Простой протокол для картирования черт архитектуры корневой системы растений

Резюме

Мы используем простые лабораторные инструменты для изучения архитектуры корневой системы (RSA) Arabidopsis и Medicago. Ростки выращивают на гидропонике над сеткой и распределяют с помощью художественной кисти, чтобы выявить RSA. Изображения делаются с помощью сканирования или камеры с высоким разрешением, а затем анализируются с помощью ImageJ для отображения черт.

Аннотация

Всесторонние знания о развитии архитектуры корневой системы растений (RSA) имеют решающее значение для повышения эффективности использования питательных веществ и повышения устойчивости сортов сельскохозяйственных культур к экологическим проблемам. Представлен экспериментальный протокол для настройки гидропонной системы, роста ростков, распространения RSA и визуализации. В подходе использовалась пурпурная коробчатая гидропонная система, содержащая полипропиленовую сетку, поддерживаемую поликарбонатными клиньями. Экспериментальные условия иллюстрируются оценкой RSA проростков при различном поступлении питательных веществ (фосфатов [Pi]). Система была создана для изучения RSA Arabidopsis, но ее легко адаптировать для изучения других растений, таких как Medicago sativa (люцерна ). Проростки Arabidopsis thaliana (Col-0) используются в этом исследовании в качестве примера для понимания растения RSA. Семена стерилизуют путем обработки этанолом и разбавленным коммерческим отбеливателем и выдерживают при температуре 4 ° C для стратификации. Семена проращивают и выращивают на жидкой полуМС среде на полипропиленовой сетке, поддерживаемой поликарбонатными клиньями. Ростки выращивают в стандартных условиях роста в течение желаемого количества дней, аккуратно вынимают из сетки и погружают в водосодержащие агаровые пластины. Каждая корневая система ростков аккуратно выкладывается на заполненную водой тарелку с помощью круглой художественной кисти. Эти пластины Петри фотографируются или сканируются с высоким разрешением, чтобы задокументировать признаки RSA. Корневые признаки, такие как первичный корень, боковые корни и зона ветвления, измеряются с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ. В этом исследовании представлены методы измерения характеристик корней растений в контролируемых условиях окружающей среды. Мы обсудим, как (1) выращивать ростки, собирать и распространять образцы корней, (2) получать изображения распространенных образцов RSA, (3) захватывать изображения и (4) использовать программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки корневых атрибутов. Преимущество настоящего метода заключается в универсальном, простом и эффективном измерении признаков RSA.

Введение

Архитектура корневой системы (RSA), находящаяся под землей, является жизненно важным органом для роста и продуктивности растений ^1,2,3. После эмбриональной стадии растения претерпевают наиболее значительные морфологические изменения. То, как корни растут в почве, сильно влияет на рост частей растений над землей. Рост корней является первым шагом в прорастании. Это информативная черта, поскольку она однозначно реагирует на различные доступные питательные вещества 1,2,3,4. RSA демонстрирует высокую степень пластичности развития, что означает, что окружающая среда всегда используется для принятия решений о развитии ^2,5. Изменения в окружающей среде затруднили производство сельскохозяйственных культур в нынешнем сценарии. На постоянной основе ЮАР учитывает сигналы окружающей среды при выборе вариантов развития⁵. В результате глубокое понимание принципов, лежащих в основе развития корней, имеет важное значение для изучения того, как растения реагируют на изменение окружающей среды ^2,5.

RSA определяет различные концентрации питательных веществ и вносит фенотипические изменения 4,6,7,8,9,10,11,12. Исследования показывают, что морфология корня / RSA очень пластична по сравнению с морфологией побегов ^1,3. Картирование признаков RSA очень эффективно при регистрации эффекта изменения окружающей почвенной среды 1,11,12.

В целом, расхождения во влиянии различных дефицитов питательных веществ на фенотип корня были зарегистрированы во многих более ранних исследованиях 3,11,13,14,15. Например, есть несколько противоположных сообщений об изменениях количества, длины и плотности боковых корней (LR), вызванных фосфатным голоданием (Pi). Сообщалось об увеличении плотности LR при условии дефицита Pi ^6,8. Напротив, снижение плотности LR в условиях дефицита Pi также было сообщено другими авторами 3,13,16. Одной из основных причин этих несоответствий является использование подверженной элементарному загрязнению желирующей среды, которую агар часто содержит¹⁰. Исследователи обычно выращивают свои экспериментальные растения на пластинчатой системе на основе агара и записывают корневые признаки. Многочисленные признаки RSA часто скрыты или укоренены в агаровом материале и не могут быть задокументированы. Эксперименты, связанные с индуцированием дефицита питательных веществ, в которых пользователи часто полностью исключают один компонент из среды, не могут быть выполнены в подверженной элементарному загрязнению желирующей среде^11,14,15. Многочисленные питательные вещества часто присутствуют в значительных количествах в агаровой среде, включая P, Zn, Fe и многие другие^11,14,15. Кроме того, рост RSA медленнее в средах на основе агара, чем в жидкой среде без агара. В результате возникает необходимость в разработке альтернативного неагарового подхода для количественной оценки и качественной регистрации фенотипа RSA. Следовательно, был разработан текущий метод, в котором ростки выращиваются в пурпурной коробчатой гидропонной системе поверх полипропиленовой сетки, поддерживаемой поликарбонатными клиньями 1,10,11.

