JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем пошаговый протокол исследования функции генов в перитонеальных тканевых резидентных макрофагах in vivo с использованием лентивирусных векторов.

Аннотация

Перитонеальные тканевые резидентные макрофаги обладают широкими функциями в поддержании гомеостаза и участвуют в патологиях внутри локальных и соседних тканей. Их функции продиктованы сигналами микросреды; Таким образом, важно исследовать их поведение в физиологической нише in vivo . В настоящее время в рамках конкретных методологий нацеливания на перитонеальные макрофаги используются трансгенные модели целых мышей. В данной работе описан протокол эффективной модуляции in vivo экспрессии мРНК и малых видов РНК (например, микроРНК) в перитонеальных макрофагах с использованием лентивирусных частиц. Препараты лентивируса изготавливали в HEK293T клетках и очищали на одном слое сахарозы. Валидация in vivo эффективности лентивируса после внутрибрюшинного введения выявила преимущественную инфекцию макрофагов, ограниченную местной тканью. Нацеливание на перитонеальные макрофаги было успешным во время гомеостаза и тиогликолат-индуцированного перитонита. Обсуждаются ограничения протокола, в том числе воспаление низкой степени, вызванное внутрибрюшинной доставкой лентивируса, и временные ограничения для потенциальных экспериментов. В целом, это исследование представляет собой быстрый и доступный протокол для быстрой оценки функции генов в перитонеальных макрофагах in vivo.

Введение

Тканевые резидентные макрофаги (Mφ) представляют собой гетерогенную популяцию фагоцитарных иммунных клеток, которые чувствуют и реагируют на вторжение патогенов 1,2. Кроме того, они играют важную роль в развитии тканей, ремоделировании и поддержании гомеостаза 1,3. Многие тканевые Mφ происходят от предшественников желточного мешка во время эмбриогенеза и сохраняются в ткани на протяжении всей жизни 4,5. Фенотип и функции этих клеток продиктованы коллаборативными и иерархическими взаимодействиями специфических факторов транскрипции и локального микроокружения 6,7,8,9. Растущее понимание этой зависимости увеличивает потребность в эффективных in vivo методах манипулирования генами Mφ в их физиологически значимой нише.

Лентивирусные векторы являются часто используемым инструментом для манипуляций с нуклеиновыми кислотами в конкретных клеточных популяциях in vivo 10,11,12, в частности, благодаря их способности инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и стабильно встраиваться в геном хозяина 13,14. За последние два десятилетия технология доставки лентивирусов была оптимизирована, и были исследованы альтернативные оболочки и синтетические промоторы для увеличения линейно-специфического таргетинга 8,15. Благодаря широкому клеточному тропизму, вирус везикулярного стоматита обволакивает гликопротеин (VSV-G)16,17 стал «золотым стандартом» оболочки, используемой в технологии лентивирусов.

В данном протоколе18 лентивирусные частицы VSV-G с псевдотипированием используются для демонстрации целенаправленной и эффективной доставки короткой шпильковой РНК (shRNA) и микроРНК (miR) в перитонеальную Mφ (pMφ) мыши in vivo, в равновесном состоянии19. Экспрессия трансгена была обусловлена промотором вируса, формирующего селезеночный очаг (SFFV). Продуктивное инфицирование клеток определялось экспрессией лентивирусного усиленного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Использование этого подхода позволило легко считывать данные для экспериментов с лентивирусом in vivo для определения оптимальной дозы и временных рамок эксперимента. Наконец, лентивирусная провокация in vivo мышей во время воспаления, вызванного тиогликолатами, выявила естественную склонность к селективной pMφ-инфекции.

протокол

Все работы с животными проводились в соответствии с рекомендациями Institutional и Министерства внутренних дел Великобритании.

Примечание: Все исследования in vivo с лентивирусом должны проводиться в соответствии с местными и национальными рекомендациями по этичному использованию животных в исследованиях, а также с соблюдением всех правил, связанных с использованием инфекционных материалов категории II. Благополучие животных также должно контролироваться в соответствии с местными правилами. На этом этапе протокола необходимо проявлять крайнюю осторожность при работе с лентивирусными частицами и острыми предметами.

1. Подготовка HEK293T клеток к трансфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эти действия в шкафу биологической безопасности для стерильных культур тканей.

