Bitki kök sistemi mimari özelliklerini haritalamak için basit bir protokol

Özet

Arabidopsis ve Medicago'nun kök sistem mimarisini (RSA) incelemek için basit laboratuvar araçları kullanıyoruz. Fideler ağ üzerinde hidroponik olarak yetiştirilir ve RSA'yı ortaya çıkarmak için bir sanat fırçası kullanılarak yayılır. Görüntüler tarama veya yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanılarak alınır, daha sonra özellikleri haritalamak için ImageJ ile analiz edilir.

Özet

Bitki kök sistemi mimarisi (RSA) geliştirme hakkında kapsamlı bilgi, besin kullanım verimliliğini artırmak ve mahsul çeşidinin çevresel zorluklara karşı toleransını artırmak için kritik öneme sahiptir. Hidroponik sistemin kurulması, plantlet büyümesi, RSA yayılımı ve görüntüleme için deneysel bir protokol sunulmaktadır. Yaklaşım, polikarbonat kamalarla desteklenen polipropilen ağ içeren macenta kutu tabanlı bir hidroponik sistem kullandı. Deneysel ortamlar, çeşitli besin (fosfat [Pi]) kaynağı altında plantletlerin RSA'sının değerlendirilmesiyle örneklendirilmiştir. Sistem, Arabidopsis'in RSA'sını incelemek için kuruldu, ancak Medicago sativa (Yonca) gibi diğer bitkileri incelemek için kolayca uyarlanabilir. Arabidopsis thaliana (Col-0) plantletleri bu araştırmada RSA bitkisini anlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Tohumlar, etanol ve seyreltilmiş ticari ağartıcı muamelesi yapılarak yüzey sterilize edilir ve tabakalaşma için 4 ° C'de tutulur. Tohumlar çimlenir ve polikarbonat kamalarla desteklenen bir polipropilen ağ üzerinde sıvı bir yarım MS ortamında yetiştirilir. Fideletler, istenen sayıda gün boyunca standart büyüme koşulları altında yetiştirilir, ağdan yavaşça toplanır ve su içeren agar plakalarına batırılır. Plantletlerin her kök sistemi, yuvarlak bir sanat fırçası yardımıyla su dolu plakaya yavaşça yayılır. Bu Petri plakaları, RSA özelliklerini belgelemek için yüksek çözünürlükte fotoğraflanır veya taranır. Birincil kök, yanal kökler ve dallanma bölgesi gibi kök özellikleri, serbestçe kullanılabilen ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülür. Bu çalışma, kontrollü çevresel ortamlarda bitki kök özelliklerini ölçmek için teknikler sunmaktadır. (1) bitki yavrularının nasıl yetiştirileceğini ve kök örneklerinin nasıl toplanacağını ve yayılacağını, (2) yayılmış RSA örneklerinin resimlerini nasıl elde edeceğinizi, (3) görüntüleri nasıl yakalayacağımızı ve (4) kök özniteliklerini ölçmek için görüntü analiz yazılımının nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Mevcut yöntemin avantajı, RSA özelliklerinin çok yönlü, kolay ve verimli bir şekilde ölçülmesidir.

Giriş

Yeraltında bulunan kök sistem mimarisi (RSA), bitki büyümesi ve verimliliği için hayati bir organdır ^1,2,3. Embriyonik aşamadan sonra, bitkiler en önemli morfolojik değişikliklerine uğrarlar. Köklerin toprakta yetişme şekli, bitki parçalarının toprak üzerindeki büyümesini büyük ölçüde etkiler. Kök büyümesi çimlenmede ilk adımdır. Mevcut farklı besin maddelerine benzersiz bir şekilde yanıt verdiği için bilgilendirici bir özelliktir 1,2,3,4. RSA, yüksek derecede gelişimsel plastisite sergiler, bu da çevrenin her zaman gelişim ^2,5 hakkında karar vermek için kullanıldığı anlamına gelir. Çevredeki değişiklikler, mevcut senaryoda mahsul üretimini daha da zorlaştırmıştır. RSA, çevresel sinyalleri gelişimsel seçimlere sürekli olarak dahil eder⁵. Sonuç olarak, kök gelişiminin ardındaki ilkelerin tam olarak anlaşılması, bitkilerin değişen ortamlara nasıl tepki verdiğini öğrenmek için gereklidir ^2,5.

