פרוטוקול פשוט למיפוי תכונות ארכיטקטורת מערכת שורש הצמח

Summary

אנו משתמשים בכלי מעבדה פשוטים כדי לבחון את ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של Arabidopsis ו- Medicago. העציצים גדלים באופן הידרופוני על גבי רשת ומפוזרים באמצעות מברשת אמנותית כדי לחשוף את ה-RSA. התמונות מצולמות באמצעות סריקה או מצלמה ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן מנותחות באמצעות ImageJ כדי למפות תכונות.

Abstract

ידע מקיף בפיתוח ארכיטקטורת מערכת שורשי צמחים (RSA) הוא קריטי לשיפור יעילות השימוש בחומרים מזינים ולהגברת סבילות זני היבול לאתגרים סביבתיים. פרוטוקול ניסויי מוצג להקמת המערכת ההידרופונית, גידול צמחים, התפשטות RSA והדמיה. הגישה השתמשה במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה המכילה רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. הגדרות ניסוי מודגמות על ידי הערכת RSA של הצמחים תחת אספקת חומרים מזינים משתנים (פוספט [Pi]). המערכת הוקמה כדי לבחון את RSA של Arabidopsis, אבל זה בקלות להסתגל לחקור צמחים אחרים כמו Medicago sativa (אספסת). צמחי Arabidopsis thaliana (Col-0) משמשים במחקר זה כדוגמה להבנת הצמח RSA. זרעים מעוקרים על פני השטח על ידי טיפול באתנול ואקונומיקה מסחרית מדוללת, ונשמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לריבוד. הזרעים מונבטים וגדלים על מדיום נוזלי של חצי MS על רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. העציצים גדלים בתנאי גידול סטנדרטיים למספר הימים הרצוי, נקטפים בעדינות מהרשת ושקועים בצלחות אגר המכילות מים. כל מערכת שורשים של הצמחים נפרסת בעדינות על צלחת מלאה במים בעזרת מברשת אמנות עגולה. לוחות פטרי אלה מצולמים או נסרקים ברזולוציה גבוהה כדי לתעד את תכונות ה-RSA. תכונות השורש, כגון שורש ראשוני, שורשים רוחביים ואזור הסתעפות, נמדדות באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי. מחקר זה מספק טכניקות למדידת מאפייני שורשי צמחים בסביבות סביבתיות מבוקרות. אנו דנים כיצד (1) לגדל את הצמחים, לאסוף ולהפיץ דגימות שורש, (2) להשיג תמונות של דגימות RSA מפוזרות, (3) ללכוד את התמונות, ו-(4) להשתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת תכונות שורש. יתרונה של השיטה הנוכחית הוא המדידה הרבגונית, הקלה והיעילה של תכונות ה-RSA.

Introduction

ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA), שהיא תת-קרקעית, היא איבר חיוני לגידול צמחים ולפרודוקטיביות ^1,2,3. לאחר השלב העוברי, הצמחים עוברים את השינויים המורפולוגיים המשמעותיים ביותר שלהם. האופן שבו השורשים גדלים בקרקע משפיע מאוד על צמיחת חלקי הצמח מעל פני הקרקע. צמיחת שורשים היא הצעד הראשון בנביטה. זוהי תכונה אינפורמטיבית שכן היא מגיבה באופן ייחודי לחומרים מזינים זמינים שונים 1,2,3,4. RSA מפגין רמה גבוהה של פלסטיות התפתחותית, כלומר הסביבה משמשת תמיד לקבלת החלטות על פיתוח ^2,5. שינויים בסביבה הקשו על ייצור היבול בתרחיש הנוכחי. באופן רציף, ה-RSA משלב אותות סביבתיים בבחירות התפתחותיות⁵. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של העקרונות העומדים מאחורי התפתחות שורשים חיונית ללמידה כיצד צמחים מגיבים לסביבות משתנות ^2,5.

