הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

Summary

אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר תפקוד גנים במקרופאגים שוכנים ברקמת הצפק in vivo, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

Abstract

למקרופאגים המתגוררים ברקמת הצפק יש תפקידים נרחבים בשמירה על הומאוסטזיס והם מעורבים בפתולוגיות בתוך רקמות מקומיות ושכנות. תפקידיהם מוכתבים על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים; לכן, חיוני לחקור את התנהגותם בנישה פיזיולוגית in vivo . כיום, מתודולוגיות ספציפיות הממוקדות במקרופאגים פריטוניאליים משתמשות במודלים טרנסגניים של עכבר שלם. כאן מתואר פרוטוקול לאפנון יעיל in vivo של mRNA ומיני RNA קטנים (למשל, microRNA) במקרופאגים פריטוניאליים באמצעות חלקיקי לנטיוירוס. תכשירי לנטיוירוס נעשו בתאי HEK293T וטוהרו על שכבת סוכרוז אחת. אימות In vivo של יעילות לנטיוירוס לאחר הזרקה תוך צפקית גילה זיהום דומיננטי של מקרופאגים המוגבלים לרקמה מקומית. התמקדות במקרופאגים פריטוניאליים הייתה מוצלחת במהלך הומאוסטזיס ודלקת צפק הנגרמת על ידי תיוגליקולט. נדונות מגבלות הפרוטוקול, כולל דלקת ברמה נמוכה הנגרמת על ידי אספקה תוך צפקית של לנטיוירוס ומגבלות זמן לניסויים פוטנציאליים. בסך הכל, מחקר זה מציג פרוטוקול מהיר ונגיש להערכה מהירה של תפקוד גנים במקרופאגים פריטוניאליים in vivo.

Introduction

מקרופאגים תושבי רקמות (Mφ) הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאי חיסון פגוציטיים החשים ומגיבים לפתוגנים פולשים ^1,2. בנוסף, הם ממלאים תפקיד חיוני בפיתוח רקמות, שיפוץ ושמירה על הומאוסטזיס ^1,3. רקמות רבות Mφ נובעות מאבות שק החלמון במהלך האמבריוגנזה ומתמידות ברקמה לאורך כל החיים ^4,5. הפנוטיפ והפונקציות של תאים אלה מוכתבים על ידי אינטראקציות שיתופיות והיררכיות של גורמי שעתוק ספציפיים והמיקרו-סביבה המקומית 6,7,8,9. הבנה הולכת וגוברת של תלות זו מגבירה את הצורך בשיטות יעילות in vivo למניפולציה גנטית של Mφ בתוך הנישה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

וקטורים לנטי-ויראליים הם כלי נפוץ למניפולציה של חומצות גרעין באוכלוסיות תאים ספציפיות in vivo 10,11,12, במיוחד בשל יכולתם להדביק תאים מתחלקים ולא מתחלקים ולהשתלב ביציבות בגנום המארח^13,14. במהלך שני העשורים האחרונים, טכנולוגיית העברת lentivirus עברה אופטימיזציה, ומעטפות חלופיות ומקדמים סינתטיים נחקרו כדי להגדיל את מיקוד ספציפי לשושלת ^8,15. בשל הטרופיזם הרחב של התא, גליקופרוטאין מעטפת וירוס סטומטיטיס שלפוחית הרחם (VSV-G)^16,17 הפך למעטפת "תקן הזהב" המשמשת בטכנולוגיית lentivirus.

בפרוטוקול^{זה 18}, חלקיקים לנטי-ויראליים פסאודו-טייפ של VSV-G משמשים להדגמת העברה ממוקדת ויעילה של RNA קצר סיכת שיער (shRNA) ומיקרו-רנ"א (miR) לעכבר Mφ (pMφ) in vivo, במצב יציב¹⁹. ביטוי טרנסגנים הונע על ידי מקדם וירוס יצירת מוקד הטחול (SFFV). זיהום פרודוקטיבי של תאים הוגדר על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (GFP) שמקורו בלנטיוירוס. השימוש בגישה זו איפשר קריאה קלה לניסויי in vivo lentivirus כדי להגדיר את המינון האופטימלי ואת מסגרת הזמן של הניסוי. לבסוף, אתגר לנטיויראלי in vivo של עכברים במהלך דלקת הנגרמת על ידי תיוגליקולט חשף את הנטייה הטבעית לזיהום pMφ סלקטיבי.