RSA, değişen besin konsantrasyonlarını algılar ve fenotipik değişiklikleri 4,6,7,8,9,10,11,12 yapar. Çalışmalar, kök morfolojisinin / RSA'nın sürgün morfolojisine kıyasla oldukça plastik olduğunu göstermektedir ^1,3. RSA özellik haritalaması, çevredeki toprak ortamını değiştirmenin etkisini kaydetmede oldukça etkilidir ^1,11,12.

Genel olarak, çeşitli besin eksikliklerinin kök fenotipi üzerindeki etkisindeki tutarsızlıklar daha önceki birçok çalışmada bildirilmiştir 3,11,13,14,15. Örneğin, yanal köklerin (LR'ler) sayısında, uzunluğunda ve yoğunluğunda fosfat (Pi) açlığına bağlı değişiklikler hakkında birkaç zıt rapor vardır. Pi eksikliği durumu ^6,8 altında LR yoğunluğunda bir artış bildirilmiştir. Buna karşılık, Pi eksikliği koşulları altında LR yoğunluğunda bir azalma diğer yazarlar tarafından da bildirilmiştir ^3,13,16. Bu tutarsızlıkların öne çıkan nedenlerinden biri, agarın sıklıkla¹⁰ içerdiği elementel kontaminasyona eğilimli jelleşme ortamının kullanılmasıdır. Araştırmacılar tipik olarak deneysel bitkilerini agar bazlı bir plaka sistemi üzerinde yetiştirir ve kök özelliklerini kaydeder. Çok sayıda RSA özelliği sıklıkla agar materyali içinde gizlenir veya yerleşir ve belgelenemez. Kullanıcıların genellikle bir bileşeni ortamdan tamamen dışladığı besin eksikliğini indüklemeyle bağlantılı deneyler, elementel kontaminasyona eğilimli jelleşme ortamı^11,14,15'te gerçekleştirilemez. Agar ortamında, P, Zn, Fe ve daha birçok^11,14,15 dahil olmak üzere çok sayıda besin maddesi sıklıkla önemli miktarlarda bulunur. Ayrıca, RSA büyümesi agar bazlı ortamlarda, agar bazlı olmayan sıvı ortama göre daha yavaştır. Sonuç olarak, RSA'nın fenotipini ölçmek ve nitel olarak kaydetmek için alternatif bir agar tabanlı olmayan yaklaşım oluşturmaya ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, plantletlerin polikarbonat kamalar ^1,10,11 ile desteklenen bir polipropilen ağın üzerinde macenta kutu bazlı bir hidroponik sistemde yetiştirildiği mevcut yöntem geliştirilmiştir.

Bu çalışma, Jain ve ^ark.10 tarafından açıklanan daha önceki yöntemin ayrıntılı bir doğaçlama versiyonunu sunmaktadır. Bu strateji, bitki kök biyolojisindeki mevcut talepler için ayarlanmıştır ve model bitkiler dışındaki Yonca gibi bitkiler için de kullanılabilir. Protokol, RSA'daki değişiklikleri ölçmenin birincil yoludur ve yalnızca basit ekipman gerektirir. Mevcut protokol, normal ve modifiye edilmiş ortamda (Pi eksikliği) birincil ve lateral kökler gibi çeşitli kök özelliklerinin nasıl fenotiplendirileceğini göstermektedir. Yazarın deneyimlerinden toplanan adım adım talimatlar ve diğer yararlı ipuçları, araştırmacıların bu yöntemde sunulan metodolojilerle birlikte takip etmelerine yardımcı olmak için sağlanmıştır. Bu çalışma, yüksek dereceli LR'ler de dahil olmak üzere bitkilerin tüm kök sistemini ortaya çıkarmak için basit ve etkili bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, kök sisteminin yuvarlak bir suluboya sanat fırçası ile manuel olarak yayılmasını içerir^ve köklerin maruz kalması üzerinde hassas kontrol sağlar 1,10,11,12. Pahalı ekipman veya karmaşık yazılım gerektirmez. Bu yöntem, besin alımını ve büyüme oranını iyileştirmiştir; Bitkiler, kökleri tarafından kolayca emilen besin açısından zengin bir çözeltiye sahiptir. Mevcut yöntem, bir bitkinin kök sisteminin özelliklerini, özellikle erken gelişim sırasında (çimlenmeden 10-15 gün sonra) ayrıntılı olarak haritalamak isteyen araştırmacılar için uygundur. Küçük kök sistemleri, Arabidopsis ve tütün gibi model bitkiler ve kök sistemleri macenta kutularına sığana kadar Yonca gibi geleneksel olmayan bitkiler için uygundur.

