Preparazione di vettori lentivirali per un'efficiente modulazione di geni e microRNA di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi

Riepilogo

Dimostriamo un protocollo passo-passo per lo studio della funzione genica nei macrofagi residenti nel tessuto peritoneale in vivo, utilizzando vettori lentivirali.

Abstract

I macrofagi residenti nel tessuto peritoneale hanno ampie funzioni nel mantenimento dell'omeostasi e sono coinvolti in patologie all'interno dei tessuti locali e limitrofi. Le loro funzioni sono dettate da segnali microambientali; Pertanto, è essenziale indagare il loro comportamento in una nicchia fisiologica in vivo . Attualmente, specifiche metodologie di targeting dei macrofagi peritoneali impiegano modelli transgenici di topo intero. Qui, viene descritto un protocollo per un'efficace modulazione in vivo dell'espressione di mRNA e piccole specie di RNA (ad esempio, microRNA) nei macrofagi peritoneali utilizzando particelle di lentivirus. I preparati di lentivirus sono stati realizzati in cellule HEK293T e purificati su un singolo strato di saccarosio. La convalida in vivo dell'efficacia del lentivirus dopo l'iniezione intraperitoneale ha rivelato un'infezione predominante dei macrofagi limitata al tessuto locale. Il targeting dei macrofagi peritoneali ha avuto successo durante l'omeostasi e la peritonite indotta da tioglicolati. Vengono discussi i limiti del protocollo, tra cui l'infiammazione di basso livello indotta dalla somministrazione intraperitoneale di lentivirus e le restrizioni temporali per potenziali esperimenti. Nel complesso, questo studio presenta un protocollo rapido e accessibile per la valutazione rapida della funzione genica nei macrofagi peritoneali in vivo.

Introduzione

I macrofagi residenti nei tessuti (Mφ) sono una popolazione eterogenea di cellule immunitarie fagocitiche che percepiscono e rispondono ai patogeni invasori ^1,2. Inoltre, svolgono un ruolo essenziale nello sviluppo dei tessuti, nel rimodellamento e nel mantenimento dell'omeostasi ^1,3. Molti Mφ tissutali derivano dai progenitori del sacco vitellino durante l'embriogenesi e persistono nel tessuto per tutta la vita ^4,5. Il fenotipo e le funzioni di queste cellule sono dettate dalle interazioni collaborative e gerarchiche di specifici fattori di trascrizione e del microambiente locale 6,7,8,9. Una crescente comprensione di questa dipendenza aumenta la necessità di metodi efficaci in vivo per la manipolazione genica di Mφ all'interno della loro nicchia fisiologicamente rilevante.

I vettori lentivirali sono uno strumento frequentemente impiegato per la manipolazione degli acidi nucleici in specifiche popolazioni cellulari in vivo 10,11,12, in particolare grazie alla loro capacità di infettare sia le cellule in divisione che quelle non in divisione e di integrarsi stabilmente nel genoma dell'ospite ^13,14. Negli ultimi due decenni, la tecnologia di somministrazione dei lentivirus è stata ottimizzata e sono stati studiati involucri alternativi e promotori sintetici per aumentare il targeting specifico del lignaggio ^8,15. A causa del suo ampio tropismo cellulare, la glicoproteina dell'involucro del virus della stomatite vescicolare (VSV-G)^16,17 è diventata l'involucro "gold standard" utilizzato nella tecnologia dei lentivirus.

In questo protocollo¹⁸, le particelle lentivirali pseudotipizzate VSV-G sono impiegate per dimostrare la somministrazione mirata ed efficace di RNA a forcina corta (shRNA) e microRNA (miR) a Mφ peritoneale di topo (pMφ) in vivo, allo stato stazionario¹⁹. L'espressione del transgene è stata guidata dal promotore del virus della formazione del fuoco della milza (SFFV). L'infezione produttiva delle cellule è stata definita dall'espressione della proteina fluorescente verde potenziata (GFP) derivata dal lentivirus. L'utilizzo di questo approccio ha permesso una facile lettura per esperimenti in vivo sul lentivirus per definire la dose ottimale e il periodo di tempo sperimentale. Infine, la provocazione lentivirale in vivo dei topi durante l'infiammazione indotta da tioglicolato ha rivelato la naturale propensione all'infezione selettiva da pMφ.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali e del Ministero degli Interni del Regno Unito.