В этом исследовании представлена подробная импровизированная версия более раннего метода, описанного Jain et ^al.10. Эта стратегия была адаптирована к текущим требованиям биологии корней растений и может также использоваться для таких растений, как люцерна, кроме модельных растений. Протокол является основным способом измерения изменений в RSA, и для него требуется только простое оборудование. Настоящий протокол иллюстрирует, как фенотипировать несколько корневых признаков, таких как первичные и боковые корни в нормальной и модифицированной среде (дефицит Pi). Пошаговые инструкции и другие полезные советы, почерпнутые из опыта автора, предоставляются, чтобы помочь исследователям следовать методологиям, предлагаемым в этом методе. Настоящее исследование направлено на то, чтобы предоставить простой и эффективный метод выявления всей корневой системы растений, включая LR высшего порядка. Этот метод включает в себя ручное разведение корневой системы круглой акварельной художественной кистью, позволяющей точно контролировать обнажение корней 1,10,11,12. Он не требует дорогостоящего оборудования или сложного программного обеспечения. Этот метод улучшил усвоение питательных веществ и скорость роста; Растения имеют богатый питательными веществами раствор, легко поглощаемый их корнями. Настоящий метод подходит для исследователей, которые хотят детально отобразить черты корневой системы растения, особенно на ранних стадиях развития (через 10-15 дней после прорастания). Он подходит для небольших корневых систем, модельных растений, таких как арабидопсис и табак, и нетрадиционных растений, таких как люцерна, пока их корневая система не поместится в пурпурные коробочки.

Этапы фенотипического анализа развития RSA у Arabidopsis изложены в этом протоколе следующим образом: (1) метод стерилизации поверхности семян для растений (Arabidopsis), (2) этапы создания гидропонной системы с последующим посевом семян на среду, (3) процедура извлечения полных семян и разбрасывания на пластине Петри для анализа RSA, (4) как записывать изображения для RSA, и (5) вычислять важные параметры RSA с помощью программного обеспечения ImageJ.

протокол

Весь протокол схематично изложен на рисунке 1, показывая все основные этапы, связанные с выявлением архитектуры корневой системы (RSA) проростков. Шаги протокола подробно описаны ниже:

1. Стерилизация поверхности семян арабидопсиса

1. Переложите крошечную мерную ложку (примерно 100 семян = примерно 2,5 мг) семян в микропробирку и замочите на 30 минут в дистиллированной воде комнатной температуры (RT). Вся эта процедура проводится в асептическом состоянии.
2. Кратковременно центрифугируйте микрофугу с семенами при 500 x g в течение 5 с, используя любую настольную центрифугу при RT, чтобы дать семенам осесть.
3. Сцедите воду, добавьте 700 мкл 70% (об./об.) этанола, встряхните в течение нескольких секунд и вращайте. При необходимости повторите вихревое и вращание, но убедитесь, что время обработки 70% этанола остается на уровне 3 минут.
4. Через 3 минуты немедленно смойте один раз стерильной водой. Проводите этап промывки этанола как можно более своевременно, так как длительное воздействие этанола снижает всхожесть.
5. Обработайте семена разбавленным коммерческим отбеливателем (4% об./об.) каплей Tween-20 в течение 7 мин. Смешайте семена с раствором хлорной извести, быстро перевернув пробирки 8-12 раз, после чего проведите короткую центрифугу (500 x g в течение 5 с при RT). Видно, как в трубке появляется пена.
6. Сцедите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл и промойте семена не менее чем пятью промывками стерильной водой, следуя той же процедуре вихряния.
7. Поверхность стерилизованных семян оставить в воде и выдержать 2-3 дня при температуре 4 °С для стратификации¹⁰.