  1. Приготовьте полную модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle Medium (cDMEM) для HEK293T клеток, объединив 450 мл DMEM с 10% (v/v) эмбриональной сывороткой теленка (50 мл) и конечной концентрацией 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина.
  2. Размораживать HEK293T клетки не менее чем за 1 неделю до планируемой трансфекции. Поддерживайте здоровые условия выращивания и прохода каждые 2-3 дня, используя трипсин + ЭДТА для отделения клеток от колбы.
  3. За сутки до трансфекции осторожно отсасывайте питательную среду из клеток и аккуратно промойте клетки стерильным DPBS. Добавьте в колбу 1-5 мл трипсина и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение 2-5 минут.
  4. Добавьте 5-10 мл cDMEM и вращайте ячейки при 350 x g в течение 5 минут. Удалите жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл cDMEM. Подсчитайте клетки и засемените 10-11 x 106 жизнеспособных HEK293T клеток в колбе T175 в 20 мл cDMEM.
  5. Инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение ночи, чтобы HEK293T клетки достигли 70–80% конфлюенции.
  6. На следующий день подтвердите слияние клеток под световым микроскопом.
  7. Извлеките среду из колбы с помощью серологической полоски объемом 25 мл, не нарушая монослой клеток.
  8. Аккуратно добавьте 10 мл DPBS и покачивайте пластину, чтобы промыть клетки, стараясь не нарушить монослой клеток.
  9. Удалите DPBS с помощью серологической полоски объемом 25 мл.
  10. Добавьте 15 мл нового cDMEM на стену на колбу T175, чтобы не нарушить монослой клетки, и верните планшет в инкубатор при температуре 37 °C.

2. Трансфекция HEK293T клеток с использованием нелипосомального липидного реагента для трансфекции липидов

  1. В центрифужной пробирке объемом 15 мл приготовьте лентивирусные компоненты: 2 мкг лентивирусной плазмиды, 1,5 мкг pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) и 1 мкг pMD2.G (pCMV-MD2.G) с помощью Buffer EC (набор реагентов Transfection) до конечного объема 600 мкл.
  2. Добавьте 36 мкл раствора усилителя. Смешайте компоненты с помощью пипетки объемом 1 мл, многократно всасывая часть жидкости и капля за каплей нанося ее обратно прямо на оставшийся раствор. Оставить на 5 минут при комнатной температуре (RT).
  3. Добавьте 120 мкл реагента для трансфекции и перемешайте, как указано выше, примерно 20 раз. Инкубировать в течение 10 минут при RT.
  4. Добавьте 5,2 мл cDMEM и перемешайте, как указано выше, с серологической полоской объемом 5 мл.
  5. С помощью одноразовой переводной пипетки добавьте трансфекционную смесь по каплям непосредственно на монослой HEK293T клеток (избегая стенок колбы), распределяя смесь по разным местам колбы.
  6. Распределите плазмиду, осторожно покачивая колбу из стороны в сторону. Избегайте попадания жидкости в крышку колбы.
  7. Инкубировать колбу при 37 °C в инкубаторе с 5 %CO2 в течение 48 часов. Подтвердить эффективную трансфекцию HEK293T клеток путем появления флуоресцентного маркера, в данном случае GFP, в течение 24 ч после трансфекции под контролем флуоресцентного микроскопа для визуализации клеток.
    Примечание: Для конструкций без флуоресцентного маркера HEK293T клетки должны быть проверены на наличие используемого маркерного гена или на изменение экспрессии в гене/белке, представляющем интерес, с помощью соответствующих методов, например, количественной ПЦР. В качестве альтернативы, успешная трансфекция может быть косвенно проверена во время тестирования коллекции лентивируса на клетках Jurkat на более поздних стадиях протокола с помощью вышеуказанных методов.
    ВНИМАНИЕ: Трансфицированные HEK293T клетки считаются инфекционными, и при работе с ними следует соблюдать соответствующие меры предосторожности. Следует соблюдать местные правила, которые обычно могут включать работу в шкафу биологической безопасности категории II, использование двойных перчаток и соответствующего раствора для обеззараживания для дезинфекции, например, повышенную концентрацию отработанного отбеливателя (2000 ppm) или эквивалентного раствора в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Все растворы и пластмассы, вступающие в контакт с препаратом лентивируса, должны быть продезинфицированы в соответствии с институциональными процедурами биобезопасности.