Protocol

כל עבודת בעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות המוסדיים ומשרד הפנים הבריטי.

הערה: כל מחקרי in vivo עם lentivirus צריכים להתבצע על פי הנחיות מקומיות ולאומיות לגבי שימוש אתי בבעלי חיים במחקר, כמו גם שמירה על כל התקנות הקשורות לשימוש בחומרים זיהומיים בקטגוריה II. כמו כן, יש לפקח על רווחת בעלי החיים בהתאם לתקנות המקומיות. בשלב זה של הפרוטוקול, יש לנקוט משנה זהירות בעבודה עם חלקיקים וחדים לנטי-ויראליים.

1. הכנת תאי HEK293T לטרנספקציה

הערה: בצע שלבים אלה תחת ארון בטיחות ביולוגי של תרבית רקמה סטרילית.

1. הכינו את מדיום הנשר המעובד (cDMEM) המלא של דולבקו לתאי HEK293T על ידי שילוב של 450 מ"ל DMEM עם 10% (v/v) נסיוב עגל עוברי (50 מ"ל) וריכוז סופי של 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין.
2. הפשיר תאי HEK293T לפחות שבוע לפני הטרנספקציה המתוכננת. לשמור על תנאי גידול בריאים ולעבור כל 2-3 ימים באמצעות טריפסין + EDTA כדי לנתק את התאים מן הצלוחית.
3. יום אחד לפני הטרנספקציה, שאפו בזהירות את מדיום הגידול מהתאים ושטפו בעדינות תאים עם DPBS סטרילי. הוסיפו 1-5 מ"ל טריפסין לבקבוק ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO₂ למשך 2-5 דקות.
4. הוסף 5-10 מ"ל של cDMEM ולסובב את התאים ב 350 x גרם במשך 5 דקות. הסר את הנוזל להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של cDMEM. לספור את התאים ואת הזרע 10-11 x 10⁶ קיימא HEK293T תאים לכל בקבוק T175 ב 20 מ"ל של cDMEM.
5. דגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5%_CO2 למשך הלילה כדי לאפשר לתאי HEK293T להגיע למפגש של 70%-80%.
6. למחרת, לאשר את המפגש של תאים תחת מיקרוסקופ אור.
7. הסר את המדיה מן הבקבוק עם פס סרולוגי 25 מ"ל מבלי להפריע monolayer התא.
8. מוסיפים בעדינות 10 מ"ל של DPBS ומנדנדים את הצלחת כדי לשטוף את התאים, תוך הקפדה לא להפריע למונושכבה של התא.
9. הסר DPBS עם פס סרולוגי 25 מ"ל.
10. הוסף 15 מ"ל של cDMEM חדש על הקיר לכל בקבוק T175 כדי לא להפריע monolayer התא, ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור ב 37 ° C.