2. Настройка гидропонной системы для проращивания семян

1. Наполовину заполните стандартную пурпурную коробку дистиллированной водой и автоклавируйте ее. Автоклавируйте лист поликарбоната (прозрачный цвет и гладкая текстура) и вырежьте прямоугольники размером 4 см x 8 см с насечкой в середине прямоугольника, так что два прямоугольника могут соединяться вместе, образуя X-образную^{форму 10}. Используйте эту установку для удержания полипропиленовой сетки (квадраты размером 6 см x 6 см с размером пор 250 мкм или в зависимости от требований), вырезанной из листов размером 12 x 24 дюйма¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полипропилен обладает высокой устойчивостью к кислотам, щелочам и другим химическим веществам; Поэтому он был выбран. Автоклавирование имеет тенденцию деформировать полипропиленовую сетку; Следовательно, его рекомендуется носить отдельно, завернутым в алюминиевую фольгу. Рекомендуются типичные условия автоклавирования 16 мин, 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм или 775 мм рт.ст.
2. Добавьте стерильную базальную среду с витаминами + 1,5% (мас./об.) сахарозы, как описано Shukla et ^al.1, в каждую коробку, чтобы достичь нижнего края полипропиленовой сетки в ламинарном потоке. Все процедуры проводятся в асептических условиях.
3. Посейте стерилизованные на поверхности семена на сетку (размер пор 250 мкм) на гидропонике и дайте им прорасти в течение 3 дней.
4. Через 3 дня переложите сеянцы на сетку (размер пор 500 мкм) и дайте им расти в течение 2 дней.
5. Через 2 дня (всего 5 дней) перенесите проростки на контрольную среду (т.е. модифицированную питательную среду MS 1, содержащую 2,0 мМ NH 4 NO 3, 1,9 мМ KNO₃, 0,15 мМ MgSO 4·7H₂O,^0,1 мМ MnSO ₄· H 2 O, 3,0 мкМ ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 мкМ CuSO 4·5H 2 O, 0,3 мМ CaCl 2·2H 2 O, 5,0 мкМ KI, 0,1 мкМ CoCl 2·6H 2 O, 0,1 мМ FeSO 4·7H 2 O, 0,1 мМ Na 2 ЭДТА·2H 2 O, 1,25 мМ KH ₂PO ₄, 100 мкМ H 3 BO₃, 1 мкМ Na 2 MoO₄·2H₂O, 1,5% сахарозы, 1,25 мМ MES, рН 5,7 с поправкой на 0,1 М MES [рН 6,1]) и к экспериментальным средам (например, обработка P- [0 мМ]; KH 2 PO4 заменяется 0,62 мМ K₂SO₄ из состава контрольной среды, как указано выше¹. При избыточных обработках Pi концентрацию KH 2 PO₄ увеличивают в модифицированной среде MS [_2,5, 5,0, 10,0, 20,0 мМ]¹) и дают семенам расти в течение 7 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Больший размер пор ячеек (500 мкм) облегчает плавный сбор целых саженцев без каких-либо повреждений или необходимости разрезания гипокотиля. Проростки растут в стандартных условиях роста (т. е. 16 ч света / 8 ч темного фотопериода, интенсивность света 150 мкмоль · ^м-2 · ^с-1 интенсивность света, влажность 60% -70%) при 23 ° C.

3. Экспертиза ЮАР

1. Подготовьте агаровые (1,1%) пластины для раскидки корней (размер чашки Петри: 150 мм х 15 мм).
2. Добавьте 10-20 мл автоклавной фильтрованной водопроводной воды в чашку Петри, как упоминалось выше. Аккуратно вытащите сеянцы из сетки (500 мкм) и погрузите их в воду на тарелках.
3. Аккуратно разложите корень каждого саженца в заполненной водой тарелке с помощью круглой акварельной художественной кисти (размеры: No 14, 16, 18 и 20).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проводя распространение корневой системы, сначала возьмитесь за первичный корень и расправьте его по прямой линии, так как он служит осью. Затем распределите LR симметрично по обе стороны от первичного корня, где это возможно. После этого распространите LR второго порядка, связанный с LR первого порядка. Этот процесс распространения является своего рода искусством; делайте это мягко, медленно, как художник, рисующий изображение ЮАР.
4. Слегка наклоните тарелку, чтобы удалить воду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе процедуру можно приостановить, поставив эти пластины при температуре 4 °C. Позже, когда потребуется обработка изображения, выньте пластины и поместите их на некоторое время в RT. Протрите конденсатом, и тогда изображение можно будет удобно обрабатывать.

