Un semplice protocollo per mappare i tratti dell'architettura del sistema di root delle piante

Riepilogo

Utilizziamo semplici strumenti di laboratorio per esaminare l'architettura del sistema di root (RSA) di Arabidopsis e Medicago. Le piantine vengono coltivate idroponicamente su rete e distribuite usando un pennello artistico per rivelare la RSA. Le immagini vengono scattate utilizzando la scansione o una fotocamera ad alta risoluzione, quindi analizzate con ImageJ per mappare i tratti.

Abstract

Una conoscenza completa dello sviluppo dell'architettura del sistema radicale delle piante (RSA) è fondamentale per migliorare l'efficienza nell'uso dei nutrienti e aumentare la tolleranza delle cultivar alle sfide ambientali. Viene presentato un protocollo sperimentale per la configurazione del sistema idroponico, la crescita delle piantine, la diffusione di RSA e l'imaging. L'approccio ha utilizzato un sistema idroponico a base di scatola magenta contenente rete in polipropilene supportata da cunei in policarbonato. Le impostazioni sperimentali sono esemplificate valutando l'RSA delle piantine sotto apporto variabile di nutrienti (fosfato [Pi]). Il sistema è stato istituito per esaminare la RSA di Arabidopsis, ma è facilmente adattabile per studiare altre piante come Medicago sativa (Alfalfa). Le piantine di Arabidopsis thaliana (Col-0) sono utilizzate in questa indagine come esempio per comprendere la pianta RSA. I semi vengono sterilizzati in superficie trattando etanolo e candeggina commerciale diluita e mantenuti a 4 °C per la stratificazione. I semi vengono germinati e coltivati su un mezzo liquido semi-MS su una rete di polipropilene sostenuta da cunei in policarbonato. Le piantine vengono coltivate in condizioni di crescita standard per il numero desiderato di giorni, raccolte delicatamente dalla rete e immerse in piastre di agar contenenti acqua. Ogni apparato radicale delle piantine viene distribuito delicatamente sulla piastra piena d'acqua con l'aiuto di un pennello rotondo. Queste lastre di Petri vengono fotografate o scansionate ad alta risoluzione per documentare i tratti RSA. I tratti radice, come la radice primaria, le radici laterali e la zona di ramificazione, vengono misurati utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente. Questo studio fornisce tecniche per misurare le caratteristiche delle radici delle piante in ambienti ambientali controllati. Discutiamo su come (1) coltivare le piantine e raccogliere e diffondere campioni di radici, (2) ottenere immagini di campioni RSA diffusi, (3) acquisire le immagini e (4) utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare gli attributi radice. Il vantaggio del presente metodo è la misurazione versatile, facile ed efficiente dei tratti RSA.

Introduzione

L'architettura del sistema radicale (RSA), che è sotterranea, è un organo vitale per la crescita e la produttività delle piante ^1,2,3. Dopo lo stadio embrionale, le piante subiscono i loro cambiamenti morfologici più significativi. Il modo in cui le radici crescono nel terreno influisce notevolmente sulla crescita delle parti delle piante fuori terra. La crescita delle radici è il primo passo nella germinazione. È un tratto informativo in quanto risponde in modo univoco ai diversi nutrienti disponibili 1,2,3,4. L'RSA presenta un alto grado di plasticità dello sviluppo, il che significa che l'ambiente viene sempre utilizzato per prendere decisioni sullo sviluppo ^2,5. I cambiamenti nell'ambiente hanno reso la produzione agricola più difficile nello scenario attuale. Su base continuativa, la RSA incorpora i segnali ambientali nelle scelte di sviluppo⁵. Di conseguenza, una conoscenza approfondita dei principi alla base dello sviluppo delle radici è essenziale per imparare come le piante rispondono ai cambiamenti ambientali ^2,5.

L'RSA rileva concentrazioni variabili di nutrienti e rende alterazioni fenotipiche 4,6,7,8,9,10,11,12. Gli studi suggeriscono che la morfologia delle radici/RSA è altamente plastica rispetto alla morfologia del germoglio ^1,3. La mappatura dei tratti RSA è altamente efficace nel registrare l'effetto del cambiamento dell'ambiente circostante del suolo 1,11,12.