NOTA: Tutti gli studi in vivo con lentivirus devono essere eseguiti secondo le linee guida locali e nazionali sull'uso etico degli animali nella ricerca, nonché aderendo a tutte le normative associate all'uso di materiali infettivi di categoria II. Anche il benessere degli animali deve essere monitorato in conformità con le normative locali. In questa fase del protocollo, è necessario prestare la massima attenzione quando si lavora con particelle lentivirali e taglienti.

1. Preparazione delle cellule HEK293T per la trasfezione

NOTA: Eseguire questi passaggi sotto una cappa di sicurezza biologica per colture tissutali sterili.

1. Preparare il Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM) completo per HEK293T cellule combinando i 450 ml di DMEM con il 10% (v/v) di siero fetale di vitello (50 ml) e una concentrazione finale di 100 U/mL di penicillina/streptomicina.
2. Scongelare HEK293T celle almeno 1 settimana prima della trasfezione pianificata. Mantenere sane le condizioni di crescita e il passaggio ogni 2-3 giorni utilizzando tripsina + EDTA per staccare le cellule dal pallone.
3. Un giorno prima della trasfezione, aspirare con cura il terreno di coltura dalle cellule e lavare delicatamente le cellule con DPBS sterile. Aggiungere 1-5 mL di tripsina al pallone e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 2-5 minuti.
4. Aggiungere 5-10 mL di cDMEM e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti. Rimuovere il liquido e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di cDMEM. Contare le cellule e seminare 10-11 x 10⁶ cellule HEK293T vitali per matraccio T175 in 20 mL di cDMEM.
5. Incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per una notte per consentire alle cellule HEK293T di raggiungere la confluenza del 70%-80%.
6. Il giorno seguente, confermare la confluenza delle cellule al microscopio ottico.
7. Rimuovere il terreno dal pallone con una stripette sierologica da 25 mL senza disturbare il monostrato cellulare.
8. Aggiungere delicatamente 10 mL di DPBS e agitare la piastra per lavare le cellule, facendo attenzione a non disturbare il monostrato cellulare.
9. Rimuovere la DPBS con una stripette sierologica da 25 ml.
10. Aggiungere 15 mL di nuovo cDMEM sulla parete per ogni matraccio T175 in modo da non disturbare il monostrato cellulare e rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C.

2. Trasfezione di cellule HEK293T utilizzando reagente di trasfezione lipidica non liposomiale

1. In una provetta da centrifuga da 15 mL, preparare i componenti lentivirali: 2 μg di plasmide lentivirale, 1,5 μg di pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) e 1 μg di pMD2.G (pCMV-MD2.G) con Buffer EC (kit di reagenti di trasfezione) fino a un volume finale di 600 μL.
2. Aggiungere 36 μl di soluzione potenziatrice. Miscelare i componenti utilizzando una pipetta da 1 mL aspirando ripetutamente una parte del liquido e rimettendola goccia a goccia direttamente sulla soluzione rimanente. Lasciare agire per 5 min a temperatura ambiente (RT).
3. Aggiungere 120 μl di reagente di trasfezione e mescolare come sopra circa 20 volte. Incubare per 10 minuti a RT.
4. Aggiungere 5,2 mL di cDMEM e mescolare come sopra con una stripette sierologica da 5 mL.
5. Utilizzando una pipetta di trasferimento monouso, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia direttamente sul monostrato di cellule HEK293T (evitando le pareti del pallone), distribuendo la miscela in diversi punti del pallone.
6. Distribuire il plasmide facendo oscillare delicatamente il pallone da un lato all'altro. Evitare di far entrare liquidi nel coperchio del pallone.
7. Incubare il matraccio a 37 °C in un incubatore al 5 % di CO₂ per 48 ore. Confermare l'efficace trasfezione delle cellule HEK293T mediante la comparsa di un marcatore fluorescente, in questo caso GFP, entro 24 ore dalla trasfezione monitorata al microscopio fluorescente per imaging cellulare.
   NOTA: Per i costrutti senza il marcatore fluorescente, le cellule HEK293T devono essere testate per la presenza del gene marcatore utilizzato o per modifica dell'espressione nel gene/proteina di interesse con tecniche appropriate, ad esempio qPCR. In alternativa, il successo della trasfezione può essere verificato indirettamente durante il test della raccolta di lentivirus su cellule Jurkat nelle fasi successive del protocollo con le tecniche di cui sopra.
   ATTENZIONE: Le cellule HEK293T trasfettate sono considerate infettive e devono essere implementate adeguate precauzioni di sicurezza quando si maneggiano queste cellule. Dovrebbero essere seguite le regole locali, che in genere potrebbero includere il lavoro sotto una cabina di sicurezza biologica di categoria II, l'uso di doppi guanti e un'appropriata soluzione di decontaminazione per la disinfezione, ad esempio un aumento della concentrazione di candeggina di scarto (2.000 ppm) o una soluzione equivalente secondo le linee guida istituzionali sulla biosicurezza. Tutte le soluzioni e le plastiche che entrano in contatto con il preparato di lentivirus devono essere disinfettate secondo le procedure istituzionali di biosicurezza.

