플랜트 루트 시스템 아키텍처 특성을 매핑하기 위한 간단한 프로토콜

요약

우리는 간단한 실험실 도구를 사용하여 Arabidopsis 및 Medicago의 루트 시스템 아키텍처 (RSA)를 검사합니다. 묘목은 메쉬 위에 수경 재배되고 아트 브러시를 사용하여 RSA를 드러냅니다. 스캐닝 또는 고해상도 카메라를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 ImageJ로 분석하여 특성을 매핑합니다.

초록

식물 뿌리 시스템 아키텍처(RSA) 개발에 대한 포괄적인 지식은 영양소 사용 효율성을 개선하고 환경 문제에 대한 작물 재배 내성을 높이는 데 매우 중요합니다. 수경 재배 시스템, 묘목 성장, RSA 확산 및 이미징을 설정하기 위한 실험 프로토콜이 제시됩니다. 이 접근법은 폴리 카보네이트 쐐기로 지지되는 폴리프로필렌 메쉬를 포함하는 마젠타 상자 기반 수경 재배 시스템을 사용했습니다. 실험 설정은 다양한 영양소(인산염[Pi]) 공급 하에서 묘목의 RSA를 평가하여 예시됩니다. 이 시스템은 애기장대의 RSA를 조사하기 위해 설립되었지만 Medicago sativa (알팔파)와 같은 다른 식물을 연구하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 애기장대( Col-0) 묘목은 식물 RSA를 이해하기 위한 예로 이 조사에서 사용됩니다. 종자는 에탄올 및 희석된 상업용 표백제를 처리하여 표면 멸균하고, 성층화를 위해 4°C에서 보관한다. 종자는 발아되어 폴리 카보네이트 쐐기로 지지되는 폴리프로필렌 메쉬의 액체 하프 MS 배지에서 자랍니다. 묘목은 원하는 일 수 동안 표준 성장 조건에서 재배되고 메쉬에서 부드럽게 골라내어 물이 함유 된 한천 플레이트에 담근다. 묘목의 각 뿌리 계통은 둥근 아트 브러시를 사용하여 물이 채워진 판에 부드럽게 펼쳐집니다. 이 페트리 플레이트는 RSA 특성을 문서화하기 위해 고해상도로 촬영하거나 스캔합니다. 1차 뿌리, 측면 뿌리 및 분기 영역과 같은 뿌리 특성은 무료로 제공되는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다. 이 연구는 통제된 환경 환경에서 식물 뿌리 특성을 측정하는 기술을 제공합니다. (1) 묘목을 재배하고, 뿌리 샘플을 수집 및 퍼뜨리고, (2) 퍼진 RSA 샘플의 사진을 얻고, (3) 이미지를 캡처하고, (4) 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 뿌리 속성을 정량화하는 방법에 대해 논의합니다. 본 방법의 장점은 RSA 형질의 다양하고 쉽고 효율적인 측정입니다.

서문

지하에 있는 루트 시스템 아키텍처(RSA)는 식물 성장과 생산성 ^1,2,3을 위한 중요한 기관입니다. 배아 단계 후에 식물은 가장 중요한 형태 학적 변화를 겪습니다. 뿌리가 토양에서 자라는 방식은 땅 위의 식물 부분의 성장에 큰 영향을 미칩니다. 뿌리 성장은 발아의 첫 번째 단계입니다. 그것은 다른 이용 가능한 영양소 1,2,3,4에 독특하게 반응하기 때문에 유익한 특성입니다. RSA는 높은 수준의 발달 가소성을 나타내며, 이는 환경이 항상 개발 ^2,5에 대한 결정을 내리는 데 사용된다는 것을 의미합니다. 환경의 변화로 인해 현재 시나리오에서 작물 생산이 더욱 어려워졌습니다. RSA는 지속적으로 환경 신호를 개발 선택에 통합합니다⁵. 결과적으로 뿌리 발달의 원리에 대한 철저한 이해는 식물이 변화하는 환경에 어떻게 반응하는지 배우는 데 필수적입니다 ^2,5.

RSA는 다양한 영양소 농도를 감지하고 표현형 변화를 4,6,7,8,9,10,11,12로 만듭니다. 연구에 따르면 뿌리 형태/RSA는 싹 형태 ^1,3에 비해 매우 가소성이 높습니다. RSA 형질 맵핑은 주변 토양 환경 변화의 효과를 기록하는 데 매우 효과적이다 ^1,11,12.

