植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル

要約

簡単な実験ツールを使用して、シロイヌナズナとメディカゴの根系アーキテクチャ(RSA)を調べます。小植物はメッシュ上で水耕栽培され、アートブラシを使用して広げられ、RSAが明らかになります。画像はスキャンまたは高解像度カメラを使用して撮影され、ImageJで分析されて形質をマッピングします。

要約

植物の根系構造(RSA)開発に関する包括的な知識は、栄養素の使用効率を改善し、環境問題に対する作物品種の耐性を高めるために重要です。水耕栽培システムのセットアップ、植物の成長、RSAの拡散、およびイメージングのための実験プロトコルが提示されます。このアプローチでは、ポリカーボネートウェッジで支えられたポリプロピレンメッシュを含むマゼンタボックスベースの水耕栽培システムを使用しました。実験設定は、様々な栄養素(リン酸塩[Pi])供給下での苗床のRSAを評価することによって例示される。このシステムはシロイヌナズナのRSAを調べるために設立されましたが、 メディカゴサティバ (アルファルファ)などの他の植物の研究にも容易に適応できます。 シロイヌナ ズナ(Col-0)の植物を本調査では、植物RSAを理解するための例として用いる。種子は、エタノールと希釈された市販の漂白剤を処理することによって表面滅菌され、層別化のために4°Cに保たれます。種子を発芽させ、ポリカーボネートウェッジで支持されたポリプロピレンメッシュ上の液体ハーフMS培地上で成長させる。植物を標準的な生育条件下で所望の日数だけ生育させ、メッシュから穏やかに摘み取り、含水寒天プレートに浸す。小植物の各根系は、丸いアートブラシの助けを借りて、水で満たされたプレート上に穏やかに広げられます。これらのペトリプレートは、RSA特性を文書化するために高解像度で撮影またはスキャンされます。一次根、側根、分岐ゾーンなどの根形質は、無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して測定されます。この研究は、制御された環境環境における植物の根の特性を測定するための技術を提供します。(1)苗を育て、根のサンプルを採取して広げる方法、(2)拡散したRSAサンプルの写真を取得する方法、(3)画像をキャプチャする方法、(4)画像解析ソフトウェアを使用して根の属性を定量化する方法について説明します。本方法の利点は、RSA形質の汎用性が高く、簡単で効率的な測定である。

概要

地下にある根系アーキテクチャ(RSA)は、植物の成長と生産性にとって重要な器官です^1,2,3。胚期の後、植物はそれらの最も重要な形態学的変化を経験する。根が土壌中で成長する方法は、地上の植物部分の成長に大きく影響します。根の成長は発芽の最初のステップです。それは異なる利用可能な栄養素^1,2,3,4に独自に反応するので、それは有益な形質です。RSAは高度な発達可塑性を示し、これは環境が常に開発に関する決定を行うために使用されることを意味します^2,5。環境の変化により、現在のシナリオでは作物生産がより困難になっています。RSAは継続的に、環境シグナルを発達上の選択に組み込んでいます⁵。その結果、根の発達の背後にある原理を完全に理解することは、植物が変化する環境にどのように反応するかを学ぶために不可欠です^2,5。

RSAは、さまざまな栄養素濃度を感知し、表現型の変化をレンダリングします⁴、⁶、⁷、⁸、⁹、¹⁰、^11、12。研究によると、根の形態/ RSAはシュートの形態と比較して非常に可塑性が高いことが示唆されています^1,3。RSA形質マッピングは、周囲の土壌環境を変化させる効果を記録するのに非常に有効である¹、^11、12。

一般に、根の表現型に対する様々な栄養欠乏の影響の不一致は、多くの以前の研究で報告されている³、^{11、13、14、15}。たとえば、リン酸塩(Pi)飢餓による側根(LR)の数、長さ、密度の変化については、いくつかの対照的な報告があります。LR密度の増加は、Pi欠乏条件^6,8の下で報告されています。対照的に、Pi欠損条件下でのLR密度の減少は、他の著者によっても報告されています3,13,16。これらの不一致の顕著な原因の1つは、寒天がしばしば¹⁰を含む元素汚染しやすいゲル化培地の使用です。研究者は通常、寒天ベースのプレートシステムで実験植物を育て、根の形質を記録します。多くのRSA形質は、寒天物質内に隠蔽または定着していることが多く、文書化することはできません。ユーザーが培地から1つの成分を完全に排除することが多い栄養欠乏症の誘発に関連する実験は、元素汚染が発生しやすいゲル化培地では実行できません¹¹、^14、15。寒天培地には、P、Zn、Feなど、多数の栄養素が大量に頻繁に存在します¹¹、^14、15。さらに、RSAの成長は、非寒天ベースの液体培地よりも寒天ベースの培地の方が遅い。その結果、RSAの表現型を定量化し定性的に記録するための代替の非寒天ベースのアプローチを確立する必要があります。その結果、ポリカーボネート^ウェッジ1,10,11で支持されたポリプロピレンメッシュの上にマゼンタボックスベースの水耕栽培システムで苗を飼育する現在の方法が開発されました。