2. טרנספקציה של תאי HEK293T באמצעות מגיב טרנספקציה שומנים שאינם ליפוזומליים

1. בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, הכינו את המרכיבים הלנטיויראליים: 2 מיקרוגרם פלסמיד לנטיויראלי, 1.5 מיקרוגרם pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) ו-1 מיקרוגרם pMD2.G (pCMV-MD2.G) עם Buffer EC (ערכת מגיב טרנספקציה) לנפח סופי של 600 מיקרוליטר.
2. הוסף 36 μL של תמיסת משפר. ערבבו את הרכיבים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל על ידי שאיבה חוזרת ונשנית של חלק מהנוזל והחזירו טיפה אחר טיפה ישירות על התמיסה הנותרת. השאירו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. מוסיפים 120 μL של מגיב transfection ומערבבים כנ"ל בערך 20 פעמים. דגירה במשך 10 דקות ב- RT.
4. מוסיפים 5.2 מ"ל cDMEM ומערבבים כנ"ל עם פסים סרולוגיים 5 מ"ל.
5. בעזרת פיפטת העברה חד פעמית, מוסיפים את תערובת הטרנספקציה ישירות על חד-שכבה של תאי HEK293T (תוך הימנעות מדפנות הבקבוק), ומפזרים את התערובת בנקודות שונות בצלוחית.
6. מפזרים את הפלסמיד על ידי נדנוד עדין של הבקבוק מצד לצד. יש להימנע מחדירת נוזלים למכסה הבקבוק.
7. לדגור את הבקבוק ב 37 ° C ב 5% CO₂ אינקובטור במשך 48 שעות. לאשר transfection יעיל של תאים HEK293T על ידי הופעת סמן פלואורסצנטי, כאן GFP, בתוך 24 שעות של transfection מנוטר תחת מיקרוסקופ הדמיה תא פלואורסצנטי.
   הערה: עבור מבנים ללא סמן פלואורסצנטי, תאים HEK293T חייבים להיבדק לנוכחות גן הסמן המשומש או על ידי שינוי ביטוי בגן / חלבון מעניין על ידי טכניקות מתאימות, למשל, qPCR. לחלופין, ניתן לאמת בעקיפין טרנספקציה מוצלחת במהלך בדיקת אוסף הלנטיוירוס על תאי Jurkat בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול על ידי הטכניקות לעיל.
   זהירות: תאי HEK293T נגועים נחשבים זיהומיים, ויש לנקוט אמצעי זהירות מתאימים בעת הטיפול בתאים אלה. יש לעקוב אחר כללים מקומיים, אשר יכולים לכלול בדרך כלל עבודה תחת ארון בטיחות ביולוגי קטגוריה II, שימוש בכפפות כפולות, ותמיסת טיהור מתאימה לחיטוי, למשל, ריכוז מוגבר של אקונומיקה פסולת (2,000 ppm) או פתרון שווה ערך על פי הנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות. יש לחטא את כל התמיסות והפלסטיק הבאים במגע עם תכשיר לנטיוירוס בהתאם לנוהלי בטיחות ביולוגית מוסדיים.

3. אוסף של חלקיקים lentiviral

1. הכינו תמיסת טיהור, תמיסת אקונומיקה (נתרן היפוכלוריט) בריכוז גבוה (2,000 ppm) או חומר שווה ערך בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות בדלי והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגי.
2. הכינו את ארון הבטיחות הביולוגי על ידי הסרת פריטים עודפים, כגון מתלי צינורות ריקים וכו'.
3. יש לסמן מראש צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל לכל בקבוק תאי T175 HEK293T ולהסיר את המכסה מצינור הצנטריפוגה. הניחו את הצינורות במדף יציב.
4. שלפו את הבקבוק מהאינקובטור ואשרו ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם לייזר של 488 ננומטר (איור 1A). עוצמת האות תלויה ביעילות הטרנספקציה של ההליך ובמבנים המשומשים.
5. אספו את המדיה מהתאים לתוך צינור הצנטריפוגה 50 מ"ל המסומן מראש. הטה את T175 HEK293T בקבוק עם תאים נגועים כך המדיום נאסף בפינה התחתונה של הצלוחית. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, לאסוף את המדיום מבלי להפריע monolayer התא. תאים צפים מסוימים עשויים להיות גלויים בשלב זה. מעבירים את המדיום לצינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל וסוגרים את המכסה.
   1. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, להוסיף 25 מ"ל של cDMEM טרי וחם לצלוחית. הקפידו לכוון את הזרימה המדיום על דפנות הבקבוק כדי לא להפריע לחד-שכבה של התא. להחזיר את הבקבוק עם תאי HEK293T נגועים לאינקובטור (37 ° C, 5% CO₂).
      הערה: ניתן לבצע אוסף שני של lentivirus וטיהור נוסף לאחר 24 שעות נוספות בעקבות ההליך המתואר בשלבים לעיל.
6. כאשר איסוף lentivirus הושלם לאחר 24 שעות או 48 שעות, להוסיף פתרון טיהור לתאים, להבטיח שהוא מכסה את monolayer התא. שמור את הבקבוק אופקי למשך 24 השעות הבאות, ולאחר מכן השליך אותו בהתאם לתקנות קטגוריה II המתאימות.