ה-RSA חש ריכוזים תזונתיים משתנים ומבצע שינויים פנוטיפיים 4,6,7,8,9,10,11,12. מחקרים מראים שמורפולוגיה של שורשים/RSA היא פלסטית מאוד בהשוואה למורפולוגיה של יורה ^1,3. מיפוי תכונות RSA יעיל ביותר ברישום ההשפעה של^{שינוי סביבת הקרקע} הסובבת ^1,11,12.

באופן כללי, פערים בהשפעה של חוסרים תזונתיים שונים על פנוטיפ השורש דווחו במחקרים קודמים רבים 3,11,13,14,15. לדוגמה, ישנם מספר דיווחים מנוגדים על שינויים הנגרמים על ידי רעב פוספט (Pi) במספר, אורך וצפיפות של שורשים רוחביים (LR). עלייה בצפיפות LR דווחה תחת מצב חסר Pi ^6,8. לעומת זאת, ירידה בצפיפות LR בתנאים של מחסור ב-Pi דווחה גם על ידי מחברים אחרים 3,13,16. אחד הגורמים הבולטים לחוסר עקביות זה הוא השימוש במדיום הג'לינג הנוטה לזיהום יסודי, אשר אגר מכיל לעתים קרובות¹⁰. חוקרים בדרך כלל מגדלים את צמחי הניסוי שלהם על מערכת לוחות מבוססת אגר ורושמים את תכונות השורש. תכונות RSA רבות מוסתרות או מעוגנות לעתים קרובות בתוך חומר האגר ולא ניתן לתעדן. ניסויים הקשורים לגרימת מחסור בחומרים מזינים, שבהם משתמשים לעתים קרובות מוציאים רכיב אחד לחלוטין מהמדיום, אינם יכולים להתבצע בתווך ג'ל הנוטה לזיהום יסודי^11,14,15. חומרים מזינים רבים נמצאים לעתים קרובות בכמויות משמעותיות במדיה אגר, כולל P, Zn, Fe, ועוד רבים 11,14,15. יתר על כן, צמיחת RSA איטית יותר במדיה מבוססת אגר מאשר בתווך נוזלי שאינו מבוסס אגר. כתוצאה מכך, יש צורך לבסס גישה חלופית שאינה מבוססת אגר לכימות ורישום איכותי של הפנוטיפ של RSA. כתוצאה מכך, פותחה השיטה הנוכחית, שבה מגדלים פלנטלים במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה על גבי רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט 1,10,11.

מחקר זה מציג גרסה מאולתרת מפורטת של השיטה הקודמת שתוארה על ידי Jain et ^al.10. אסטרטגיה זו כווננה לדרישות הנוכחיות בביולוגיה של שורשי הצמח וניתן להשתמש בה גם עבור צמחים כמו אספסת, מלבד צמחי מודל. הפרוטוקול הוא הדרך העיקרית למדוד את השינויים ב-RSA, והוא דורש רק ציוד פשוט. הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד לפנוטיפ מספר תכונות שורש, כגון שורשים ראשוניים ורוחביים בתווך נורמלי ושונה (חסר Pi). הוראות שלב אחר שלב ורמזים מועילים אחרים שלוקטו מחוויותיו של המחבר מסופקים כדי לעזור לחוקרים לעקוב אחר המתודולוגיות המוצעות בשיטה זו. המחקר הנוכחי נועד לספק שיטה פשוטה ויעילה לחשיפת כל מערכת השורשים של צמחים, כולל LR מסדר גבוה יותר. שיטה זו כוללת פיזור ידני של מערכת השורשים באמצעות מברשת עגולה בצבעי מים, המאפשרת שליטה מדויקת בחשיפת השורשים 1,10,11,12. זה לא דורש ציוד יקר או תוכנה מסובכת. שיטה זו שיפרה את ספיגת החומרים המזינים ואת קצב הצמיחה; לצמחים יש תמיסה עשירה בחומרים מזינים הנספגת בקלות על ידי שורשיהם. השיטה הנוכחית מתאימה לחוקרים המעוניינים למפות בפירוט את תכונות מערכת השורשים של הצמח, במיוחד במהלך ההתפתחות המוקדמת (10-15 ימים לאחר הנביטה). הוא מתאים למערכות שורשים קטנות, צמחי מודל כמו ארבידופסיס וטבק, וצמחים לא קונבנציונליים כמו אלפלפה עד שמערכת השורשים שלהם נכנסת לקופסאות המג'נטה.