3. Raccolta di particelle lentivirali

1. Preparare una soluzione di decontaminazione, una soluzione di candeggina ad alta concentrazione (2.000 ppm) (ipoclorito di sodio) o un agente equivalente secondo le linee guida istituzionali sulla biosicurezza in un secchio e posizionarla nell'armadio di sicurezza per la biologia.
2. Preparare l'armadio di sicurezza per la biologia rimuovendo eventuali oggetti in eccesso, come rack per provette vuoti, ecc.
3. Pre-etichettare una provetta da centrifuga da 50 ml per pallone da HEK293T cellule T175 e rimuovere il coperchio dalla provetta da centrifuga. Posizionare le provette in una griglia stabile.
4. Recuperare il pallone dall'incubatore e confermare l'espressione di GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza con un laser a 488 nm (Figura 1A). L'intensità del segnale dipende dall'efficienza di trasfezione della procedura e dai costrutti utilizzati.
5. Raccogliere il terreno dalle cellule nella provetta da centrifuga da 50 ml pre-marcata. Inclinare il pallone HEK293T T175 con celle trasfettate in modo che il fluido si raccolga nell'angolo inferiore del pallone. Utilizzando una stripette sierologica da 25 mL, raccogliere il terreno senza disturbare il monostrato cellulare. A questo punto potrebbero essere visibili alcune celle galleggianti. Trasferire il terreno in una provetta da centrifuga pulita da 50 ml e chiudere il coperchio.
   1. Utilizzando una stripette sierologica da 25 mL, aggiungere 25 mL di cDMEM fresco e caldo al pallone. Assicurarsi di dirigere il flusso del fluido sulle pareti del pallone per non disturbare il monostrato di celle. Rimettere il matraccio con le cellule HEK293T trasfettate nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: Una seconda raccolta di lentivirus e un'ulteriore purificazione possono essere eseguite dopo ulteriori 24 ore seguendo la procedura descritta nei passaggi precedenti.
6. Quando la raccolta del lentivirus è completata dopo 24 ore o 48 ore, aggiungere la soluzione di decontaminazione alle cellule, assicurandosi che copra il monostrato cellulare. Tenere il pallone in posizione orizzontale per le successive 24 ore, quindi gettarlo seguendo le norme di categoria II appropriate.