4. טיהור של lentivirus

1. סנן איסוף בינוני משלב 3.5.
   1. הסר את הבוכנה מהמזרק 50 מ"ל והכנס מסנן סטרילי פוליאתר קושר חלבון נמוך או פוליווינילידן פלואוריד 0.45 מיקרומטר לקצה המזרק. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, מוסיפים את המדיום שנאסף משלב 3.5.1 למזרק ומחזירים בעדינות את הבוכנה.
   2. דחפו את התקע באיטיות כדי להעביר את המדיום דרך המסנן לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 50 מ"ל. אם הזרימה פוחתת באופן משמעותי, מקמו את המזרק כשהמסנן מצביע כלפי מעלה ומשכו את הבוכנה מספיק כדי לנקות את המדיום מהמסנן.
   3. בזהירות, להחליף את המסנן על מזרק עם אחד חדש להיפטר המסנן בשימוש בתמיסת טיהור. המשך סינון בינוני. בסיום, לטהר את המסנן ואת המזרק על ידי השקעת המסנן ומילוי המזרק בתמיסת הטיהור.
2. קררו מראש את האולטרה-צנטריפוגה על ידי הגדרת הטמפרטורה ל-4°C וסגרו את המכסה כדי לאפשר לטמפרטורה להתאקלם.
3. הוסף 3 מ"ל של תמיסת 20% סוכרוז (20% w/v במים טהורים במיוחד, סינון מעוקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר) לתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה חרוטי.
4. באמצעות פס סרולוגי 25 מ"ל, כיסוי מדיום מסונן על גבי שכבת הסוכרוז, נזהר לא להפריע את השכבות.
   1. השתמש בהגדרת המהירות הנמוכה ביותר בילד פיפטה. סובבו את צינור האולטרה-צנטריפוגה החרוטי לכ-45° והוסיפו באיטיות את התווך המסונן המכיל לנטיוירוס משלב 4.1 לדופן הצינור. ודאו שהמדיום והסוכרוז אינם מתערבבים, ונראה הפרדה ברורה בין השכבות (איור 1B). ככל שנפח השכבה הבינונית גדל, הטו באיטיות את צינור האולטרה-צנטריפוגה חזרה למצב זקוף.
5. אם הנפח הכולל, כולל הסוכרוז והמדיום, בצינור האולטרה-צנטריפוגה קטן מ-29 מ"ל, מלאו ב-cDMEM טרי כדי למנוע את קריסת הצינור במהלך הסיבוב. עבור אוספי T175 מ"ל מרובים, ערבבו תכשירים בינוניים מסוננים והשתמשו במספר צינורות אולטרה-צנטריפוגה. מלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה הסופי בתווך לפי הצורך.
6. ודא כי דליי אולטרה צנטריפוגות נקיים; אין שאריות בינוניות בתחתית הדלי או בכובעים. במידת הצורך, יש לנגב עם ~70% אלכוהול. שימו מתאמי צינור מתאימים בתחתית כל דלי (איור 1C) והורידו בעדינות את צינורות האולטרה-צנטריפוגות לתוך הדליים.
7. סגור היטב את הדליים ותלה אותם על החללים שהוקצו ברוטור המסתובב.
8. ודאו שהדליים מאוזנים עם אותם נפחים של סוכרוז ומדיום. אסור להפעיל רוטור מסתובב ללא דליים, אף על פי שדליים יריבים עשויים להישאר ריקים²⁰ (איור 1D).
9. בזהירות להכניס את הרוטור לתוך ultracentrifuge ולהפעיל את האבק. הגדר את קצב ההאצה וההאטה של אולטרה-צנטריפוגות להגדרה הנמוכה ביותר, והפעל את מכיני ה- lentivirus ב- 85,000 x g למשך 90 דקות ב- 4 °C.
10. המתן עד שהאולטרה-צנטריפוגה תגיע למהירות הנדרשת (כ-3-5 דקות) לפני שתתרחק כדי לוודא שהרוטור מוכנס כראוי והסחרור לא יסתיים.
11. בזמן שהאולטרה-צנטריפוגה פועלת, נקו את סביבת העבודה בהתאם לדרישות הבטיחות בקטגוריה II והכינו את החלל לשלבים הבאים.
12. כאשר הסחרור מסתיים, השבת את הוואקום והסר בזהירות את הרוטור כדי לא להפריע לדגימות.
13. חקור את האולטרה-צנטריפוגה לאיתור דליפות וודא שאין דליפות מהדליים. במקרה של שפיכה, הכפפה כפולה לטהר את הצנטריפוגה ואת פני השטח החיצוניים של דליים עם מוצרים אנטי ויראליים.
14. הוציאו את הדליים מהאולטרה-צנטריפוגה והעבירו בזהירות את הדליים לארון הבטיחות הביולוגי בקטגוריה II.
    הערה: חלקיקי לנטיוירוס נאספים בתחתית צינור האולטרה-צנטריפוגה. הגלולה אינה נראית לעין בלתי.
15. יוצקים את הסוכרוז והמדיום בתנועה חלקה אחת ישירות למיכל הפסולת עם תמיסת הטיהור.
16. שמירה על צינור ultracentrifuge הפוך, להעביר אותו לשכבה כפולה של רקמה ולהשאיר אותו להתייבש במשך 10 דקות. בינתיים, נגבו את החלק הפנימי של הדליים עם רקמות ספוגות מים וייבשו באוויר הפוך.
17. בזהירות לייבש את כל הנוזל שנותר משפת צינור ultracentrifuge עם רקמה לפני להפוך אותו זקוף. יש לחטא את הרקמה ואת פני השטח שמתחתיה.
18. יש להשהות מחדש את גלולת הנגיף ב-1 מ"ל של מדיה או תמיסה נטולת סרום הדרושה לניסויים נוספים על ידי פיפטציה עדינה של התמיסה מעלה ומטה. השאירו אותו למשך 15 דקות ב-RT בתוך ארון הבטיחות לביולוגיה בקטגוריה II.
19. ערבבו בעדינות את תכשירי הלנטיוירוס באמצעות פיפטה של 1 מ"ל לפני שתכנסו לצינורות עליונים בורגיים של 1.5 מ"ל (למשל, צינוריות קריו). הכן את aliquots עבור עבודה in vivo (ריבוי של 100 μL) ועבור titer lentivirus בתאי Jurkat T (1 x 20 μL) (ראה שלב 5).
20. הימנע מחזורי הקפאה-הפשרה; תכשירים lentiviral ניתן לאחסן ב -80 ° C עד 6 חודשים ללא השפעה שלילית על זיהומיות.