השלבים לניתוח פנוטיפי של התפתחות RSA בארבידופסיס מתוארים בפרוטוקול זה כדלקמן: (1) שיטת עיקור פני השטח של זרעים לצמחים (Arabidopsis), (2) השלבים להקמת המערכת ההידרופונית, ולאחר מכן זריעת זרעים על מדיום, (3) הליך הוצאת הזריעה המלאה והתפשטות על צלחת פטרי לניתוח RSA, (4) כיצד להקליט את התמונות עבור RSA, ו-(5) לחשב פרמטרים חשובים של RSA באמצעות תוכנת ImageJ.

Protocol

הפרוטוקול כולו מסוכם באופן סכמטי באיור 1, ומציג את כל השלבים החיוניים הכרוכים בחשיפת ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של צמחים. שלבי הפרוטוקול מפורטים להלן:

1. עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis

1. מעבירים כף מדידה זעירה (כ-100 זרעים = כ-2.5 מ"ג) של זרעים לצינור מיקרופוגה, ומשרים למשך 30 דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר (RT). הליך זה כולו מתבצע במצב אספטי.
2. צנטריפוגה קצרה את צינור המיקרופוגה המכיל זרעים ב 500 x גרם במשך 5 שניות, באמצעות כל צנטריפוגה שולחנית ב RT כדי לתת לזרעים לשקוע.
3. מרוקנים את המים, מוסיפים 700 מיקרוליטר של אתנול 70% (v/v), מערבלים למשך מספר שניות ומסתובבים. חזור על מערבולות וסחרור במידת הצורך, אך ודא שזמן הטיפול של אתנול 70% נשאר 3 דקות.
4. לאחר 3 דקות, יש לשטוף מיד פעם אחת במים סטריליים. שמור על שלב שטיפת אתנול בזמן ככל האפשר, כמו חשיפה ממושכת אתנול מקטין נביטה.
5. טפלו בזרעים עם אקונומיקה מסחרית מדוללת (4% v/v) עם טיפה של Tween-20 למשך 7 דקות. מערבבים את הזרעים עם תמיסת אקונומיקה על ידי היפוך הצינורות במהירות 8-12 פעמים, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה (500 x גרם במשך 5 שניות ב- RT). קצף נראה מופיע בצינור.
6. דקרו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה בנפח 1 מ"ל ושטפו את הזרעים בחמש שטיפות לפחות במים סטריליים, לאחר אותו הליך מערבול.
7. השאירו את פני השטח מעוקרים זרעים במים לדגור במשך 2-3 ימים ב 4 ° C עבור ריבוד¹⁰.