In generale, discrepanze nell'effetto di varie carenze nutrizionali sul fenotipo radicale sono state riportate in molti studi precedenti 3,11,13,14,15. Ad esempio, ci sono diversi rapporti contrastanti sui cambiamenti indotti dalla fame di fosfato (Pi) nel numero, nella lunghezza e nella densità delle radici laterali (LR). Un aumento della densità di LR è stato riportato nella condizione di deficit di Pi ^6,8. Al contrario, una diminuzione della densità di LR in condizioni di carenza di Pi greco è stata riportata anche da altri autori 3,13,16. Una delle cause principali di queste incongruenze è l'uso del mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare, che l'agar spesso contiene¹⁰. I ricercatori in genere coltivano le loro piante sperimentali su un sistema di piastre a base di agar e registrano i tratti delle radici. Numerosi tratti RSA sono spesso nascosti o trincerati all'interno del materiale agar e non possono essere documentati. Gli esperimenti legati all'induzione di carenza di nutrienti, in cui gli utenti spesso escludono totalmente un componente dal mezzo, non possono essere eseguiti in un mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare^11,14,15. Numerosi nutrienti sono frequentemente presenti in quantità significative nei mezzi agar, tra cui P, Zn, Fe e molti altri^11,14,15. Inoltre, la crescita dell'RSA è più lenta nei terreni a base di agar rispetto ai mezzi liquidi non a base di agar. Di conseguenza, è necessario stabilire un approccio alternativo non basato su agar per quantificare e registrare qualitativamente il fenotipo di RSA. Di conseguenza, è stato sviluppato il metodo attuale, in cui le piantine vengono allevate in un sistema idroponico a base di scatola magenta in cima a una rete di polipropilene supportata da cunei in policarbonato 1,10,11.

Questo studio presenta una versione improvvisata dettagliata del metodo precedente descritto da Jain et ^al.10. Questa strategia è stata messa a punto per le attuali esigenze della biologia delle radici delle piante e può essere utilizzata anche per piante come l'erba medica, diverse dalle piante modello. Il protocollo è il modo principale per misurare i cambiamenti in RSA e richiede solo apparecchiature semplici. Il presente protocollo illustra come fenotipizzare diverse caratteristiche della radice, come le radici primarie e laterali in mezzo normale e modificato (deficit di Pi greco). Vengono fornite indicazioni passo-passo e altri suggerimenti utili raccolti dalle esperienze dell'autore per aiutare i ricercatori a seguire le metodologie offerte in questo metodo. Il presente studio mira a fornire un metodo semplice ed efficace per rivelare l'intero apparato radicale delle piante, compresi gli LR di ordine superiore. Questo metodo prevede la diffusione manuale del sistema radicale con un pennello rotondo per acquerello, consentendo un controllo preciso sull'esposizione delle radici 1,10,11,12. Non richiede attrezzature costose o software complicati. Questo metodo ha migliorato l'assorbimento dei nutrienti e il tasso di crescita; Le piante hanno una soluzione ricca di sostanze nutritive facilmente assorbita dalle loro radici. Il presente metodo è adatto per i ricercatori che desiderano mappare i tratti del sistema radicale di una pianta in dettaglio, in particolare durante lo sviluppo precoce (10-15 giorni dopo la germinazione). È adatto per piccoli sistemi radicali, piante modello come Arabidopsis e tabacco e piante non convenzionali come l'erba medica fino a quando il loro apparato radicale non si adatta alle scatole magenta.

Le fasi per l'analisi fenotipica dello sviluppo di RSA in Arabidopsis sono descritte in questo protocollo come segue: (1) il metodo di sterilizzazione della superficie del seme per le piante (Arabidopsis), (2) le fasi per impostare il sistema idroponico, seguite dalla semina dei semi su un terreno, (3) procedura per estrarre le piantine complete e spargere sulla piastra di Petri per l'analisi RSA, (4) come registrare le immagini per RSA e (5) calcolare importanti parametri RSA utilizzando il software ImageJ.