5. טיטרציה של ייצור lentivirus בתאי Jurkat T

1. הכינו מדיום שלם של Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) עבור תאי Jurkat T על ידי השלמת 500 מ"ל של RPMI-1640 עם 10% (v/v) נסיוב עגל עוברי וריכוז סופי של 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין.
2. כדי להבטיח תרבית בריאה של תאי Jurkat T, לשמור על התאים בתרבית עד שבוע לפני ההדבקה.
3. ביום הטיטרציה של הלנטיוירוס, צלחת החוצה תאי Jurkat T קיימא בצלחת 24 בארות ב 2 x 10⁵ תאים / באר ב 200 μL לכל באר של cRPMI-1640.
4. השתמש lentivirus שנאסף טרי או להפשיר את בקבוקון lentivirus המכיל 20 μL על קרח ולערבב בעדינות על ידי pipeting למעלה ולמטה.
5. באמצעות דילול סדרתי ב- cRPMI-1640, להדביק תאי Jurkat T עם 0.25 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2.5 μL, 5 μL, ו 10 μL של מלאי lentivirus. נענע בעדינות את הצלחת כדי להבטיח הפצה שווה של lentivirus. תאי Jurkat T שאינם נגועים משמשים כבקרה שלילית.
6. לדגור את הצלחת ב 37 ° C. לאחר 4 שעות, מלא כל באר עם cRPMI לנפח כולל של 400 μL. להחזיר את הצלחת לאינקובטור ב 37 ° C למשך 3 ימים.
7. לאחר 48 שעות לאחר ההדבקה, יש לאשר את ביטוי ה-GFP תחת מערכת הדמיה פלואורסצנטית.
8. 3 ימים לאחר ההדבקה, לאסוף כל באר של צלחת 24 באר לתוך צינורות איסוף נפרדים 1.5 מ"ל צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
9. השליכו את הסופרנטנט. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-300 μL של 2% פרפורמלדהיד (PFA) מוכנה ל-2% (w/v) ב-DPBS ולהשאיר אותה למשך 15 דקות על קרח בחושך.
10. צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם ב 4 ° C למשך 5 דקות ולהשהות מחדש את הגלולה במאגר מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) (DPBS סטרילי + 4% FCS + 1 mM EDTA סטרילי).
11. נתחו את תדירות ביטוי ה-GFP ואת העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת של הלנטיוירוס הנגוע ותאי הבקרה שלו באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2).