4. Purificazione del lentivirus

1. Filtra il mezzo di raccolta dal passaggio 3.5.
   1. Rimuovere lo stantuffo dalla siringa da 50 ml e inserire un filtro sterile da 0,45 μm in polietere sulfone o fluoruro di polivinilidene a basso legame proteico nell'estremità della siringa. Utilizzando una stripette sierologica da 25 mL, aggiungere il terreno raccolto dal passaggio 3.5.1 alla siringa e rimettere delicatamente lo stantuffo.
   2. Spingere lentamente il tappo per far passare il fluido attraverso il filtro in una provetta da centrifuga fresca da 50 ml. Se il flusso si riduce in modo significativo, posizionare la siringa con il filtro rivolto verso l'alto ed estrarre lo stantuffo quanto basta per eliminare il fluido dal filtro.
   3. Sostituire con cautela il filtro della siringa con uno nuovo e smaltire il filtro usato nella soluzione decontaminante. Continuare la filtrazione media. Al termine, decontaminare il filtro e la siringa immergendo il filtro e riempiendo la siringa con la soluzione decontaminante.
2. Preraffreddare l'ultracentrifuga impostando la temperatura a 4 °C e chiudere il coperchio per consentire alla temperatura di acclimatarsi.
3. Aggiungere 3 mL di soluzione di saccarosio al 20% (20% p/v in acqua ultrapura, filtro sterilizzato con un filtro da 0,22 μm) sul fondo della provetta conica per ultracentrifuga.
4. Utilizzando una stripette sierologica da 25 mL, sovrapporre il terreno filtrato sopra lo strato di saccarosio, facendo attenzione a non disturbare gli strati.
   1. Utilizzare l'impostazione della velocità più bassa sul braccio della pipetta. Inclinare la provetta conica per ultracentrifuga a circa 45° e aggiungere lentamente il terreno filtrato contenente lentivirus dal passaggio 4.1 alla parete della provetta. Assicurarsi che il terreno e il saccarosio non si mescolino e che sia visibile una chiara separazione degli strati (Figura 1B). Man mano che il volume dello strato di terreno aumenta, inclinare lentamente la provetta dell'ultracentrifuga in posizione verticale.
5. Se il volume totale, compreso il saccarosio e il terreno, nella provetta per ultracentrifuga è inferiore a 29 ml, rabboccare con cDMEM fresco per evitare che la provetta collassi durante la centrifuga. Per più raccolte di T175 mL, miscelare le preparazioni con terreno filtrato e utilizzare più provette per ultracentrifuga. Rabboccare la provetta finale dell'ultracentrifuga con il mezzo secondo necessità.
6. Assicurarsi che i secchi dell'ultracentrifuga siano puliti; Non ci sono residui medi sul fondo del secchio o sui tappi. Se necessario, asciugare con ~70% di alcol. Inserire gli adattatori per provette appropriati sul fondo di ciascun secchio (Figura 1C) e abbassare delicatamente le provette per ultracentrifuga nei secchi.
7. Chiudere saldamente i secchi e appenderli agli spazi assegnati sul rotore spin-out.
8. Assicurarsi che i secchi siano bilanciati con gli stessi volumi di saccarosio e terreno. Un rotore spin-out non deve mai funzionare senza benne, anche se le benne opposte possono essere lasciate vuote²⁰ (Figura 1D).
9. Inserire con cautela il rotore nell'ultracentrifuga e accendere l'aspirapolvere. Impostare la velocità di accelerazione e decelerazione dell'ultracentrifuga sull'impostazione più bassa ed eseguire le preparazioni del lentivirus a 85.000 x g per 90 minuti a 4 °C.
10. Attendere che l'ultracentrifuga raggiunga la velocità richiesta (circa 3-5 minuti) prima di allontanarsi per assicurarsi che il rotore sia inserito correttamente e che la centrifuga non termini.
11. Mentre l'ultracentrifuga è in funzione, pulire l'area di lavoro in base ai requisiti di sicurezza di categoria II e preparare lo spazio per i passaggi successivi.
12. Al termine della centrifuga, disabilitare il vuoto e rimuovere con cautela il rotore per non disturbare i campioni.
13. Esaminare l'ultracentrifuga per eventuali fuoriuscite e verificare che non vi siano perdite dai secchi. In caso di fuoriuscita, indossare il guanto doppio e decontaminare la centrifuga e la superficie esterna dei secchi con prodotti antivirali.
14. Rimuovere i secchi dall'ultracentrifuga e trasportarli con cura nell'armadio di sicurezza per biologia di categoria II.
    NOTA: Le particelle di lentivirus si accumulano sul fondo della provetta dell'ultracentrifuga. Il pallino non è visibile ad occhio nudo.
15. Versare il saccarosio e il terreno con un movimento fluido direttamente nel contenitore dei rifiuti con la soluzione decontaminante.
16. Mantenendo la provetta dell'ultracentrifuga capovolta, trasferirla sul doppio strato di tessuto e lasciarla asciugare per 10 minuti. Nel frattempo, pulisci l'interno dei secchi con un fazzoletto imbevuto d'acqua e asciugalo all'aria a testa in giù.
17. Asciugare accuratamente il liquido rimanente dal bordo della provetta dell'ultracentrifuga con un fazzoletto prima di girarla in posizione verticale. Disinfettare il fazzoletto e la superficie sottostante.
18. Risospendere il pellet virale in 1 mL di terreno o soluzione priva di siero necessari per ulteriori sperimentazioni pipettando delicatamente la soluzione verso l'alto e verso il basso. Lasciare agire per 15 minuti a RT all'interno dell'armadio di sicurezza per biologia di categoria II.
19. Mescolare delicatamente i preparati di lentivirus utilizzando una pipetta da 1 ml prima di aliquotare in provette con tappo a vite da 1,5 ml (ad es. crioprovette). Preparare le aliquote per il lavoro in vivo (molteplicità di 100 μL) e per il titolo del lentivirus nelle cellule T Jurkat (1 x 20 μL) (vedere fase 5).
20. Evitare cicli di gelo-disgelo; I preparati lentivirali possono essere conservati a -80 °C per un massimo di 6 mesi senza un effetto negativo sull'infettività.