Protocollo

L'intero protocollo è riassunto schematicamente nella Figura 1, mostrando tutti i passaggi essenziali coinvolti nella rivelazione dell'architettura del sistema di root (RSA) delle piantine. I passaggi del protocollo sono riportati in dettaglio di seguito:

1. Sterilizzazione della superficie dei semi di Arabidopsis

1. Trasferire un piccolo misurino (circa 100 semi = circa 2,5 mg) di semi in un tubo di microfuge e immergere per 30 minuti in acqua distillata a temperatura ambiente (RT). L'intera procedura viene eseguita in condizioni asettiche.
2. Centrifugare brevemente il tubo di microfuge contenente semi a 500 x g per 5 s, usando qualsiasi centrifuga da tavolo a RT per lasciare che i semi si depositino.
3. Decantare l'acqua, aggiungere 700 μL di etanolo al 70% (v/v), vortice per alcuni secondi e centrifugare. Ripetere il vortice e la rotazione se necessario, ma assicurarsi che il tempo di trattamento del 70% di etanolo rimanga a 3 minuti.
4. Dopo 3 minuti, sciacquare immediatamente una volta con acqua sterile. Mantenere la fase di lavaggio dell'etanolo il più tempestiva possibile, poiché l'esposizione prolungata all'etanolo diminuisce la germinazione.
5. Trattare i semi con candeggina commerciale diluita (4% v/v) con una goccia di Tween-20 per 7 minuti. Mescolare i semi con la soluzione di candeggina capovolgendo rapidamente i tubi 8-12 volte, seguita da una breve centrifuga (500 x g per 5 s a RT). La schiuma è vista apparire nel tubo.
6. Decantare il surnatante con una pipetta da 1 mL e sciacquare i semi con almeno cinque lavaggi con acqua sterile, seguendo la stessa procedura di vortice.
7. Lasciare i semi sterilizzati in superficie in acqua e incubare per 2-3 giorni a 4 °C per la stratificazione¹⁰.

2. Impostazione di un sistema idroponico per la germinazione dei semi

1. Riempire a metà una scatola standard di magenta con acqua distillata e sterilizzarla in autoclave. Autoclavare il foglio di policarbonato (colore chiaro e texture liscia) e tagliare rettangoli di 4 cm x 8 cm, con un punto medio dentellato più di metà del rettangolo in modo che due rettangoli possano incastrarsi insieme per formare una forma X¹⁰. Utilizzare questa configurazione per tenere la rete in polipropilene (quadrati di 6 cm x 6 cm di dimensione dei pori di 250 μm, o a seconda del requisito) tagliata da fogli 12x 24 pollici¹⁰.
   NOTA: Il polipropilene è altamente resistente agli acidi, agli alcali e ad altre sostanze chimiche; pertanto, è stato optato. L'autoclave tende a distorcere la rete in polipropilene; Quindi, si consiglia di essere trasportato separatamente avvolto in un foglio di alluminio. Si raccomandano condizioni tipiche di autoclave di 16 min, 121 °C, 15 psi o 775 mm Hg.
2. Aggiungere mezzi basali sterili semi-MS con vitamine + 1,5% (p / v) di saccarosio, come descritto da Shukla et ^al.1, a ciascuna scatola per raggiungere il bordo inferiore della rete di polipropilene in un flusso laminare. Tutte le procedure vengono eseguite in condizioni asettiche.
3. Seminare i semi sterilizzati in superficie sulla rete (dimensione dei pori di 250 μm) idroponicamente e lasciarli crescere per 3 giorni.
4. Dopo 3 giorni, trasferire le piantine su una rete (dimensione dei pori di 500 μm) e lasciarle crescere per 2 giorni.
5. Dopo 2 giorni (totale di 5 giorni), trasferire le piantine sui terreni di controllo (cioè terreni nutritivi MS modificati 1 contenenti 2,0 mM NH 4 NO 3, 1,9 mM KNO₃, 0,15 mM MgSO 4·7H₂O,^0,1 mM MnSO ₄· H 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH ₂PO ₄, 100 μM H 3 BO₃, 1 μM Na 2 MoO₄·2H₂O, 1,5% saccarosio, 1,25 mM MES, pH 5,7 aggiustato con 0,1 M MES [pH 6,1]) e ai terreni sperimentali (ad esempio, trattamento P- [0 mM]; KH2 PO 4 è sostituito con 0,62 mM K₂SO₄ dalla composizione del mezzo di controllo come indicato sopra¹. Per i trattamenti con Pi in eccesso, la concentrazione di KH 2 PO₄ viene aumentata nel mezzo MS modificato [_2,5, 5,0, 10,0, 20,0 mM]¹) e lascia crescere i semi per 7 giorni.
   NOTA: Una dimensione dei pori a maglia più ampia (500 μm) facilita la raccolta regolare di intere piantine senza alcun danno o necessità di taglio all'ipocotile. Le piantine crescono in condizioni di crescita standard (cioè 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro, 150 μmol·^m-2·s-1 di intensità luminosa, 60%^- 70% di umidità) a 23 °C.