일반적으로, 뿌리 표현형에 대한 다양한 영양소 결핍의 효과의 불일치는 많은 초기 연구에서 보고되었습니다 3,11,13,14,15. 예를 들어, 인산염(Pi) 기아로 인한 측근(LR)의 수, 길이 및 밀도 변화에 대한 몇 가지 대조적인 보고서가 있습니다. LR 밀도의 증가는 Pi 결핍 조건 ^6,8에서 보고되었습니다. 대조적으로, Pi 결핍 조건 하에서 LR 밀도의 감소는 다른 저자 3,13,16에 의해서도보고되었다. 이러한 불일치의 두드러진 원인 중 하나는 원소 오염이 발생하기 쉬운 겔화 배지를 사용하는 것인데, 한천에는 종종^10개가 포함되어 있습니다. 연구원들은 일반적으로 한천 기반 플레이트 시스템에서 실험 식물을 재배하고 뿌리 특성을 기록합니다. 수많은 RSA 형질이 한천 물질 내에 숨겨져 있거나 굳어지는 경우가 많으며 문서화할 수 없습니다. 영양 결핍 유도와 관련된 실험은 사용자가 종종 배지에서 한 성분을 완전히 배제하는 것으로, 원소 오염이 발생하기 쉬운 겔화 배지^11,14,15에서 수행할 수 없다. 수많은 영양소가 한천 배지에 상당한 양으로 존재하는 경우가 많으며, 여기에는 P, Zn, Fe 등이^{포함된다 11,14,15}. 또한, RSA 성장은 한천 기반이 아닌 액체 배지보다 한천 기반 배지에서 더 느립니다. 그 결과, RSA의 표현형을 정량화하고 정성적으로 기록하기 위한 대안적인 비한천 기반 접근법을 확립할 필요가 있다. 결과적으로, 폴리카보네이트 쐐기 ^1,10,11에 의해 지지되는 폴리프로필렌 메쉬 위에 자홍색 상자 기반 수경재배 시스템에서 묘목을 키우는 현재의 방법이 개발되었습니다.

이 연구는 Jain et ^al.10에 의해 기술된 이전 방법의 상세한 즉석 버전을 제시한다. 이 전략은 식물 뿌리 생물학의 현재 요구에 맞게 조정되었으며 모델 식물 이외의 알팔파와 같은 식물에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RSA의 변경 사항을 측정하는 주요 방법이며 간단한 장비만 있으면 됩니다. 본 프로토콜은 정상 및 변형된 배지(Pi 결핍)에서 1차 및 외측 뿌리와 같은 여러 뿌리 특징을 표현형화하는 방법을 보여줍니다. 저자의 경험에서 얻은 단계별 지침과 기타 유용한 힌트는 연구자들이 이 방법에서 제공되는 방법론을 따르는 데 도움이 되도록 제공됩니다. 본 연구는 고차 LR을 포함하여 식물의 전체 뿌리 시스템을 밝히기 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 둥근 수채화 아트 브러시로 루트 시스템을 수동으로 펼치면 루트 1,10,11,12의 노출을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 고가의 장비나 복잡한 소프트웨어가 필요하지 않습니다. 이 방법은 영양소 흡수와 성장률을 향상시켰습니다. 식물은 뿌리에 쉽게 흡수되는 영양이 풍부한 용액을 가지고 있습니다. 본 방법은 특히 초기 발달 (발아 후 10-15 일) 동안 식물의 뿌리 시스템의 특성을 자세히 매핑하고자하는 연구자에게 적합합니다. 작은 뿌리 시스템, 애기장대 및 담배와 같은 모델 식물, 뿌리 시스템이 자홍색 상자에 들어갈 때까지 알팔파와 같은 비전통적인 식물에 적합합니다.

애기장대에서 RSA 발달의 표현형 분석 단계는 다음과 같이 이 프로토콜에 요약되어 있습니다: (1) 식물(Arabidopsis)에 대한 종자 표면 살균 방법, (2) 수경 재배 시스템을 설정하는 단계, 배지에 종자 파종, (3) RSA 분석을 위해 완전한 파종을 꺼내 페트리 플레이트에 뿌리는 절차, (4) RSA용 이미지를 기록하는 방법, (5) ImageJ 소프트웨어를 사용하여 중요한 RSA 매개변수를 계산합니다.

프로토콜

전체 프로토콜은 그림 1에 개략적으로 요약되어 있으며, 묘목의 뿌리 시스템 아키텍처 (RSA)를 밝히는 데 관련된 모든 필수 단계를 보여줍니다. 프로토콜 단계는 아래에 자세히 나와 있습니다.