3. Сбор лентивирусных частиц

  1. Приготовьте раствор для обеззараживания, раствор отбеливателя (гипохлорита натрия) высокой концентрации (2 000 ppm) или эквивалентное средство в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности в ведре и поместите его в шкаф биологической безопасности.
  2. Подготовьте шкаф безопасности для биологии, убрав все лишние предметы, такие как пустые штативы для пробирок и т. д.
  3. Предварительно промаркируйте центрифужную пробирку объемом 50 мл на колбу T175 HEK293T ячеек и снимите крышку с центрифужной пробирки. Поместите пробирки в устойчивую решетку.
  4. Достаньте колбу из инкубатора и подтвердите экспрессию GFP с помощью флуоресцентного микроскопа с лазером 488 нм (рис. 1A). Интенсивность сигнала зависит от эффективности процедуры трансфекции и используемых конструкций.
  5. Соберите среду из клеток в предварительно маркированную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Наклоните колбу T175 HEK293T с трансфицированными ячейками так, чтобы среда собиралась в нижнем углу колбы. С помощью серологической полоски объемом 25 мл соберите среду, не нарушая монослой клеток. На этом этапе могут быть видны некоторые плавающие ячейки. Переложите среду в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл и закройте крышку.
    1. Используя серологическую полоску объемом 25 мл, добавьте в колбу 25 мл свежей теплой кДМЭМ. Следите за тем, чтобы направить поток среды на стенки колбы, чтобы не нарушить монослой ячейки. Верните колбу с трансфицированными HEK293T ячейками в инкубатор (37 °С, 5%СО2).
      Примечание: Второй сбор лентивируса и дальнейшая очистка могут быть выполнены через 24 часа после процедуры, описанной в описанных выше шагах.
  6. Когда сбор лентивируса будет завершен через 24 или 48 ч, добавьте раствор для обеззараживания в клетки, следя за тем, чтобы он покрывал монослой клеток. Держите колбу в горизонтальном положении в течение следующих 24 часов, затем выбросьте ее в соответствии с соответствующими правилами категории II.

