cellulaire dans les plaques ULA

1. Après avoir calculé le nombre de cellules, ajuster la suspension de la cellule à la plaque de 200 μL de cette suspension par puits d’une plaque ULA à fond rond de 96 puits avec le nombre de cellules requis pour chaque lignée cellulaire, comme indiqué ci-dessous:
   1. Plaque 7 000 cellules ZFL viables/puits; ainsi, pour l’ensemble de la plaque ULA, utiliser 700 000 cellules dans 20 mL de milieu complet.
   2. Plaque 3 500 cellules ZEM2S viables/puits; ainsi, pour l’ensemble de la plaque ULA, utiliser 350 000 cellules dans 20 mL de milieu complet.
2. Préparez la suspension cellulaire avec la concentration ajustée de cellules dans un réservoir de milieu et mélangez-la à l’aide d’une micropipette multicanal, en prenant soin de ne pas former de mousse ou de bulles. À l’aide de la micropipette multicanaux, ajouter 200 μL de la suspension cellulaire ajustée à chaque puits de la plaque ULA.
   REMARQUE : La plaque doit être scellée avec un parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour éviter l’évaporation du milieu de culture de la plaque de 96 puits.

4. Formation sphéroïde

1. Incuber la plaque ULA sur un agitateur orbital à 70 tr/min pendant 5 jours dans un incubateur à 28 °C. Laisser les sphéroïdes se former au cours de 5 jours d’agitation orbitale (Figure 2), atteignant une taille moyenne de ~225 μm de diamètre (sphéroïdes ZFL) et ~226 μm de diamètre (sphéroïdes ZEM2S)¹².
   NOTE: Après 5 jours d’incubation (circularité maximale), les sphéroïdes sont prêts à être utilisés.
2. Pour maintenir les sphéroïdes en culture pendant plus de 5 jours, retirer 100 μL du milieu épuisé tous les 5 jours et ajouter 100 μL de milieu de culture complet frais à l’aide d’une micropipette multicanal.
   REMARQUE: Veillez à ne pas aspirer les sphéroïdes pendant ce processus.

5. Mesure de la taille (diamètre) et de la forme (indice de circularité) des sphéroïdes

1. Acquérir les images.
   1. Sous un microscope à lumière inversée avec un système de capture d’imagerie, obtenir une image d’une échelle définie.
      REMARQUE : Utilisez une lame d’étalonnage de l’étage du microscope ou une lame de Neubauer (dans laquelle les tailles des quadrants sont connues) pour obtenir l’échelle.
   2. Au microscope et en utilisant la même lentille d’objectif que celle utilisée pour obtenir l’image de l’échelle, obtenir des images des sphéroïdes entièrement formés (c.-à-d. des sphéroïdes âgés de 5 jours).
      REMARQUE: Toutes les images doivent être prises à l’aide du même système de capture d’imagerie, car la résolution de l’image est importante pour déterminer la taille et la forme des sphéroïdes, et elle peut différer selon les types de systèmes.
2. Définissez l’échelle.
   1. À l’aide du logiciel ImageJ, ouvrez l’image de l’échelle définie (cliquez sur Fichier | ouvrir).
   2. Sélectionnez le sélecteur de ligne droite dans la barre d’outils et, à l’aide de la souris, faites glisser une ligne sur l’extension de l’échelle définie dans l’image.
   3. Définissez l’échelle en sélectionnant Analyser | Définissez l’échelle et attendez que la fenêtre Définir l’échelle s’ouvre.
   4. Dans la fenêtre Set Scale (Définir l’échelle), remplissez le blanc de Distance connue par la distance connue (μm) correspondant à la ligne droite ; Remplissez l’unité de longueur avec um pour μm. Cliquez sur OK.
      REMARQUE : L’échelle en pixels/μm est affichée en bas de la fenêtre.
3. Réglez les paramètres de mesure.
   1. Dans le logiciel ImageJ, sélectionnez Analyser | Définir les mesures pour ouvrir la fenêtre Définir les mesures .
   2. Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez les cases correspondant aux mesures souhaitées (c’est-à-dire les descripteurs de zone et de forme). Cliquez sur OK.
4. Obtenir le diamètre et la circularité des sphéroïdes.
   1. Ouvrez l’image d’un sphéroïde (Fichier | Ouvert).
   2. Sélectionnez l’outil de sélection à main levée dans la barre d’outils et, à l’aide de la souris, sélectionnez le côté extérieur du sphéroïde, comme illustré à la figure 3A.
      REMARQUE: Pour effectuer un zoom avant ou arrière sur l’image, appuyez sur la touche Ctrl et utilisez la souris pour faire défiler vers le bas ou vers le haut, ou appuyez sur la touche Ctrl et utilisez les touches fléchées haut ou bas du clavier.
   3. Sélectionnez Analyser | Mesure pour ouvrir la fenêtre Résultats dans laquelle les valeurs mesurées sont affichées.
   4. À l’aide de la valeur Surface , calculez la taille (diamètre) des sphéroïdes à l’aide de l’équation (2) :
      (2)
   5. L’indice de circularité est indiqué dans la fenêtre Résultats sous la forme « Circ. », et est calculé automatiquement par le logiciel à l’aide de l’équation (3):
      (3)
      REMARQUE: L’indice de circularité de 1,0 représente une forme sphéroïdale parfaite, tandis qu’une valeur proche de 0,0 indique une forme allongée¹³.

Résultats

Des sphéroïdes simples par puits avec une taille et une forme stables sont formés par cette méthode. La figure 2 illustre le processus de formation de sphéroïdes simples de cellules ZFL et ZEM2S dans un puits d’une plaque ULA sous agitation orbitale (70 tr/min). Les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S ont des comportements différents en culture 3D. La lignée cellulaire ZEM2S présente des caractéristiques qui confèrent la capacité de former facilement une forme sphéroïdale dès ...

Discussion

Il s’agit d’une méthode simple, facile et rapide pour générer des sphéroïdes de lignées cellulaires de foie et d’embryons de poisson zèbre. Cette méthode a été développée par ce groupe sur la base des modifications apportées aux méthodes sphéroïdes 3D existantes pour surmonter les problèmes signalés dans les études scientifiques liées à la formation de sphéroïdes, ainsi que les incertitudes dans la précision des données des tests 3D sphéroïdes. Par exemple, les problèmes signalés résid...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile	Corning	7007
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder	Gibco	21700026
HEPES (1M)	Gibco	15630080
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software	National Institutes of Health, USA		Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powder	Gibco	41300021
Orbital shaker	Warmnest	KLD-350-BI	22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium	Invitrogen	14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-014
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	Gibco	12657-029
Sodium bicarbonate, powder,  bioreagent for molecular biology	Sigma-Aldrich	S5761
Trypan blue stain (0,4%)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
ZEM2S cell line	ATCC	CRL-2147	This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line	BCRJ	256