1. 애기장대 종자 표면 살균

1. 작은 스쿱(약 100개의 씨앗 = 약 2.5mg)의 씨앗을 미세분리기 튜브에 옮기고 실온(RT)에서 증류수에 30분 동안 담급니다. 이 모든 절차는 무균 상태에서 수행됩니다.
2. RT에서 탁상용 원심분리기를 사용하여 종자가 들어 있는 미세분리기 튜브를 5초 동안 5 초 동안 잠시 원심분리합니다.
3. 물을 디캔팅하고 70%(v/v) 에탄올 700μL를 넣고 몇 초 동안 소용돌이치고 회전합니다. 필요한 경우 와동 및 회전을 반복하되 70% 에탄올의 처리 시간이 3분으로 유지되도록 합니다.
4. 3분 후 즉시 멸균수로 한 번 헹굽니다. 장기간 에탄올 노출은 발아를 감소시키므로 에탄올 세척 단계를 가능한 한 시기 적절하게 유지하십시오.
5. 희석된 상업용 표백제(4% v/v)로 씨앗을 Tween-20 한 방울과 함께 7분 동안 처리합니다. 튜브를 빠르게 8-12회 뒤집어 씨앗을 표백제 용액과 혼합한 다음 간단한 원심분리기(RT에서 5초 동안 500 x g )를 가합니다. 튜브에 거품이 나타나는 것이 보입니다.
6. 1mL 피펫을 사용하여 상청액을 디캔팅하고 동일한 와류 절차에 따라 멸균수로 최소 5회 세척하여 종자를 헹굽니다.
7. 표면 멸균된 종자를 물에 그대로 두고 성층화를 위해 4°C에서 2-3일 동안 배양한다¹⁰.

2. 종자 발아를 위한 수경재배 시스템 설정

1. 표준 마젠타 상자에 증류수를 반쯤 채우고 오토클레이브합니다. 폴리카보네이트 시트(선명한 색상과 부드러운 질감)를 오토클레이브하고 4cm x 8cm 직사각형을 절단하고 두 개의 직사각형이 함께 슬롯되어 X 모양¹⁰을 형성할 수 있도록 직사각형의 중간 지점이 중간 이상 노치가 있습니다. 이 설정을 사용하여 12x 24인치 시트(¹⁰)에서 자른 폴리프로필렌 메쉬(250μm 기공 크기의 6cm x 6cm 정사각형 또는 요구 사항에 따라 다름)를 고정합니다.
   알림: 폴리프로필렌은 산, 알칼리 및 기타 화학 물질에 대한 내성이 강합니다. 따라서 선택되었습니다. 오토클레이빙은 폴리프로필렌 메쉬를 왜곡시키는 경향이 있습니다. 따라서 알루미늄 호일로 별도로 싸서 휴대하는 것이 좋습니다. 16분, 121°C, 15psi 또는 775mmHg의 일반적인 오토클레이빙 조건이 권장됩니다.
2. Shukla et al.1에 의해 기술된 바와 같이, 비타민 + ^1.5%(w/v) 자당이 함유된 멸균 하프 MS 기초 배지를 각 박스에 추가하여 층류에서 폴리프로필렌 메쉬의 하단 가장자리에 도달합니다. 모든 절차는 무균 상태에서 수행됩니다.
3. 표면 멸균 된 씨앗을 메쉬 (250 μm 기공 크기)에 수경 재배로 뿌리고 3 일 동안 자랄 수 있도록합니다.
4. 3 일 후, 묘목을 메쉬 (500 μm 기공 크기)로 옮기고 2 일 동안 자랄 수 있도록합니다.
5. 2일 후(총 5일) 후, 묘목을 대조군 배지(즉, 2.0mM_NH4NO3, 1.9mM_KNO3, 0.15mM_MgSO4·_7H2O, 0.1mM_MnSO4· _H2O, 3.0 μM ZnSO4·7H2O, 0.1 μM CuSO4·5H2O, 0.3 mM CaCl2·2H2O, 5.0 μM KI, 0.1 μM_CoCl2·6H2O, 0.1 mM FeSO4·7H2O, 0.1 mM Na2EDTA·2H2O, 1.25mM _KH2PO4, 100 μM _H3BO3, 1 μM Na2MoO4·_2H2O,1.5% 수크로오스, 1.25 mM MES, pH 5.7 0.1 M MES[pH 6.1]로 조정하고, 실험 배지(예를 들어, P-[0 mM]로 처리; _KH2PO4는 상기^{언급된 바와} 같은 대조 배지 조성으로부터 0.62 mM_K2SO4로 대체된다 1. 과잉 Pi 처리의 경우, 변형된 MS 배지[2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]¹)에서_KH2PO4의 농도를 증가시키고, 종자를 7일 동안 성장시킨다.
   알림: 더 큰 메쉬 기공 크기(500μm)는 배축을 손상시키거나 절단할 필요 없이 전체 묘목을 부드럽게 따는 것을 용이하게 합니다. 묘목은 23°C에서 표준 성장 조건(즉, 16시간 밝음/8시간 어두운 광주기, 150μmol·^m-2·s-1 광도, 60%^- 70% 습도)에서 자랍니다.