2. הגדרת מערכת הידרופונית לנביטת זרעים

1. ממלאים חצי קופסת מגנטה סטנדרטית במים מזוקקים ומבצעים אוטוקלאב. בצעו אוטוקלבציה של יריעת הפוליקרבונט (צבע ברור ומרקם חלק) וחתכו מלבנים בגודל 4X8 ס"מ, כאשר נקודת האמצע מחורצת יותר ממחצית הדרך של המלבן כך ששני מלבנים עשויים להיצמד זה לזה ליצירת צורת X¹⁰. השתמש בהגדרה זו כדי להחזיק את רשת הפוליפרופילן (ריבועים בגודל 6 ס"מ x 6 ס"מ בגודל נקבוביות 250 מיקרומטר, או בהתאם לדרישה) חתוכה מגיליונות בגודל 12x 24 אינץ'¹⁰.
   הערה: פוליפרופילן עמיד מאוד לחומצות, אלקליות וכימיקלים אחרים; לכן, זה כבר בחר. Autoclaving נוטה לעוות רשת פוליפרופילן; לפיכך, מומלץ לשאת בנפרד עטוף ברדיד אלומיניום. מומלץ להשתמש בתנאי אוטוקלאבינג אופייניים של 16 דקות, 121°C, 15 psi או 775 מ"מ כספית.
2. הוסף מדיה בסיסית סטרילית חצי MS עם ויטמינים + 1.5% (w/v) סוכרוז, כפי שתואר על ידי Shukla et ^al.1, לכל קופסה כדי להגיע לקצה התחתון של רשת פוליפרופילן בזרימה למינרית. כל ההליכים מתבצעים בתנאים אספטיים.
3. זרעו את הזרעים המעוקרים על פני השטח על הרשת (גודל נקבוביות של 250 מיקרומטר) באופן הידרופוני ואפשרו להם לגדול במשך 3 ימים.
4. לאחר 3 ימים, מעבירים את השתילים לרשת (גודל נקבוביות 500 מיקרומטר) ומאפשרים להם לגדול במשך יומיים.
5. לאחר יומיים (סה"כ 5 ימים), להעביר את השתילים על מדיה הבקרה (כלומר, שונה MS מזין מדיה 1 המכיל 2.0 mM NH 4 NO 3, 1.9 mM KNO₃, 0.15 mM MgSO 4·7H ₂O,^0.1 mM MnSO₄· H₂O, 3.0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0.1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0.3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5.0 μM KI, 0.1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0.1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1.25 mM KH ₂PO ₄, 100 μM H 3 BO₃, 1 μM Na 2 MoO₄·2H₂O,1.5% סוכרוז, 1.25 mM MES, pH 5.7 מותאם עם 0.1 M MES [pH 6.1]) ולמדיה הניסיונית (למשל, טיפול P- [0 mM]; KH2 PO 4 מוחלף ב 0.62 mM K₂SO₄ מהרכב אמצעי הבקרה כאמור לעיל¹. עבור טיפולי פאי עודפים, הריכוז של KH 2 PO₄ גדל בתווך טרשת נפוצה שונה [_2.5, 5.0, 10.0, 20.0 מילימול]¹) ולתת לזרעים לגדול במשך 7 ימים.
   הערה: גודל נקבוביות רשת גדול יותר (500 מיקרומטר) מאפשר קטיף חלק של שתילים שלמים ללא כל נזק או צורך לחתוך בהיפוקוטיל. הצמחים גדלים בתנאי גידול סטנדרטיים (כלומר, 16 שעות אור / 8 שעות כהות פוטופריוד, 150 μmol·^m-2·^s-1 עוצמת אור, 60%-70% לחות) ב 23 ° C.

3. בחינת RSA

1. הכינו צלחות אגר (1.1%) לפיזור שורשים (גודל צלחת פטרי: 150 מ"מ x 15 מ"מ).
2. הוסף 10-20 מ"ל של מי ברז מסוננים autoclaved לצלחת Petri, כאמור לעיל. מוציאים בעדינות את השתילים מהרשת (500 מיקרומטר) וטובלים אותם במים על הצלחות.
3. מורחים בעדינות את שורש העציץ בצלחת המלאה במים בעזרת מברשת אמנותית עגולה בצבעי מים (גדלים: מס' 14, 16, 18 ו-20).
   הערה: בעת ביצוע התפשטות מערכת השורשים, ראשית לתפוס את השורש הראשוני ולהפיץ אותו לקו ישר, כפי שהוא משמש ציר. לאחר מכן, פזרו את ה-LR באופן סימטרי בכל צד של השורש הראשוני, במידת האפשר. לאחר מכן, להפיץ את LR מסדר שני מקושר LR מסדר ראשון. תהליך ההתפשטות הזה הוא סוג של אמנות; עשו זאת בעדינות, לאט, כמו אמן שמצייר תמונה של ה-RSA.
4. הטו מעט את הצלחת כדי להסיר את המים.
   הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את ההליך על ידי הצבת לוחות התפשטות אלה ב -4 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, כאשר נדרש עיבוד תמונה, הוציאו את הלוחות והניחו אותם ב- RT לזמן מה. נגבו את המים המעובים, ואז ניתן יהיה לעבד את התמונה בנוחות.