この研究は、Jainらによって記述された以前の方法の詳細な即興バージョンを提示します¹⁰。この戦略は、植物の根生物学における現在の需要に合わせて調整されており、モデル植物以外のアルファルファのような植物にも使用できます。プロトコルは、RSAの変化を測定するための主要な方法であり、必要なのは単純な機器だけです。本プロトコルは、正常および改変培地(Pi欠損)において一次根および側根などのいくつかの根の特徴を表現型化する方法を示す。著者の経験から収集された段階的な指示やその他の役立つヒントは、研究者がこの方法で提供される方法論に従うのを助けるために提供されます。本研究は、高次LRを含む植物の根系全体を簡便かつ効果的に明らかにする手法を提供することを目的とする。この方法では、丸い水彩アートブラシを使用して根系を手動で広げ、根の露出を正確に制御できます1,10,11,12。高価な機器や複雑なソフトウェアは必要ありません。この方法は、栄養素の取り込みと成長率を改善しました。植物は根に吸収されやすい栄養豊富な溶液を持っています。この方法は、特に発育初期(発芽後10〜15日)に、植物の根系の形質を詳細にマッピングしたい研究者に適しています。小さな根系、シロイヌナズナやタバコなどのモデル植物、アルファルファなどの非従来型植物に、根系がマゼンタの箱に収まるまで適しています。

シロイヌナズナにおけるRSA発生の表現型分析のステップは、このプロトコルで次のように概説されています:(1)植物の種子表面滅菌の方法(シロイヌナズナ)、(2)水耕システムをセットアップするステップ、続いて培地に種子を播種するステップ、(3)RSA分析のために完全な播種を取り出してペトリプレート上に広げる手順、 (4)RSA用の画像を記録する方法、および(5)ImageJソフトウェアを使用して重要なRSAパラメータを計算する方法。

プロトコル

プロトコル全体を 図1に概略的に要約し、プラントレットのルートシステムアーキテクチャ(RSA)を明らかにするために必要なすべての重要なステップを示しています。プロトコルの手順を以下に詳しく説明します。

1.シロイヌナズナ種子表面殺菌

1. 種子の小さなスクープ(約100種子=約2.5 mg)を微量遠心チューブに移し、室温(RT)の蒸留水に30分間浸します。この手順全体は無菌状態で実行されます。
2. 種子を含む微量遠心チューブを500 x g で5秒間短時間遠心分離し、RTの卓上遠心分離機を使用して種子を落ち着かせます。
3. 水をデカントし、700 μLの70%(v / v)エタノールを加え、数秒間ボルテックスし、回転させます。必要に応じてボルテックスとスピニングを繰り返しますが、70%エタノールの処理時間が3分のままであることを確認してください。
4. 3分後、直ちに滅菌水で一度すすいでください。長時間のエタノール曝露は発芽を減少させるので、エタノール洗浄ステップをできるだけタイムリーに保ってください。
5. 種子を希釈した市販の漂白剤(4%v / v)でTween-20を7分間滴下して処理します。チューブを8〜12回急速に反転させて種子を漂白剤溶液と混合し、続いて短時間遠心分離機(RTで5秒間500 x g )を行います。チューブに泡が現れているのが見られます。
6. 1 mLピペットを使用して上清をデカントし、同じボルテックス手順に従って、滅菌水で少なくとも5回の洗浄で種子を洗い流します。
7. 表面滅菌した種子を水中に放置し、成層¹⁰のために4°Cで2〜3日間インキュベートします。