Arabidopsis'te RSA gelişiminin fenotipik analizi için adımlar bu protokolde şu şekilde özetlenmiştir: (1) bitkiler için tohum yüzeyi sterilizasyonu yöntemi (Arabidopsis), (2) hidroponik sistemi kurma adımları, ardından bir ortamda tohum ekimi, (3) tüm tohumların çıkarılması ve RSA analizi için Petri plakasına yayılması prosedürü, (4) RSA için görüntülerin nasıl kaydedileceği ve (5) ImageJ yazılımını kullanarak önemli RSA parametrelerinin hesaplanması.

Protokol

Tüm protokol, Şekil 1'de şematik olarak özetlenmiştir ve plantletlerin kök sistem mimarisini (RSA) ortaya çıkarmada yer alan tüm temel adımları göstermektedir. Protokol adımları aşağıda ayrıntılı olarak verilmiştir:

1. Arabidopsis tohum yüzeyi sterilizasyonu

1. Küçük bir kepçe (yaklaşık 100 tohum = yaklaşık 2.5 mg) tohumu bir mikrofüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında (RT) damıtılmış suda 30 dakika bekletin. Tüm bu prosedür aseptik durumda gerçekleştirilir.
2. Tohum içeren mikrofüj tüpünü 500 x g'de 5 saniye boyunca kısaca santrifüjleyin, tohumların yerleşmesini sağlamak için RT'deki herhangi bir masa üstü santrifüjü kullanın.
3. Suyu boşaltın, 700 μL% 70 (v / v) etanol ekleyin, birkaç saniye vorteks yapın ve döndürün. Gerekirse vorteks ve eğirmeyi tekrarlayın, ancak% 70 etanolün tedavi süresinin 3 dakikada kalmasını sağlayın.
4. 3 dakika sonra, hemen steril suyla bir kez durulayın. Etanol yıkama adımını mümkün olduğunca zamanında tutun, çünkü uzun süreli etanol maruziyeti çimlenmeyi azaltır.
5. Tohumlara seyreltilmiş ticari ağartıcı (% 4 v / v) ile 7 dakika boyunca bir damla Ara-20 ile muamele edin. Tüpleri 8-12 kez hızlı bir şekilde ters çevirerek tohumları ağartıcı çözelti ile karıştırın, ardından kısa bir santrifüj (RT'de 5 s için 500 x g ). Tüpte köpük görülür.
6. 1 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı boşaltın ve aynı vorteks prosedürünü izleyerek tohumları steril suyla en az beş yıkama ile durulayın.
7. Yüzey sterilize edilmiş tohumları suda bırakın ve tabakalaşma¹⁰ için 4 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.