3. Esame della RSA

1. Preparare piastre di agar (1,1%) per lo spargimento delle radici (dimensioni della piastra di Petri: 150 mm x 15 mm).
2. Aggiungere 10-20 ml di acqua di rubinetto filtrata in autoclave alla piastra di Petri, come menzionato sopra. Estrarre delicatamente le piantine dalla rete (500 μm) e immergerle in acqua sui piatti.
3. Stendere delicatamente la radice di ogni piantina nel piatto pieno d'acqua con l'aiuto di un pennello rotondo per acquerello (dimensioni: n. 14, 16, 18 e 20).
   NOTA: Mentre si esegue la diffusione del sistema di root, prima afferrare la radice primaria e diffonderla in linea retta, poiché funge da asse. Quindi, distribuire gli LR simmetricamente su ciascun lato della radice primaria, ove possibile. Successivamente, diffondi il LR del secondo ordine collegato al LR del primo ordine. Questo processo di diffusione è una sorta di arte; fallo delicatamente, lentamente, come un artista che disegna un'immagine della RSA.
4. Inclinare leggermente la piastra per rimuovere l'acqua.
   NOTA: A questo punto, la procedura può essere messa in pausa mettendo queste piastre di diffusione a 4 °C. Successivamente, quando è necessaria l'elaborazione delle immagini, estrarre le lastre e posizionarle su RT per un po '. Pulire l'acqua condensata, quindi l'immagine può essere elaborata comodamente.