2.種子発芽のための水耕栽培システムの設定

1. 標準のマゼンタの箱に蒸留水を半分入れ、オートクレーブします。ポリカーボネートシート(透明な色と滑らかな質感)をオートクレーブし、4cm×8cmの長方形を切り取り、2つの長方形が一緒にスロットしてX字形¹⁰を形成することができるように、長方形の半分以上中点に切り欠きを入れます。このセットアップを使用して、12x 24インチシート¹⁰から切り取ったポリプロピレンメッシュ(250 μmの孔径の6 cm x 6 cm正方形、または要件に応じて)を保持します。
   注意: ポリプロピレンは酸、アルカリ、およびその他の化学物質に対して非常に耐性があります。したがって、それは選択されています。オートクレーブはポリプロピレンメッシュを歪める傾向があります。したがって、アルミホイルで包んで別々に運ぶことをお勧めします。16分、121°C、15psi、または775mmHgの標準的なオートクレーブ条件が推奨されます。
2. Shuklaら1で説明されているように、ビタミン+ ^1.5%(w / v)スクロースを含む滅菌ハーフMS基礎培地を各ボックスに追加して、層流でポリプロピレンメッシュの下端に到達します。全ての手順は無菌条件下で行われる。
3. 表面滅菌した種子をメッシュ(孔径250μm)に水耕栽培で播種し、3日間生育させます。
4. 3日後、苗をメッシュ(500μmの孔径)に移し、2日間成長させます。
5. 2日後(合計5日後)、苗を対照培地(すなわち、2.0 mM NH4 NO 3、1.9 mM KNO₃、0.15 mM MgSO4・7H₂O、0.1 mM MnSO4・Oを含有する改変MS栄養培地¹)に移し替える。_H2O、3.0μM ZnSO4·7H 2O、0.1 μM CuSO 4·5H 2 O、0.3 mM CaCl 2·2H 2 O、5.0 μM KI、0.1 μM CoCl 2·6H 2 O、0.1 mM FeSO 4·7H 2 O、0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O、_1.25mM KH ₂PO ₄、100 μM H 3 BO₃、 1 μM Na2_MoO4·2H₂O、1.5%スクロース、1.25 mM MES、0.1 M MES [pH 6.1]で調整したpH 5.7)および実験培地(例えば、P-[0 mM]処理;KH2PO4は、上記¹のような対照培地組成物由来の0.62mM_K2SO4に置き換えられる。過剰なPi処理の場合、KH 2 PO₄の濃度を修飾MS培地[_2.5、5.0、10.0、20.0 mM]¹)で増加させ、種子を7日間成長させます。
   注:メッシュの孔径(500 μm)が大きいため、胚軸での損傷や切断を必要とせずに、苗全体をスムーズに摘み取りやすくなります。植物は、23°Cで標準的な成長条件(すなわち、16時間の明周期/8時間の暗日長、150μmol・^m-2・s-1光強度、60%^- 70%湿度)で成長します。

3. RSAの審査

1. 根の広がりのために寒天(1.1%)プレートを準備します(ペトリプレートサイズ:150 mm x 15 mm)。
2. 上記のように、オートクレーブ滅菌したろ過した水道水を10〜20 mLのペトリプレートに追加します。メッシュ(500 μm)から苗をそっと引き出し、プレート上の水に浸します。
3. 丸い水彩画のアートブラシ(サイズ:14、16、18、20番)を使用して、水で満たされたプレートに各小植物の根をそっと広げます。
   注:根系の拡散を実行している間、最初に一次根をつかみ、それが軸として機能するので、それを直線に広げます。次に、可能な限り、LRを一次根の両側に対称的に広げます。その後、1次LRにリンクされた2次LRを広げます。この拡散プロセスは一種の芸術です。RSAのイメージを描くアーティストのように、ゆっくりとゆっくりと行います。
4. プレートを少し傾けて水を取り除きます。
   注:この時点で、これらのスプレッドプレートを4°Cに置くことで手順を一時停止できます。 後で画像処理が必要になったら、プレートを取り出し、しばらくRTに置きます。凝縮した水を拭き取ると、画像を便利に処理できます。