4. Запись изображений для RSA

1. Отсканируйте или сфотографируйте эти пластины Петри соответствующим образом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высококачественных фотографий для сканирования рекомендуется разрешение 600 dpi, а для фотосъемки рекомендуется использовать камеру не менее 12 мегапикселей.
2. Измерьте характеристики архитектуры корневой системы с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Чтобы быстро выполнить шаги по измерению длины корня с помощью программного обеспечения ImageJ, обратитесь к примеру «Измерение длины контура ДНК»¹⁷.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги выполняются для измерения длин корней на изображениях, снятых с помощью сканера или камеры высокого разрешения.
   1. Используйте заданное расстояние длины, чтобы установить масштаб. Известное расстояние до масштабной линейки на рисунке 3 составляет 2 см. Выберите инструмент «Прямая линия » на панели инструментов ImageJ (пятый инструмент слева). Инструмент « Прямая линия » используется для создания выделенной линии, обводящей масштабную линейку. Завершите структурирование, щелкнув правой кнопкой мыши, дважды щелкнув или щелкнув поле в начале.
   2. Измерьте длину известной масштабной линейки в пикселях с помощью панели инструментов «Анализ > измерение ». Запишите длину в пикселях.
   3. Откройте диалоговое окно « Задание масштаба », щелкнув вкладку « Задать масштаб » на вкладке «Анализ». В поле «Расстояние в пикселях» введите длину в пикселях (как указано выше). Далее в поле «Известное расстояние » введите значение, как показано на шкале (здесь это 20 мм). Установите единицу измерения длины в мм. Соотношение сторон пикселей составляет 1,0. Теперь масштаб определяется количеством пикселей x на миллиметр. Чтобы заблокировать масштаб для этого конкретного изображения, нажмите «ОК».
   4. Создайте выделенную линию, которая обводит длину корня, с помощью инструмента «Сегментированная линия ». Завершите структурирование, щелкнув правой кнопкой мыши, дважды щелкнув или щелкнув поле в начале. Щелкните и перетащите маленькие черно-белые «маркеры» вдоль контура, чтобы при необходимости настроить выделение линии.
   5. Используйте команду « Измерить » на вкладке «Анализ » ImageJ для количественной оценки длины корня. Чтобы перенести измеренные данные в электронную таблицу, щелкните правой кнопкой мыши окно «Результаты », выберите « Копировать все » во всплывающем меню, переключитесь на электронную таблицу и вставьте данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано выше, установите масштаб, используя известное расстояние до масштабной линейки в параметре ImageJ set scale. Это дает количество пикселей на единицу длины. Требуется заново устанавливать масштаб каждый раз, когда анализируется новое изображение.
3. Измерение и расчет признаков RSA
   1. Измерьте длину первичного корня от гипокотильного соединения до конца кончика корня.
   2. Измерьте длину LR первого и второго порядка.
   3. Измерьте зону ветвления (BZ) первичного корня. Зона ветвления первичного корня (BZ^PR) охватывает первую точку возникновения LR до последней точки возникновения LR.
   4. Запишите количество LR, которое представляет собой количество LR, происходящих в пределах границ^{BZ PR.}
   5. Измерьте среднюю длину LR первого и более высокого порядка. Выведите среднюю длину LR первого порядка (1° LR) (сантиметр на корень), разделив общую длину LR 1° на общее количество LR 1°.
   6. Измерьте среднюю длину LR второго порядка. Рассчитайте среднюю длину LR второго порядка (2° LR), разделив общую длину LR 2° на общее количество LR 2°.
   7. Измерьте плотность 1° LR. Рассчитайте плотность 1° LR (количество 1° LR на единицу длины BZ PR^), разделив количество 1° LR на длину BZ^PR.
   8. Измерьте плотность 2° LR. Рассчитайте плотность 2° LR, разделив число 2° LR на длину BZ 1° LR (количество 2° LR на единицу длины BZ боковых корней 1°).
   9. Измерьте общую длину корня (TRL). Это совокупность длин первичного корня, 1° LR и 2° LR (и более, если есть).

5. Измерение корневых волос

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя гидропонная система не очень хороша для стимулирования роста и развития корневых волос, несмотря на то, что она так же надежна, как и в твердых питательных средах, все же важно изучить ее в нынешнем контексте. Выполните следующие действия, чтобы проанализировать развитие корневых волосков на участке 5 мм от кончика первичного корня саженцев.

1. Отрежьте от кончика корня 2 см срез первичного корня.
2. Установите корневую часть на предметное стекло, используя 10% глицерина в качестве монтажной среды.
3. Поместите предметное стекло под стереомикроскоп.
4. Используйте осевой носитель для визуализации и захвата изображений корневых волосков.
5. Проанализируйте изображения, чтобы изучить структуру и характеристики корневых волосков с помощью программного обеспечения ImageJ, как описано ранее.

Результаты

Различные морфометрические признаки архитектуры корневой системы (RSA) измеряются с помощью простых лабораторных инструментов, а этапы схематично изображены на рисунке 1. Детали гидропонной установки демонстрируют потенциал протокола в измерении RSA (рис. 1 и ?...

Обсуждение

Эта работа продемонстрировала картографирование RSA с использованием простого лабораторного оборудования. С помощью этого метода регистрируются фенотипические изменения на уточненном уровне. Преимущество этой стратегии заключается в том, что часть побегов никогда не соприкасается с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)