4. Очищение от лентивируса

  1. Фильтруем собирающую среду с шага 3.5.
    1. Извлеките поршень из шприца объемом 50 мл и вставьте в конец шприца стерильный фильтр с низким содержанием белка, связывающий полиэфирсульфон или поливинилиденфторид 0,45 мкм. С помощью серологической полоски объемом 25 мл добавьте в шприц собранную среду с шага 3.5.1 и аккуратно верните поршень.
    2. Медленно нажмите на пробку, чтобы пропустить среду через фильтр в свежую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Если поток значительно уменьшился, расположите шприц фильтром вверх и вытяните поршень настолько, чтобы удалить среду из фильтра.
    3. Осторожно замените фильтр на шприце на новый и утилизируйте использованный фильтр в растворе для обеззараживания. Продолжайте фильтрацию среды. По завершении обеззаритите фильтр и шприц, погрузив фильтр в воду и наполнив шприц раствором для обеззараживания.
  2. Предварительно охладите ультрацентрифугу, установив температуру 4 °C, и закройте крышку, чтобы температура акклиматизировалась.
  3. Добавьте 3 мл 20 % раствора сахарозы (20 мас. в ультрачистой воде, фильтр стерилизован с помощью фильтра 0,22 мкм) на дно конической ультрацентрифужной пробирки.
  4. С помощью серологической полоски объемом 25 мл наложите отфильтрованную среду поверх слоя сахарозы, стараясь не повредить слои.
    1. Используйте самую низкую настройку скорости на пипетке. Наклоните коническую ультрацентрифужную пробирку примерно на 45° и медленно добавьте отфильтрованную лентивируссодержащую среду из шага 4.1 к стенке пробирки. Следите за тем, чтобы среда и сахароза не смешивались, и было видно четкое разделение слоев (Рисунок 1B). По мере увеличения объема слоя среды медленно наклоняйте ультрацентрифужную пробирку обратно в вертикальное положение.
  5. Если общий объем, включая сахарозу и среду, в ультрацентрифужной пробирке составляет менее 29 мл, долейте свежий cDMEM, чтобы избежать схлопывания пробирки во время отжима. Для нескольких сборов T175 мл смешайте препараты фильтрованной среды и используйте несколько ультрацентрифужных пробирок. При необходимости дольте в последнюю ультрацентрифужную пробирку среду.
  6. Убедитесь, что ведра ультрацентрифуги чистые; На дне ведра или крышках нет остатков среды. При необходимости протрите ~70% спиртом. Положите подходящие адаптеры для трубок на дно каждого ведра (Рисунок 1C) и осторожно опустите ультрацентрифужные пробирки в ведра.
  7. Надежно закройте ведра и повесьте их на отведенные места на вращающемся роторе.
  8. Следите за тем, чтобы ведра были сбалансированы с одинаковыми объемами сахарозы и средней. Вращающийся ротор никогда не должен работать без ковшей, хотя противоположные ковши могут оставаться пустыми20 (Рисунок 1D).
  9. Осторожно вставьте ротор в ультрацентрифугу и включите вакуум. Установите скорость ускорения и замедления ультрацентрифуги на самое низкое значение и запустите подготовку лентивируса при 85 000 x g в течение 90 минут при 4 °C.
  10. Подождите, пока ультрацентрифуга достигнет необходимой скорости (около 3-5 минут), прежде чем уйти, чтобы убедиться, что ротор вставлен правильно и вращение не прекратится.
  11. Во время работы ультрацентрифуги очистите рабочее пространство в соответствии с требованиями безопасности II категории и подготовьте пространство для следующих шагов.
  12. Когда отжим закончится, отключите вакуум и осторожно снимите ротор, чтобы не потревожить образцы.
  13. Осмотрите ультрацентрифугу на предмет разливов и убедитесь в отсутствии утечек из ведра. В случае разлива наденьте двойную перчатку и обеззараживайте центрифугу и внешнюю поверхность ведер противовирусными средствами.
  14. Снимите ведра с ультрацентрифуги и осторожно транспортируйте ведра в шкаф безопасности биологии II категории.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы лентивируса собираются на дне ультрацентрифужной пробирки. Дробинка не видна невооруженным глазом.
  15. Вылейте сахарозу и среду одним плавным движением прямо в контейнер для отходов с раствором для обеззараживания.
  16. Держа ультрацентрифужную трубку перевернутой, перенесите ее на двойной слой ткани и оставьте сохнуть на 10 минут. Тем временем протрите внутреннюю часть ведер смоченной в воде салфеткой и высушите на воздухе вверх дном.
  17. Тщательно вытрите насухо остатки жидкости с края ультрацентрифужной пробирки салфеткой, прежде чем перевернуть ее в вертикальном положении. Продезинфицируйте ткань и поверхность под ней.
  18. Повторно суспендируйте вирусную гранулу в 1 мл бессывороточной среды или раствора, необходимого для дальнейших экспериментов, осторожно дозируя раствор вверх и вниз. Оставьте на 15 минут в режиме RT в шкафу безопасности биологии II категории.
  19. Осторожно перемешайте препараты лентивируса с помощью пипетки объемом 1 мл перед выделением в пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл (например, криопробирки). Подготовьте аликвоты для работы in vivo (кратность 100 мкл) и для титра лентивируса в Т-клетках Jurkat (1 x 20 мкл) (см. шаг 5).
  20. Избегайте циклов замерзания-оттаивания; Препараты лентивирусов могут храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев без негативного влияния на инфекционность.

5. Титрование продукции лентивируса в Т-клетках Jurkat

  1. Приготовьте полную среду Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) для Т-клеток Jurkat путем добавления 500 мл RPMI-1640 с 10% (v/v) эмбриональной сыворотки теленка и конечной концентрацией 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина.
  2. Чтобы обеспечить здоровую культуру Т-клеток Jurkat, сохраняйте клетки в культуре до 1 недели до заражения.
  3. В день титрования лентивируса выложите жизнеспособные Т-клетки Jurkat в 24-луночный планшет в соотношении 2 x 105 клеток/лунку по 200 мкл на лунку cRPMI-1640.
  4. Используйте свежесобранный лентивирус или разморозьте флакон с лентивирусом, содержащий 20 μл, на льду и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
  5. Используя серийное разведение в cRPMI-1640, инфицируйте Т-клетки Jurkat 0,25 μл, 0,5 μл, 1 μл, 2,5 μл, 5 μл и 10 μл лентивирусного запаса. Аккуратно покачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение лентивируса. Неинфицированные Т-клетки Jurkat служат отрицательным контролем.
  6. Инкубируйте тарелку при 37 °C. Через 4 ч долите в каждую лунку cRPMI до общего объема 400 μл. Верните планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 3 дня.
  7. Через 48 ч после инфицирования подтвердите экспрессию GFP с помощью флуоресцентной системы визуализации.
  8. Через 3 дня после заражения соберите каждую лунку 24-луночного планшета в отдельные пробирки для сбора объемом 1,5 мл и центрифугируйте клетки при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  9. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в 300 мкл 2% параформальдегида (PFA), приготовленного до 2% (w/v) в DPBS и оставьте на 15 минут на льду в темноте.
  10. Центрифугируйте клетки при 350 x g при 4 °C в течение 5 мин и повторно суспендируйте гранулу в буфере для сортировки клеток с флуоресценцией-активацией (FACS) (стерильный DPBS + 4% FCS + 1 мМ стерильный ЭДТА).
  11. Анализ частоты экспрессии GFP и средней интенсивности флуоресценции инфицированного лентивируса и его контрольных клеток с помощью проточной цитометрии (рис. 2).