5. Titolazione della produzione di lentivirus in cellule T Jurkat

1. Preparare il terreno completo del Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) per le cellule T Jurkat integrando 500 ml di RPMI-1640 con il 10% (v/v) di siero fetale di vitello e la concentrazione finale di 100 U/mL di penicillina/streptomicina.
2. Per garantire una coltura sana di cellule T Jurkat, mantenere le cellule in coltura fino a 1 settimana prima dell'infezione.
3. Il giorno della titolazione del lentivirus, prelevare le cellule T Jurkat vitali in una piastra da 24 pozzetti a 2 x 10⁵ cellule/pozzetto in 200 μL per pozzetto di cRPMI-1640.
4. Utilizzare il lentivirus appena raccolto o scongelare la fiala di lentivirus contenente 20 μl di ghiaccio e mescolare delicatamente pipettando su e giù.
5. Utilizzando la diluizione seriale in cRPMI-1640, infettare le cellule T Jurkat con 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL e 10 μL di stock di lentivirus. Scuotere delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme del lentivirus. Le cellule T Jurkat non infette fungono da controllo negativo.
6. Incubare la piastra a 37 °C. Dopo 4 ore, rabboccare ogni pozzetto con cRPMI fino a un volume totale di 400 μl. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C per 3 giorni.
7. Dopo 48 ore dall'infezione, confermare l'espressione della GFP con un sistema di imaging fluorescente.
8. 3 giorni dopo l'infezione, raccogliere ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti in provette di raccolta separate da 1,5 mL e centrifugare le cellule a 350 x g a 4 °C per 5 minuti.
9. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 300 μL di paraformaldeide (PFA) al 2% preparata al 2% (p/v) in DPBS e lasciarlo per 15 minuti in ghiaccio al buio.
10. Centrifugare le cellule a 350 x g a 4 °C per 5 minuti e risospendere il pellet in tampone di selezione cellulare attivato da fluorescenza (FACS) (DPBS sterile + 4% FCS + 1 mM EDTA sterile).
11. Analizzare la frequenza di espressione della GFP e l'intensità fluorescente media del lentivirus infetto e delle sue cellule di controllo utilizzando la citometria a flusso (Figura 2).