3. RSA 심사

1. 뿌리 살포를 위해 한천 (1.1 %) 플레이트를 준비합니다 (페트리 플레이트 크기 : 150 mm x 15 mm).
2. 위에서 언급 한대로 10-20 mL의 고압 증기 멸균 여과 수돗물을 페트리 플레이트에 첨가하십시오. 메쉬 (500 μm)에서 묘목을 부드럽게 꺼내 접시의 물에 담그십시오.
3. 둥근 수채화 아트 브러시(크기: 14번, 16번, 18번, 20번)를 사용하여 물이 채워진 접시에 각 묘목의 뿌리를 부드럽게 펼칩니다.
   알림: 루트 시스템의 퍼짐을 수행하는 동안 먼저 기본 루트를 잡고 축 역할을 하므로 직선으로 퍼뜨립니다. 그런 다음 가능한 한 LR을 기본 루트의 양쪽에 대칭으로 퍼뜨립니다. 그 후, 1차 LR에 연결된 2차 LR을 스프레드합니다. 이 확산 과정은 일종의 예술입니다. RSA의 이미지를 그리는 아티스트처럼 부드럽게, 천천히하십시오.
4. 접시를 약간 기울여 물기를 제거합니다.
   알림: 이 시점에서 이 확산판을 4°C에 두어 절차를 일시 중지할 수 있습니다. 나중에 이미지 처리가 필요할 때 플레이트를 꺼내 잠시 동안 RT에 두십시오. 응축수를 닦아내면 이미지를 편리하게 처리할 수 있습니다.