4. הקלטת תמונות עבור RSA

1. סרקו או צלמו את לוחות הפטרי הללו בהתאם.
   הערה: לקבלת תמונות באיכות גבוהה, רזולוציית 600 dpi מומלצת לסריקה, ולפחות מצלמת 12 מגה פיקסל מומלצת לצילום.
2. מדוד את תכונות ארכיטקטורת מערכת הבסיס באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) הזמינה באופן חופשי. כדי לבצע במהירות את השלבים למדידת אורך השורש באמצעות תוכנת ImageJ, עיין בדוגמה "מדידת אורך מתאר DNA"¹⁷.
   הערה: שלבים אלה מבוצעים כדי למדוד את אורכי הבסיס בתמונות שצולמו באמצעות סורק או מצלמה ברזולוציה גבוהה.
   1. השתמש במרחק נתון של אורך כדי להגדיר את קנה המידה. המרחק הידוע של סרגל קנה המידה באיור 3 הוא 2 ס"מ. בחרו בכלי קו ישר מסרגל הכלים ImageJ (הכלי החמישי משמאל). השתמשו בכלי קו ישר ליצירת בחירת קו המתווה את סרגל קנה המידה. סיים חלוקה לרמות על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, לחיצה כפולה או לחיצה בתיבה בהתחלה.
   2. מדוד את אורך סרגל קנה המידה הידוע בפיקסלים באמצעות סרגל הכלים Analyze > Measure . רשום לעצמך את אורך הפיקסלים.
   3. פתח את תיבת הדו-שיח הגדרת קנה מידה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה הגדרת קנה מידה בכרטיסיה ניתוח . בשדה 'מרחק בפיקסלים ', הזינו את אורך הפיקסלים (כפי שצוין לעיל). לאחר מכן, בשדה מרחק ידוע , הזן את הערך, כפי שמוצג בסרגל קנה המידה (כאן, הוא 20 מ"מ). הגדר את יחידת האורך כ - mm. יחסי הגודל של הפיקסלים הם 1.0. עכשיו, קנה המידה מוגדר על ידי x מספר פיקסלים למילימטר. כדי לנעול את קנה המידה עבור תמונה מסוימת זו, לחץ על אישור.
   4. צרו בחירת שורה המתארת את אורך השורש בעזרת הכלי קו מקוטע . סיים חלוקה לרמות על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, לחיצה כפולה או לחיצה בתיבה בהתחלה. לחץ וגרור את ה"נקודות אחיזה" הקטנות בשחור-לבן לאורך המיתאר כדי להתאים את בחירת הקו בהתאם לצורך.
   5. השתמש בפקודה Measure תחת הכרטיסייה Analyze של ImageJ כדי לכמת את אורך השורש. כדי להעביר את הנתונים הנמדדים לגיליון אלקטרוני, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על החלון תוצאות , בחר העתק הכל מהתפריט המוקפץ, עבור לגיליון האלקטרוני ולאחר מכן הדבק את הנתונים.
      הערה: כמתואר לעיל, הגדר את קנה המידה באמצעות המרחק הידוע של סרגל קנה המידה באפשרות ImageJ set scale scale. זה נותן את מספר הפיקסלים ליחידת אורך. הוא נדרש להגדיר מחדש את קנה המידה בכל פעם, בכל פעם שתמונה חדשה מנותחת.
3. מדידה וחישוב של תכונות RSA
   1. מדדו את אורך השורש הראשוני בין צומת ההיפוקוטיל לקצה קצה השורש.
   2. מדוד את אורך LR מסדר ראשון ושני.
   3. מדוד את אזור ההסתעפות (BZ) של השורש הראשי. אזור ההסתעפות של השורש הראשוני (BZ PR) משתרע על פני נקודת ההתפרצות הראשונה של LR עד לנקודת ההתפרצות האחרונה של^LR.
   4. רשום את מספר ה- LRs, שהוא מספר ה- LR שמקורו בגבול^{יחסי הציבור} של BZ.
   5. מדוד את האורך הממוצע של LR מסדר ראשון ומעלה. גזור את האורך הממוצע של LR מסדר ראשון (1° LR) (סנטימטר לכל שורש) על ידי חלוקת האורך הכולל של 1° LR במספר הכולל של 1° LR.
   6. מדוד את האורך הממוצע של LR מסדר שני. חשב את האורך הממוצע של LR מסדר שני (2° LR) על ידי חלוקת האורך הכולל של 2° LR במספר הכולל של 2° LR.
   7. מדוד את צפיפות LR של 1°. חשב את צפיפות LR של 1° (מספר של 1° LR ליחידת אורך של BZ^PR) על ידי חלוקת מספר ה- LR של 1° באורך ה^{- PR} של BZ.
   8. מדוד את צפיפות LR של 2°. חשב את צפיפות LR של 2° על ידי חלוקת מספר ה- LR של 2° באורך ה- BZ של 1° LR (מספר של 2° LR ליחידת אורך של BZ של שורשים רוחביים של 1°).
   9. מדוד את אורך השורש הכולל (TRL). זהו המצרף של השורש הראשוני, 1° LR ו-2° LR (ויותר, אם קיים).