2. Tohum çimlenmesi için hidroponik bir sistem kurulması

1. Standart bir macenta kutusunu damıtılmış suyla doldurun ve otoklavlayın. Polikarbonat levhayı otoklavlayın (net renk ve pürüzsüz doku) ve 4 cm x 8 cm dikdörtgenleri, dikdörtgenin yarısından fazlasına kadar çentikli bir orta nokta ile kesin, böylece iki dikdörtgen bir X şekli¹⁰ oluşturmak için birlikte yuvalanabilir. 12x 24 inç levhalardan kesilmiş polipropilen ağı (250 μm gözenek boyutunda 6 cm x 6 cm kareler veya gereksinime bağlı olarak) tutmak için bu kurulumu kullanın¹⁰.
   NOT: Polipropilen asitlere, alkalilere ve diğer kimyasallara karşı oldukça dirençlidir; bu nedenle tercih edilmiştir. Otoklavlama, polipropilen ağı bozma eğilimindedir; Bu nedenle, alüminyum folyoya sarılmış olarak ayrı ayrı taşınması önerilir. 16 dakika, 121 °C, 15 psi veya 775 mm Hg'lik tipik otoklavlama koşulları önerilir.
2. Shukla ve ark.1 tarafından tarif edildiği gibi, laminer bir akışta polipropilen ağın alt kenarına ulaşmak için her kutuya vitamin +% ^1.5 (w / v) sakkaroz içeren steril yarı MS bazal ortam ekleyin. Tüm prosedürler aseptik koşullar altında gerçekleştirilir.
3. Yüzeyle sterilize edilmiş tohumları ağ üzerine (250 μm gözenek boyutu) hidroponik olarak ekin ve 3 gün boyunca büyümelerini sağlayın.
4. 3 gün sonra, fideleri bir ağa (500 μm gözenek boyutu) aktarın ve 2 gün boyunca büyümelerini sağlayın.
5. 2 gün sonra (toplam 5 gün), fideleri kontrol ortamına aktarın (yani, 2.0 mM NH 4 NO 3, 1.9 mM KNO₃, 0.15 mM MgSO 4 · 7H₂O, 0.1 mM MnSO₄ · içeren modifiye MS besin maddesi¹ Y 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH ₂PO ₄, 100 μM H 3 BO₃, 1 μM Na 2 MoO₄·2H₂O, %1,5 sakaroz, 1,25 mM MES, pH 5,7 0,1 M MES [pH 6,1]) ile ayarlanmıştır) ve deneysel ortama (örneğin, P- [0 mM] tedavisi; KH2 PO 4, yukarıda^1'de belirtildiği gibi kontrol ortamı bileşiminden 0,62 mM K₂SO₄ ile değiştirilir. Aşırı Pi tedavileri için, modifiye MS ortamında [2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]¹) KH₂PO₄ konsantrasyonu arttırılır ve tohumların 7 gün boyunca büyümesine izin verilir.
   NOT: Daha büyük bir ağ gözenek boyutu (500 μm), hipokotilde herhangi bir hasar veya kesme ihtiyacı olmadan tüm fidelerin düzgün bir şekilde toplanmasını kolaylaştırır. Fidancıklar 23 ° C'de standart büyüme koşulları altında (yani, 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyot, 150 μmol · m -2 · ^s-1 ışık yoğunluğu,% 60 ^-% 70 nem) büyür.

3. RSA'nın incelenmesi

1. Kök yayılması için agar (% 1.1) plakaları hazırlayın (Petri plaka boyutu: 150 mm x 15 mm).
2. Yukarıda belirtildiği gibi Petri plakasına 10-20 mL otoklavlanmış filtrelenmiş musluk suyu ekleyin. Fideleri ağdan (500 μm) yavaşça çekin ve plakalardaki suya batırın.
3. Her bir plantletin kökünü yuvarlak bir suluboya sanat fırçası yardımıyla su dolu plakaya nazikçe yayın (boyutlar: no. 14, 16, 18 ve 20).
   NOT: Kök sisteminin yayılmasını gerçekleştirirken, önce birincil kökü tutun ve bir eksen görevi gördüğü için düz bir çizgiye yayın. Ardından, LR'leri mümkün olan her yerde, birincil kökün her iki tarafına simetrik olarak yayın. Bundan sonra, birinci dereceden LR'a bağlı ikinci dereceden LR'yi yayın. Bu yayılma süreci bir tür sanattır; RSA'nın resmini çizen bir sanatçı gibi nazikçe, yavaşça yapın.
4. Suyu çıkarmak için plakayı hafifçe eğin.
   NOT: Bu noktada, bu yayılma plakaları 4 ° C'ye koyarak prosedür duraklatılabilir. Daha sonra, görüntü işleme gerektiğinde, plakaları çıkarın ve bir süre RT'ye yerleştirin. Yoğunlaştırılmış suyu silin ve ardından görüntü rahatça işlenebilir.