6. Лентивирусная инфекция in vivo тканевых резидентных перитонеальных макрофагов

  1. В бокс биологической безопасности категории II загрузите иглы инсулина общим объемом 200 мкл бессывороточной среды, содержащей необходимое количество лентивируса (используйте одноразовые иглы по 30 г для благополучия животных и во избежание потери жидкости в игле).
  2. Поместите ножны иглы обратно на иглу, используя технику совка одной рукой. Держите иглу на льду и вводите в течение 30 минут.
  3. В животноводческом помещении перед инъекциями установите шкаф биологической безопасности категории II (рис. 1E).
    1. Постелите лист чистой салфетки. Ослабьте оболочку на игле инсулина, содержащей лентивирус.
    2. Приготовьте чашку Петри, содержащую небольшие кусочки ткани и дезинфицирующее средство на основе хлоргексидина глюконата, пробирку объемом 50 мл с раствором для обеззараживания (2000 ppm раствора отбеливателя) и острый безопасный контейнер.
  4. Удерживайте мышь, захватывая кожу в области затылка21. Правильно удерживаемая мышь неподвижна, а это требуется для безопасности.
  5. Повернув живот вверх, направьте голову животного немного вниз. Ввести лентивирус внутрибрюшинно в нижний правый квадрант брюшной полости. Это необходимо для того, чтобы избежать инъекций в любые органы брюшной полости.
  6. Прежде чем выпустить мышь, наполните шприц обеззараживающим раствором и безопасно утилизируйте его в острый сейф.
  7. Протрите место укола на животе мыши тканью, смоченной в дезинфицирующем средстве, и верните животное в клетку.
  8. Мыши, получившие инъекцию лентивируса, помещаются в контейнеры категории II или в клетки с индивидуальной вентиляцией (IVC) (изолированные клетки с высокоэффективной фильтрацией воздуха) в течение как минимум 72 часов после инъекции. Разместите соответствующую информационную карточку на передней части клетки.
  9. Переместите мышь в новую клетку категории I через 72 часа после заражения, в зависимости от местных разрешений на безопасность. Наблюдайте за мышами ежедневно в течение 3 дней с момента инъекции.

7. Забор перитонеальных клеток у мышей, инфицированных лентивирусом

ВНИМАНИЕ: При сборе в течение 72 ч после инъекции лентивируса соблюдайте институциональные правила биологической безопасности категории II. Подстилка и клетка, в которых содержались инфицированные животные в течение первых 72 ч после инъекции лентивируса, должны быть обеззаражены в соответствии с правилами биологической безопасности II категории учреждения.

  1. Усыпляйте мышей в соответствии с установленными правилами, например, путем вдыхания возрастающей концентрацииСО2 с последующим подтверждением смерти от вывиха шейки матки.
  2. Очистите брюшную полость мыши с помощью 70% изопропанола и тщательно разрежьте кожу, чтобы обнажить оболочку брюшинной полости.
  3. Промывайте брюшную полость 6 мл ледяного буфера FACS с помощью шприца объемом 10 мл и иглы 23 G. Избегайте прокола любых органов.
  4. Аккуратно массируйте брюшину, чтобы вытеснить клетки в буфер FACS.
  5. Соберите перитонеальную жидкость с помощью того же шприца и иглы.
  6. Извлеките иглу и переложите ячейки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
  7. Держите брюшинные промывки на льду.
  8. Соберите другие необходимые органы и храните их в соответствии с исследованием.
  9. Утилизируйте туши животных в соответствии с местными правилами защиты животных и техники безопасности.