6. זיהום In vivo lentivirus של מקרופאגים פריטוניאליים תושבי רקמות

1. בארון בטיחות ביולוגי בקטגוריה II, יש להעמיס מחטי אינסולין בנפח כולל של 200 μL של אמצעי מדיה ללא סרום המכילים את הכמות הנדרשת של לנטיוירוס (השתמש במחטים חד פעמיות, 30 גרם לרווחת בעלי החיים וכדי למנוע אובדן נוזלים במחט).
2. הניחו את נדן המחט בחזרה על המחט בטכניקת כף מדידה ביד אחת. שמור את המחט על קרח והזריק תוך 30 דקות.
3. במתקן לבעלי חיים, התקינו ארון בטיחות ביולוגי בקטגוריה II לפני הזרקות (איור 1E).
   1. הניחו יריעה של טישו נקי. שחררו את הנדן על מחט האינסולין המכילה לנטיוירוס.
   2. הכינו צלחת פטרי המכילה חתיכות קטנות של רקמה וחומר חיטוי על בסיס גלוקונאט כלורהקסידין, צינור 50 מ"ל המכיל תמיסת טיהור (תמיסת אקונומיקה של 2,000 ppm) ומיכל חד ובטוח.
4. לרסן את העכבר על ידי אחיזת העור בעורף²¹. עכבר מרוסן כראוי אינו נייד, וזה נדרש לבטיחות.
5. כאשר הבטן פונה כלפי מעלה, כוונו את ראשה של החיה מעט כלפי מטה. להזריק את lentivirus Intraperitoneally לתוך הרביע הימני התחתון של חלל הבטן. זאת כדי למנוע הזרקה לכל איברי חלל הצפק.
6. לפני שחרור העכבר, מלא את המזרק בתמיסת טיהור והשליך אותו בבטחה בתיבה הבטוחה החדה.
7. נגבו את אתר ההזרקה על בטנו של העכבר ברקמה ספוגה בחומר חיטוי והחזירו את החיה לכלוב.
8. אחסנו את העכבר המוזרק לנטיוירוס בסקנטינר מקטגוריה II או בכלובים מאווררים בנפרד (IVC) (כלובים מבודדים עם סינון אוויר ביעילות גבוהה) למשך 72 שעות לפחות לאחר ההזרקה. הניחו כרטיס מידע מתאים בחזית הכלוב.
9. העבר את העכבר לקטגוריה החדשה I מחזיק כלוב לאחר 72 שעות לאחר ההדבקה, בהתאם לאישורי בטיחות מקומיים. יש לעקוב אחר עכברים מדי יום במשך 3 ימים מההזרקה.

7. איסוף תאי צפק מעכבר נגוע בלנטיוירוס

אזהרה: עבור אוספים בטווח של 72 שעות לאחר הזרקת לנטיוירוס, פעל בהתאם לכללי הבטיחות הביולוגית המוסדיים בקטגוריה II. מצעים וכלוב החזקה שבו הוחזקו בעלי חיים נגועים ב-72 השעות הראשונות לאחר הזרקת הלנטיוירוס חייבים לעבור טיהור בהתאם לכללי הבטיחות הביולוגיים המוסדיים בקטגוריה II.

1. המתת חסד של עכברים בהתאם לתקנות מוסדיות, למשל, על ידי שאיפת ריכוז הולך וגובר של_CO2, ולאחר מכן אישור מוות על ידי נקע צוואר הרחם.
2. נקה את הבטן של העכבר עם 70% isopropanol בזהירות לחתוך את העור כדי לחשוף את קרום חלל הצפק.
3. שטפו את חלל הצפק עם 6 מ"ל של חיץ FACS קר כקרח באמצעות מזרק 10 מ"ל ומחט 23 גרם. הימנע ניקוב כל איברים.
4. עסו בעדינות את הצפק כדי לעקור תאים למאגר FACS.
5. לאסוף את נוזל הצפק באמצעות מזרק ומחט אותו.
6. הסר את המחט והעבר את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
7. שמור את שטיפות הצפק על קרח.
8. לאסוף איברים נדרשים אחרים ולאחסן אותם בהתאם למחקר.
9. יש להשליך פגרי בעלי חיים בהתאם להנחיות המקומיות בנושא בעלי חיים ובטיחות.