4. RSA için görüntü kaydetme

1. Bu Petri plakalarını uygun şekilde tarayın veya fotoğraflayın.
   NOT: Yüksek kaliteli fotoğraflar elde etmek için, tarama için 600 dpi çözünürlük önerilir ve fotoğrafçılık için en az 12 megapiksel kamera önerilir.
2. Ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) kullanarak kök sistem mimarisi özelliklerini ölçün. ImageJ yazılımını kullanarak kök uzunluğunu ölçme adımlarını hızlı bir şekilde takip etmek için lütfen "DNA kontur uzunluğunu ölçme"¹⁷ örneğine bakın.
   NOT: Bu adımlar, yüksek çözünürlüklü bir tarayıcı veya kamera kullanılarak çekilen resimlerdeki kök uzunluklarını ölçmek için izlenir.
   1. Ölçeği ayarlamak için belirli bir uzunluk mesafesini kullanın. Şekil 3'teki ölçek çubuğunun bilinen mesafesi 2 cm'dir. ImageJ araç çubuğundan Düz Çizgi aracını seçin (soldan beşinci araç). Ölçek çubuğunun ana hatlarını çizen bir çizgi seçimi oluşturmak için Düz Çizgi aracını kullanın. Sağ tıklatarak, çift tıklatarak veya başlangıçtaki kutuyu tıklatarak anahat oluşturmayı bitirin.
   2. Analiz > Ölçü araç çubuğunu kullanarak bilinen ölçek çubuğunun uzunluğunu piksel cinsinden ölçün. Piksel uzunluğunu not edin.
   3. Analiz sekmesindeki Ölçeği Ayarla sekmesini tıklatarak Ölçeği Ayarla iletişim kutusunu açın. Piksel Cinsinden Uzaklık alanına piksel uzunluğunu girin (yukarıda belirtildiği gibi). Ardından, Bilinen Mesafe alanına, ölçek çubuğunda gösterildiği gibi değeri girin (burada 20 mm'dir). Uzunluk Birimi'ni mm olarak ayarlayın. Piksel-en boy oranı 1.0'dır. Şimdi, ölçek milimetre başına x piksel sayısı ile belirtilir. Bu belirli görüntünün ölçeğini kilitlemek için Tamam'a tıklayın.
   4. Segmentlere Ayrılmış Çizgi aracını kullanarak kök uzunluğunu özetleyen bir çizgi seçimi oluşturun. Sağ tıklatarak, çift tıklatarak veya başlangıçtaki kutuyu tıklatarak anahat oluşturmayı bitirin. Satır seçimini gerektiği gibi ayarlamak için anahat boyunca küçük siyah beyaz "tutamaçları" tıklayıp sürükleyin.
   5. Kökün uzunluğunu ölçmek için ImageJ'nin Analiz sekmesi altındaki Measure komutunu kullanın. Ölçülen verileri bir e-tabloya aktarmak için Sonuçlar penceresini sağ tıklayın, açılır menüden Tümünü Kopyala'yı seçin, e-tabloya geçin ve ardından verileri yapıştırın.
      NOT: Yukarıda açıklandığı gibi, ImageJ ölçek kümesi seçeneğindeki ölçek çubuğunun bilinen mesafesini kullanarak ölçeği ayarlayın. Bu, birim uzunluk başına piksel sayısını verir. Her defasında, yeni bir görüntü analiz edildiğinde ölçeğin yeni olarak ayarlanması gerekir.
3. RSA özelliklerinin ölçülmesi ve hesaplanması
   1. Hipokotil bileşke ile kök ucunun ucu arasındaki birincil kök uzunluğunu ölçün.
   2. Birinci ve ikinci dereceden LR uzunluğunu ölçün.
   3. Birincil kökün dallanma bölgesini (BZ) ölçün. Birincil kökün dallanma bölgesi (BZ^{PR), ilk LR} çıkış noktasından son LR ortaya çıkan noktasına kadar uzanır.
   4. BZ^PR sınırları içinde ortaya çıkan LR'lerin sayısı olan LR sayısını kaydedin.
   5. Birinci ve yüksek dereceden LR'lerin ortalama uzunluğunu ölçün. 1° LR'nin toplam uzunluğunu toplam 1° LR sayısına bölerek birinci dereceden LR'nin (1° LR) (kök başına santimetre) ortalama uzunluğunu elde edin.
   6. İkinci dereceden LR'ın ortalama uzunluğunu ölçün. 2° LR'nin toplam uzunluğunu toplam 2° LR sayısına bölerek ikinci dereceden LR'nin (2° LR) ortalama uzunluğunu hesaplayın.
   7. 1° LR yoğunluğunu ölçün. 1° LR sayısını BZ^PR uzunluğuna bölerek 1° LR yoğunluğunu (BZ^PR'nin birim uzunluğu başına 1° LR sayısı) hesaplayın.
   8. 2° LR yoğunluğunu ölçün. 2° LR sayısını 1° LR'lerin BZ'sinin uzunluğuna bölerek 2° LR yoğunluğunu hesaplayın (1° yanal köklerin BZ'sinin birim uzunluğu başına 2° LR sayısı).
   9. Toplam kök uzunluğunu (TRL) ölçün. Bu, birincil kök, 1° LR ve 2° LR (ve varsa daha fazlası) uzunluklarının toplamıdır.