6. Infezione da lentivirus in vivo di macrofagi peritoneali residenti nei tessuti

1. In una cabina di sicurezza biologica di categoria II, caricare aghi per insulina con un volume totale di 200 μl di terreno privo di siero contenente la quantità richiesta di lentivirus (utilizzare aghi monouso, 30 G per il benessere degli animali e per evitare la perdita di liquidi nell'ago).
2. Riposizionare la guaina dell'ago sull'ago utilizzando la tecnica della paletta con una sola mano. Tenere l'ago sul ghiaccio e iniettare entro 30 minuti.
3. Nella struttura per animali, allestire una cabina di sicurezza biologica di categoria II prima delle iniezioni (Figura 1E).
   1. Stendi un foglio di fazzoletto pulito. Allentare la guaina dell'ago per insulina contenente lentivirus.
   2. Preparare una capsula di Petri contenente piccoli pezzi di tessuto e un disinfettante a base di clorexidina gluconato, una provetta da 50 ml contenente una soluzione di decontaminazione (2.000 ppm di soluzione di candeggina) e un contenitore affilato e sicuro.
4. Trattenere il topo afferrando la pelle all'altezza della nuca²¹. Il mouse adeguatamente trattenuto è immobile e questo è necessario per la sicurezza.
5. Con l'addome rivolto verso l'alto, punta leggermente la testa dell'animale verso il basso. Iniettare il lentivirus per via intraperitoneale nel quadrante inferiore destro della cavità addominale. Questo per evitare l'iniezione in qualsiasi organo della cavità peritoneale.
6. Prima di rilasciare il topo, riempire la siringa con la soluzione decontaminante e smaltirla in modo sicuro nella cassetta di sicurezza affilata.
7. Pulire il sito di iniezione sull'addome del topo con un fazzoletto imbevuto di disinfettante e rimettere l'animale nella gabbia.
8. Alloggiare il topo iniettato con lentivirus in gabbie di categoria II o in gabbie ventilate individualmente (IVC) (gabbie isolate con filtrazione dell'aria ad alta efficienza) per un minimo di 72 ore dopo l'iniezione. Posizionare un'apposita scheda informativa sulla parte anteriore della gabbia.
9. Spostare il mouse nella nuova gabbia di contenimento di categoria I dopo 72 ore dall'infezione, a seconda delle approvazioni di sicurezza locali. Monitorare i topi quotidianamente per un totale di 3 giorni dall'iniezione.

7. Raccolta di cellule peritoneali da topo infetto da lentivirus

ATTENZIONE: Per le raccolte entro 72 ore dall'iniezione di lentivirus, seguire le norme di sicurezza biologica istituzionali di categoria II. La lettiera e la gabbia di detenzione in cui sono stati tenuti gli animali infetti nelle prime 72 ore dopo l'iniezione di lentivirus devono essere decontaminate secondo le norme istituzionali di sicurezza biologica di categoria II.

1. Eutanasia dei topi seguendo le normative istituzionali, ad esempio, mediante inalazione di una concentrazione crescente di CO₂, seguita dalla conferma della morte per lussazione cervicale.
2. Pulire l'addome del topo con isopropanolo al 70% e tagliare accuratamente la pelle per esporre la membrana della cavità peritoneale.
3. Lavare la cavità peritoneale con 6 mL di tampone FACS ghiacciato utilizzando una siringa da 10 mL e un ago da 23 G. Evita di perforare gli organi.
4. Massaggiare delicatamente il peritoneo per rimuovere le cellule nel tampone FACS.
5. Raccogliere il liquido peritoneale utilizzando la stessa siringa e ago.
6. Rimuovere l'ago e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL.
7. Conservare i lavandi peritoneali su ghiaccio.
8. Raccogliere gli altri organi necessari e conservarli in modo appropriato per lo studio.
9. Smaltire le carcasse di animali secondo le linee guida locali per gli animali e la sicurezza.