5. מדידת שיער שורש

הערה: למרות שהמערכת ההידרופונית אינה טובה בקידום צמיחת והתפתחות שיער שורשי, למרות היותה חזקה כמו שהיא במצעי צמיחה מוצקים, עדיין חשוב ללמוד אותה בהקשר הנוכחי. בצע את השלבים הבאים כדי לנתח את התפתחות שיער השורש בחתך של 5 מ"מ מקצה השורש העיקרי של השתילים.

1. חותכים קטע של 2 ס"מ מהשורש הראשוני מקצה השורש.
2. הרכיבו את מקטע השורש על שקופית באמצעות 10% גליצרול כאמצעי הרכבה.
3. מקם את השקופית מתחת למיקרוסקופ סטריאו.
4. השתמש במנשא הצירי כדי להמחיש וללכוד תמונות של שערות השורש.
5. נתח את התמונות כדי ללמוד את המבנה והמאפיינים של שערות השורש באמצעות תוכנת ImageJ כפי שתואר קודם לכן.

תוצאות

התכונות המורפומטריות השונות של ארכיטקטורת מערכת שורשים (RSA) נמדדות באמצעות כלי מעבדה פשוטים, והשלבים מתוארים באופן סכמטי באיור 1. פרטי המערך ההידרופוני מדגימים את הפוטנציאל של הפרוטוקול במדידת RSA (איור 1 ואיור 2).

בהתחשב בהבדלי...

Discussion

עבודה זו הדגימה מיפוי RSA באמצעות ציוד מעבדה פשוט. באמצעות שיטה זו, שינויים פנוטיפיים נרשמים ברמה המעודנת. היתרון של אסטרטגיה זו הוא שחלק הצילומים לעולם לא בא במגע עם התקשורת, ולכן הפנוטיפ של הצמחים הוא מקורי. שיטה זו כוללת הקמת מערכת הידרופונית לגידול צמחים כמתואר בפרוטוקול. לאחר מכן, מוציא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)