4. RSA用の画像記録

1. これらのペトリプレートを適切にスキャンまたは撮影します。
   注意: 高品質の写真を取得するには、スキャンには600 dpiの解像度が推奨され、写真撮影には少なくとも12メガピクセルのカメラが推奨されます。
2. 無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して、ルートシステムのアーキテクチャ特性を測定します(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)。ImageJソフトウェアを使用して根の長さを測定する手順をすばやく実行するには、「DNA輪郭長の測定」¹⁷の例を参照してください。
   注意: 高解像度スキャナーまたはカメラを使用してキャプチャされた画像のルートの長さを測定するには、次の手順に従います。
   1. 指定された長さの距離を使用して、スケールを設定します。 図3 のスケールバーの既知の距離は2cmです。ImageJ ツールバーから 直線 ツールを選択します (左から 5 番目のツール)。 直線 ツールを使用して、縮尺記号の輪郭を描く線の選択範囲を作成します。アウトラインを完了したら、右クリック、ダブルクリック、または先頭のボックス内をクリックします。
   2. 既知の縮尺記号の長さをピクセル単位で計測するには 、[解析] ツールバー> [計測] ツールバーを使用します。ピクセルの長さをメモします。
   3. [解析] タブの [縮尺の設定] タブをクリックして、[縮尺の設定] ダイアログ ボックスを開きます。[ピクセル単位の距離] フィールドに、ピクセルの長さを入力します (上記のとおり)。次に、[既知の距離]フィールドに、縮尺記号で示されている値を入力します(ここでは20 mmです)。[長さの単位] を mm に設定します。ピクセル縦横比は 1.0 です。これで、スケールはミリメートルあたりのxピクセル数で指定されます。この特定の画像のスケールをロックするには、[OK]をクリックします。
   4. [セグメント化されたライン] ツールを使用して、ルートの長さの輪郭を描くライン選択を作成します。アウトラインを完了したら、右クリック、ダブルクリック、または先頭のボックス内をクリックします。アウトラインに沿って小さな白黒の「ハンドル」をクリックしてドラッグし、必要に応じて線の選択を調整します。
   5. ImageJ の [解析] タブにある [計測] コマンドを使用して、ルートの長さを定量化します。測定データをスプレッドシートに転送するには、[結果]ウィンドウを右クリックし、ポップアップメニューから[すべてコピー]を選択し、スプレッドシートに切り替えてデータを貼り付けます。
      注: 上記のように、ImageJ の [縮尺を設定] オプションで縮尺記号の既知の距離を使用して縮尺を設定します。これにより、単位長さあたりのピクセル数が得られます。新しい画像が分析されるたびに、スケールを新たに設定する必要があります。
3. RSA特性の測定と計算
   1. 胚軸接合部から根の先端までの一次根の長さを測定します。
   2. 1次および2次のLR長を測定します。
   3. 一次根の分岐ゾーン(BZ)を測定します。1 次ルート (BZ^PR) の分岐ゾーンは、最初の LR 出現点から最後の LR 出現点まで広がっています。
   4. BZ^PR の境界内で発生する LR の数である LR の数を記録します。
   5. 1°LRの全長を1°LRの総数で割ることにより、1次LRの平均長さ(1°LR)(根当たりセンチメートル)を導き出します。
   6. 2次LRの平均長さを測定します。2°LRの全長を2°LRの総数で割って、2次LR(2°LR)の平均長さを計算します。
   7. 1°LR密度を測定します。1°LRの数をBZ PRの長さで割ることにより、1°LR密度(BZ^PRの単位長さあたりの1°LRの数)を計算します。
   8. 2°LR密度を測定します。2°LRの数を1°LRのBZの長さで割って、2°LR密度を計算します(1°側根のBZの単位長さあたりの2°LRの数)。
   9. 合計ルート長 (TRL) を測定します。これは、一次根、1°LR、および2°LR(存在する場合はそれ以上)の長さの合計です。

5.根毛測定

注:水耕栽培システムは根毛の成長と発達を促進するのに適していませんが、固体の成長培地と同じくらい堅牢であるにもかかわらず、現在の文脈でそれを研究することは依然として重要です。以下の手順に従って、苗の一次根の先端から5mmの切片で根毛の発達を分析します。

1. 根の先端から一次根の2 cmの部分を切り取ります。
2. 根元部分をスライドにマウントし、10%グリセロールを封入剤として使用します。
3. スライドを実体顕微鏡の下に置きます。
4. 軸方向キャリアを使用して、根毛の画像を視覚化およびキャプチャします。
5. 前述のように、ImageJソフトウェアを使用して画像を分析して根毛の構造と特性を調べます。

結果

ルートシステムアーキテクチャ(RSA)のさまざまな形態測定特性は、簡単な実験ツールを使用して測定され、その手順は 図1に概略的に示されています。水耕栽培のセットアップの詳細は、RSAの測定におけるプロトコルの可能性を示しています(図1 および 図2)。

ゲル化剤の観察された違いを考慮して、水耕?...

ディスカッション

この作業では、シンプルな実験装置を使用したRSAのマッピングを実証しました。この方法を使用して、表現型の変化が洗練されたレベルで記録されます。この戦略の利点は、シュート部分がメディアと接触することがないため、小植物の表現型がオリジナルであることです。この方法では、プロトコルに記載されているように、水耕栽培システムを設定して小植物を栽培します。次に、各苗?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)