8. Colorazione e analisi delle cellule peritoneali

1. Centrifugare il lavaggio peritoneale a 350 x g a 4 °C per 5 minuti, scartare il surnatante nella soluzione di decontaminazione e risospendere le cellule in 1 mL di tampone FACS.
2. Contare le cellule raccolte e la piastra 4 x 10⁵ celle per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
3. Eseguire la colorazione di vitalità utilizzando un reagente fissabile (ad esempio, il kit di colorazione a cellule morte Fixable Near-IR utilizzato qui) secondo le istruzioni del produttore.
4. Se le cellule sono state infettate nelle ultime 72 ore, fissare le cellule in PFA al 2% per 15 minuti su ghiaccio. Aggiungere un volume uguale di DPBS freddo e centrifugare nuovamente a 350 x g a 4 °C per 5 min.
5. Preparare il tampone bloccante: Miscelare 4 μg/mL di anticorpo 2.4G2 in siero di ratto al 10% (v/v) nel tampone FACS per la colorazione superficiale o nel tampone di permeabilizzazione per la colorazione intracellulare.
6. Risospendere ogni pozzetto contenente pellet di cellule in 50 μl di tampone bloccante e incubare a 4 °C per 15 minuti.
7. Preparare la miscela di anticorpi in 50 μl di tampone FACS (per la colorazione superficiale) o tampone di permeabilizzazione (per la colorazione intracellulare) per ciascun campione. Il volume di colorazione finale per ciascun campione sarà di 100 μl, inclusi 50 μl di tampone bloccante. Calcolare le concentrazioni di anticorpi di conseguenza (Tabella 1).
8. Aggiungere 50 μl di miscela di anticorpi ai campioni e 50 μl di controlli isotipici e tampone di controllo ai campioni di controllo. Incubare i campioni per 30 minuti su ghiaccio al buio. Includere cellule non colorate e controlli isotipici come richiesto.
9. Lavare ogni pozzetto con 100-200 μL di DPBS ghiacciato e centrifugare la piastra a 350 x g a 4 °C per 5 minuti. Ripetere questo passaggio per eliminare eventuali anticorpi non legati. Analizzare i campioni su un citometro a flusso.

9. Estrazione di cellule dagli organi

1. Preparare 1 ml di miscela per la digestione per organo: mescolare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), 2 mg/mL di collagenasi di tipo IV e 0,03 mg/mL di DNasi I (includere 1,5 mg/mL di ialuronidasi per la digestione polmonare).
2. Trasferire l'organo raccolto in 1 ml di miscela per la digestione e tritarlo con le forbici.
3. Filtrare le celle con un colino da 40 μm e centrifugare a 350 x g a 4 °C per 5 minuti.
4. Se si isolano cellule dal polmone, dalla milza o dal fegato, lisare i globuli rossi utilizzando il tampone di lisi ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA pH = 7,4). Filtrare le celle con un colino da 40 μm e centrifugare a 350 x g a 4 °C per 5 minuti.
5. Colorare e analizzare le cellule come descritto nella sezione 8.

Risultati

Se seguito in modo completo e corretto, questo protocollo produce un totale di 1,5 ml di stock di lentivirus di alta qualità per singola preparazione, sufficiente per dodici iniezioni in vivo al volume ottimale determinato in questo studio¹⁸. Il successo della trasfezione può essere valutato all'inizio del protocollo. Le cellule HEK293T sane e confluenti dovrebbero mostrare, se presenti nei plasmidi, un segnale marcatore facilmente rilevabile (ad esempi...

Discussione

I macrofagi residenti nei tessuti svolgono una serie di funzioni tessuto-specifiche omeostatiche e infiammatorie ^1,2 dettate dal loro ambiente fisiologico ^6,7,8,9. In questo protocollo, è stato introdotto un metodo efficace¹⁸ per la manipolazione di macrofagi residenti perit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm sterile millex GP filter	Merck	SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm strainer	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	prepared in house
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b	Biolegend	101222	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b	BD	550993	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117317	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117333	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	BD	560375	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	Biolegend	152410	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226	Biolegend	128808	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	BD	560527	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	Biolegend	152313	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4	Biolegend	100412	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123133	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123147	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A	User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cell line			grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line			grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice			here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid		Naldini, L. et al. 1996	encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer	prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-well cell culture plate	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
surgical scissors	N/A	N/A	User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180