8. צביעה וניתוח של תאי הצפק

1. צנטריפוגה את שטיפת הצפק ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, להשליך את supernatant בתמיסת טיהור, ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מאגר FACS.
2. ספרו את התאים שנאספו ואת הצלחת 4 x 10⁵ תאים לכל באר בצלחת V תחתונה 96 בארות.
3. בצע צביעת כדאיות באמצעות מגיב הניתן לתיקון (לדוגמה, ערכת צביעת תאים מתים הניתנת לתיקון קרוב לאינפרא-אדום המשמש כאן) בהתאם להוראות היצרן.
4. אם תאים נדבקו במהלך 72 השעות האחרונות, תקן את התאים ב- 2% PFA למשך 15 דקות על קרח. הוסף נפח שווה של DPBS קר וצנטריפוגה שוב ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
5. הכינו את המאגר החוסם: ערבבו נוגדנים 4 מיקרוגרם/מ"ל 2.4G2 בסרום חולדות של 10% (v/v) בחיץ FACS לצביעת פני השטח או בחיץ חלחול לצביעה תוך תאית.
6. יש להשהות מחדש כל באר המכילה גלולת תא ב-50 מיקרוליטר של חיץ חוסם ולדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות.
7. הכינו תערובת נוגדנים ב-50 מיקרוליטר של חיץ FACS (לצביעה על פני השטח) או בחיץ חדירה (לצביעה תוך-תאית) לכל דגימה. נפח הצביעה הסופי עבור כל דגימה יהיה 100 μL, כולל 50 μL של חיץ חוסם. חישוב ריכוזי הנוגדנים בהתאם (טבלה 1).
8. הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים לדגימות ו 50 μL של בקרת איזוטיפ ומאגר בקרה כדי לשלוט דגימות. דגרו על הדגימות במשך 30 דקות על קרח בחושך. כלול תאים לא מוכתמים ופקדי איזוטיפ לפי הצורך.
9. שטפו היטב כל באר עם 100-200 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח וצנטריפוגה את הצלחת ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. חזור על שלב זה כדי לשטוף נוגדנים לא קשורים. נתח את הדגימות על ציטומטר זרימה.

9. מיצוי תאים מאיברים

1. הכינו 1 מ"ל של תערובת עיכול לכל איבר: ערבבו את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג IV ו-0.03 מ"ג/מ"ל DNase I (כולל 1.5 מ"ג/מ"ל היאלורונידאז לעיכול ריאות).
2. מעבירים את האיבר שנאסף ל 1 מ"ל של תערובת העיכול וטוחנים אותו במספריים.
3. סנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
4. אם מבודדים תאים מהריאה, הטחול או הכבד, ליז תאי דם אדומים באמצעות מאגר ACK lysis (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA pH = 7.4). סנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
5. לצבוע ולנתח את התאים כמתואר בסעיף 8.

תוצאות

כאשר מתבצע באופן מלא ונכון, פרוטוקול זה מניב סך של 1.5 מ"ל של מלאי לנטיוירוס באיכות גבוהה לכל תכשיר יחיד, מספיק עבור שתים עשרה זריקות in vivo בנפח האופטימלי שנקבע במחקר זה¹⁸. ניתן להעריך את הצלחת הטרנספקציה בשלב מוקדם של הפרוטוקול. תאי HEK293T בריאים וקולפים צריכ?...

Discussion

מקרופאגים שוכני רקמות מבצעים מגוון תפקודים הומיאוסטטיים ודלקתיים ספציפיים לרקמה ^1,2 המוכתבים על ידי הסביבה הפיזיולוגית שלהם ^6,7,8,9. בפרוטוקול זה, שיטה^{יעילה 18}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm sterile millex GP filter	Merck	SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm strainer	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	prepared in house
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b	Biolegend	101222	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b	BD	550993	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117317	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117333	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	BD	560375	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	Biolegend	152410	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226	Biolegend	128808	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	BD	560527	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	Biolegend	152313	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4	Biolegend	100412	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123133	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123147	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A	User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cell line			grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line			grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice			here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid		Naldini, L. et al. 1996	encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer	prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-well cell culture plate	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
surgical scissors	N/A	N/A	User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180