5. Kök kılı ölçümü

NOT: Hidroponik sistem, kök kıllarının büyümesini ve gelişimini teşvik etmede iyi olmasa da, katı büyüme ortamında olduğu kadar sağlam olmasına rağmen, mevcut bağlamda incelenmesi hala önemlidir. Fidelerin birincil kökünün ucundan 5 mm'lik bir bölümde kök kılı gelişimini analiz etmek için aşağıdaki adımları izleyin.

1. Birincil kökün 2 cm'lik bir bölümünü kök ucundan kesin.
2. Kök bölümünü, montaj ortamı olarak% 10 gliserol kullanarak bir slayt üzerine monte edin.
3. Slaytı stereo mikroskop altına yerleştirin.
4. Kök kıllarının görüntülerini görselleştirmek ve yakalamak için eksenel taşıyıcıyı kullanın.
5. Daha önce açıklandığı gibi ImageJ yazılımını kullanarak kök kılların yapısını ve özelliklerini incelemek için görüntüleri analiz edin.

Sonuçlar

Kök sistem mimarisinin (RSA) farklı morfometrik özellikleri basit laboratuvar araçları kullanılarak ölçülür ve adımlar Şekil 1'de şematik olarak gösterilmiştir. Hidroponik kurulumun ayrıntıları, protokolün RSA'yı ölçmedeki potansiyelini göstermektedir (Şekil 1 ve Şekil 2).

Jelleştirici ajanlarda gözlenen farklılıklar göz önüne alındığında, tüm çalışmaları yürütme...

Tartışmalar

Bu çalışma, RSA'nın basit laboratuvar ekipmanlarını kullanarak haritalandırıldığını göstermiştir. Bu yöntemi kullanarak, fenotipik değişiklikler rafine seviyede kaydedilir. Bu stratejinin yararı, sürgün kısmının asla medya ile temas etmemesidir, bu nedenle plantletlerin fenotipi orijinaldir. Bu yöntem, protokolde açıklandığı gibi plantlet yetiştirmek için bir hidroponik sistem kurmayı içerir. Daha sonra, her plantlet bozulmadan çıkarılır ve agar dolu bir Petri plakasına yerleştirili...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)