4. RSA용 이미지 녹화

1. 이 페트리 플레이트를 적절하게 스캔하거나 사진을 찍으십시오.
   참고: 고품질 사진을 얻으려면 스캔에는 600dpi 해상도를, 사진 촬영에는 최소 12메가픽셀 카메라를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 무료로 사용할 수 있는 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 루트 시스템 아키텍처 특성을 측정합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 치근 길이를 측정하는 단계를 빠르게 따르려면 "DNA 윤곽 길이 측정"¹⁷ 예제를 참조하십시오.
   참고: 이 단계는 고해상도 스캐너 또는 카메라를 사용하여 캡처한 사진의 루트 길이를 측정하기 위해 수행됩니다.
   1. 주어진 길이의 거리를 사용하여 축척을 설정합니다. 그림 3 에서 눈금 막대의 알려진 거리는 2cm입니다. ImageJ 도구 모음에서 [ 직선 도구](왼쪽에서 다섯 번째 도구)를 선택합니다. 직선 도구를 사용하여 축척 막대의 윤곽선을 그리는 선 선택 영역을 만듭니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하거나, 두 번 클릭하거나, 시작 부분의 상자를 클릭하여 개요를 마칩니다.
   2. 측정값 분석 도구 모음을 사용하여 알려진 축척 막대의 길이를 픽셀 단위로 측정>. 픽셀 길이를 기록해 둡니다.
   3. 분석(Analyze) 탭에서 배율 설정(Set Scale) 탭을 클릭하여 배율 설정(Set Scale) 대화상자를 엽니다. Distance in Pixels 필드에 픽셀 길이를 입력합니다(위에서 언급한 대로). 그런 다음 알려진 거리 필드에 축척 막대로 표시된 대로 값을 입력합니다(여기서는 20mm). 길이 단위를 mm로 설정합니다. 픽셀 종횡비는 1.0입니다. 이제 스케일은 밀리미터당 x 픽셀 수로 지정됩니다. 이 특정 이미지의 배율을 잠그려면 확인을 클릭합니다.
   4. 세그먼트 선 도구를 사용하여 루트 길이의 윤곽선을 그리는 선 선택을 만듭니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하거나, 두 번 클릭하거나, 시작 부분의 상자를 클릭하여 개요를 마칩니다. 윤곽선을 따라 작은 흑백 "핸들"을 클릭하고 드래그하여 필요에 따라 선 선택을 조정합니다.
   5. ImageJ의 분석 탭 아래에 있는 측정 명령을 사용하여 루트의 길이를 수량화합니다. 측정된 데이터를 스프레드시트로 전송하려면 결과 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 모두 복사를 선택한 다음 스프레드시트로 전환한 다음 데이터를 붙여넣습니다.
      참고: 위에서 설명한 대로 ImageJ 배율 설정 옵션에서 배율 막대의 알려진 거리를 사용하여 배율을 설정합니다. 이것은 단위 길이당 픽셀 수를 제공합니다. 새로운 이미지를 분석할 때마다 매번 스케일을 새로 설정해야 합니다.
3. RSA 특성의 측정 및 계산
   1. 배축 접합부와 뿌리 끝 사이의 기본 뿌리 길이를 측정합니다.
   2. 1차 및 2차 LR 길이를 측정합니다.
   3. 1차 루트의 분기 영역(BZ)을 측정합니다. 기본 루트(BZ^PR)의 분기 영역은 첫 번째 LR 신흥 지점부터 마지막 LR 신흥 지점까지 걸쳐 있습니다.
   4. BZ^PR의 경계 내에서 발생하는 LR의 수인 LR 수를 기록합니다.
   5. 1차 LR과 상위 LR의 평균 길이를 측정합니다. 1° LR의 총 길이를 1° LR의 총 수로 나누어 1차 LR(1° LR)(루트당 센티미터)의 평균 길이를 도출합니다.
   6. 2차 LR의 평균 길이를 측정합니다. 2° LR의 총 길이를 2° LR의 총 수로 나누어 2차 LR(2° LR)의 평균 길이를 계산합니다.
   7. 1° LR 밀도를 측정합니다. 1° LR의 수를 BZ^PR의 길이로 나누어 1° LR 밀도(BZ^PR의 단위 길이당 1° LR 수)를 계산합니다.
   8. 2° LR 밀도를 측정합니다. 2° LR의 수를 1° LR의 BZ 길이로 나누어 2° LR 밀도를 계산합니다(BZ의 단위 길이당 2° LR 수 1° 측근).
   9. 총 루트 길이(TRL)를 측정합니다. 이것은 기본 루트, 1° LR 및 2° LR(있는 경우 그 이상) 길이의 집합입니다.

5. 뿌리털 측정

참고: 수경재배 시스템은 뿌리털 성장과 발달을 촉진하는 데 좋지 않지만 고체 성장 배지만큼 견고함에도 불구하고 현재 맥락에서 연구하는 것이 여전히 중요합니다. 아래 단계에 따라 묘목의 기본 뿌리 끝에서 5mm 섹션의 뿌리털 발달을 분석하십시오.

1. 뿌리 끝에서 기본 뿌리의 2cm 부분을 잘라냅니다.
2. 10% 글리세롤을 장착 매체로 사용하여 슬라이드에 루트 섹션을 장착합니다.
3. 슬라이드를 실체 현미경 아래에 놓습니다.
4. 축 방향 캐리어를 사용하여 뿌리털의 이미지를 시각화하고 캡처합니다.
5. 앞에서 설명한 대로 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하여 뿌리털의 구조와 특성을 연구합니다.

결과

루트 시스템 아키텍처(RSA)의 다양한 형태학적 특성은 간단한 실험실 도구를 사용하여 측정되며 단계는 그림 1에 개략적으로 설명되어 있습니다. 수경 재배 설정의 세부 사항은 RSA를 측정할 때 프로토콜의 잠재력을 보여줍니다(그림 1 및 그림 2).

겔화제에서 관찰된 차이를 감안할 때, 우리는 모든 연구를 수행?...

토론

이 작업에서는 간단한 실험실 장비를 사용하여 RSA를 매핑하는 방법을 시연했습니다. 이 방법을 사용하면 표현형 변경이 정제 된 수준에서 기록됩니다. 이 전략의 이점은 싹 부분이 미디어와 접촉하지 않기 때문에 묘목의 표현형이 독창적이라는 것입니다. 이 방법은 프로토콜에 설명 된대로 묘목을 재배하기 위해 수경 재배 시스템을 설정하는 것을 포함합니다. 그런 다음 각 묘목을 그대로 꺼내 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)