4. Registrazione di immagini per RSA

1. Scansiona o fotografa queste lastre di Petri in modo appropriato.
   NOTA: per ottenere fotografie di alta qualità, si consiglia la risoluzione di 600 dpi per la scansione e almeno una fotocamera da 12 megapixel per la fotografia.
2. Misurare le caratteristiche dell'architettura del sistema radice utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) disponibile gratuitamente. Per seguire rapidamente i passaggi per misurare la lunghezza della radice utilizzando il software ImageJ, fare riferimento all'esempio "misurazione della lunghezza del contorno del DNA"¹⁷.
   NOTA: questi passaggi vengono seguiti per misurare le lunghezze delle radici sulle immagini acquisite utilizzando uno scanner o una fotocamera ad alta risoluzione.
   1. Utilizzare una determinata distanza di lunghezza per impostare la scala. La distanza nota della barra della scala nella figura 3 è di 2 cm. Selezionate lo strumento Linea retta dalla barra degli strumenti ImageJ (quinto strumento da sinistra). Usate lo strumento linea retta per creare una selezione di linea che delinei la barra della scala. Completare la struttura facendo clic con il pulsante destro del mouse, facendo doppio clic o facendo clic nella casella all'inizio.
   2. Misurare la lunghezza della barra della scala nota in pixel utilizzando la barra degli strumenti Analizza > misura . Prendi nota della lunghezza in pixel.
   3. Aprire la finestra di dialogo Imposta scala facendo clic sulla scheda Imposta scala nella scheda Analizza. Nel campo Distanza in pixel, immettete la lunghezza in pixel (come indicato sopra). Quindi, nel campo Distanza nota, inserisci il valore, come mostrato dalla barra della scala (qui, è 20 mm). Impostare l'unità di lunghezza come mm. Le proporzioni pixel sono 1,0. Ora, la scala è specificata dal numero x di pixel per millimetro. Per bloccare la scala per questa particolare immagine, fare clic su OK.
   4. Create una selezione di linea che delinei la lunghezza della radice utilizzando lo strumento Linea segmentata . Completare la struttura facendo clic con il pulsante destro del mouse, facendo doppio clic o facendo clic nella casella all'inizio. Fare clic e trascinare le piccole "maniglie" bianche e nere lungo il contorno per regolare la selezione della linea in base alle esigenze.
   5. Utilizzare il comando Misura nella scheda Analizza di ImageJ per quantificare la lunghezza della radice. Per trasferire i dati misurati in un foglio di calcolo, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra Risultati , selezionare Copia tutto dal menu a comparsa, passare al foglio di calcolo, quindi incollare i dati.
      NOTA: come descritto in precedenza, impostare la scala utilizzando la distanza nota della barra della scala nell'opzione ImageJ set scale. Questo dà il numero di pixel per unità di lunghezza. È necessario impostare la scala ogni volta, ogni volta che viene analizzata una nuova immagine.
3. Misurazione e calcolo dei tratti RSA
   1. Misurare la lunghezza della radice primaria tra la giunzione ipocotilicica e l'estremità della punta della radice.
   2. Misurare la lunghezza LR del primo e del secondo ordine.
   3. Misurare la zona di diramazione (BZ) della radice primaria. La zona di ramificazione della radice primaria (BZ^PR) si estende dal primo punto emergente LR all'ultimo punto emergente LR.
   4. Registrare il numero di LR, che è il numero di LR originati all'interno del confine del BZ^PR.
   5. Misurare la lunghezza media degli LR di primo e di ordine superiore. Ricavare la lunghezza media della LR del primo ordine (1° LR) (centimetro per radice) dividendo la lunghezza totale della 1° LR per il numero totale di 1° LR.
   6. Misurare la lunghezza media del LR del secondo ordine. Calcolare la lunghezza media del LR del secondo ordine (2° LR) dividendo la lunghezza totale del 2° LR per il numero totale di 2° LR.
   7. Misurare la densità di 1° LR. Calcolare la densità di 1° LR (numero di 1° LR per unità di lunghezza di BZ PR⁾ dividendo il numero di 1° LR per la lunghezza del BZ^PR.
   8. Misurare la densità di 2° LR. Calcolare la densità di 2° LR dividendo il numero di 2° LR per la lunghezza del BZ di 1° LR (numero di 2° LR per unità di lunghezza del BZ di 1° radici laterali).
   9. Misurare la lunghezza totale della radice (TRL). Questo è l'aggregato delle lunghezze della radice primaria, 1° LR e 2° LR (e più se presente).

5. Misurazione dei peli radicali

NOTA: Sebbene il sistema idroponico non sia in grado di promuovere la crescita e lo sviluppo dei peli radicali, nonostante sia robusto come lo è nei terreni di crescita solidi, è comunque importante studiarlo nel contesto attuale. Seguire i passaggi seguenti per analizzare lo sviluppo dei peli radicali in una sezione di 5 mm dalla punta della radice primaria delle piantine.

1. Tagliare una sezione di 2 cm della radice primaria dalla punta della radice.
2. Montare la sezione della radice su una diapositiva utilizzando il 10% di glicerolo come mezzo di montaggio.
3. Posizionare il vetrino sotto un microscopio stereo.
4. Utilizzare il supporto assiale per visualizzare e catturare immagini dei peli radicali.
5. Analizza le immagini per studiare la struttura e le caratteristiche dei peli radicali utilizzando il software ImageJ come descritto in precedenza.

Risultati

I diversi tratti morfometrici dell'architettura del sistema radicale (RSA) sono misurati utilizzando semplici strumenti di laboratorio e i passaggi sono rappresentati schematicamente nella Figura 1. I dettagli della configurazione idroponica dimostrano il potenziale del protocollo nella misurazione dell'RSA (Figura 1 e Figura 2).

Date le differenze osservate negli agenti gelificanti, abbiamo utilizzato un...

Discussione

Questo lavoro ha dimostrato la mappatura di RSA utilizzando semplici apparecchiature di laboratorio. Utilizzando questo metodo, le alterazioni fenotipiche vengono registrate a livello raffinato. Il vantaggio di questa strategia è che la porzione di germoglio non entra mai in contatto con i media, quindi il fenotipo delle piantine è originale. Questo metodo prevede la creazione di un sistema idroponico per coltivare le piantine come descritto nel protocollo. Quindi, ogni piantina viene estratta intatta e posta su una pi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)