8. Окрашивание и анализ клеток брюшины

  1. Центрифугируйте перитонеальный лаваж при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость в раствор для обеззараживания и повторно суспендируйте клетки в 1 мл буфера FACS.
  2. Подсчитайте собранные ячейки и планшет 4 x 105 клеток на лунку в 96-луночном планшете с V-образным дном.
  3. Выполняйте окрашивание на жизнеспособность с помощью фиксируемого реагента (например, используемого здесь набора для окрашивания мертвых клеток Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit) в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Если клетки были инфицированы в течение последних 72 ч, зафиксируйте клетки в 2% PFA на 15 мин на льду. Добавьте равный объем холодного DPBS и снова центрифугируйте при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  5. Приготовьте блокирующий буфер: Смешайте 4 мкг/мл антитела 2,4G2 в 10% (v/v) сыворотке крови крысы в буфере FACS для поверхностного окрашивания или буфере для пермеабилизации для внутриклеточного окрашивания.
  6. Ресуспендируйте каждую лунку, содержащую клеточную гранулу, в 50 мкл блокирующего буфера и инкубируйте при 4 °C в течение 15 минут.
  7. Приготовьте смесь антител в 50 мкл буфера FACS (для поверхностного окрашивания) или буфера для пермеабилизации (для внутриклеточного окрашивания) для каждого образца. Окончательный объем окрашивания для каждого образца составит 100 μл, включая 50 μL блокирующего буфера. Рассчитайте концентрацию антител соответственно (Таблица 1).
  8. Добавьте 50 мкл смеси антител в образцы и 50 мкл контрольного изотипа и контрольного буфера в контрольные образцы. Инкубируйте образцы в течение 30 минут на льду в темноте. При необходимости включите неокрашенные клетки и элементы контроля изотипа.
  9. Промойте каждую лунку 100-200 μL ледяного DPBS и центрифугируйте планшет при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут. Повторите этот шаг, чтобы смыть все несвязанные антитела. Анализируйте образцы на проточном цитометре.

9. Извлечение клеток из органов

  1. Приготовьте 1 мл смеси для пищеварения на каждый орган: смешайте сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS), 2 мг/мл коллагеназы IV типа и 0,03 мг/мл ДНКазы I (включите 1,5 мг/мл гиалуронидазы для переваривания легких).
  2. Перелейте собранный орган в 1 мл пищеварительной смеси и пропустите через мясорубку ножницами.
  3. Профильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 мкм и центрифугируйте при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  4. При выделении клеток из легких, селезенки или печени лизируйте эритроциты с помощью буфера для лизиса ACK (150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ Na2EDTA pH = 7,4). Профильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 мкм и центрифугируйте при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  5. Окрасьте и проанализируйте клетки, как описано в разделе 8.

Результаты

При полном и правильном следовании этому протоколу получается в общей сложности 1,5 мл высококачественного лентивируса на один препарат, что достаточно для двенадцати инъекций in vivo в оптимальном объеме, определенном в этом исследовании18. Успех транс...

Обсуждение

Тканевые резидентные макрофаги выполняют ряд гомеостатических и воспалительных тканеспецифичных функций 1,2 в зависимости от их физиологической среды 6,7,8,9. В этом п?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось, полностью или частично, премией Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T также поддерживается Британским научно-исследовательским институтом деменции. M.A.C поддерживается стипендией Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам (BB/T009543/1). В целях открытого доступа автор применил публичную лицензию CC BY на любую версию рукописи, принятую автором, возникшую в результате этой заявки. L.C.D является преподавателем в Университете Суонси и почетным научным сотрудником Университета Кардиффа. Эта работа подкрепляется работой, проведенной Ipseiz et al. 202018.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μm sterile millex GP filterMerckSLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filterMerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)BD324892
1 Litre Sharps ContainerN/AN/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μm strainerThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax SupplementThermo Fisher Scientific31035025
Blocking bufferprepared in house
Brewer thioglycolate mediumSigma-AldrichB25514% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11bBiolegend101222Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11bBD550993Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117317Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117333Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19BD560375Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19Biolegend152410Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226Biolegend128808Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBD560527Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBiolegend152313Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4Biolegend100412Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73eBioscience16-0731-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8aeBioscience48-0081-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mmBeckman Coulter358126
CentrifugesBeckman CoulterUltracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IVSigma-AldrichC5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene transfection reagentQiagen301425
F4/80Biolegend123123Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123133Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123147Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1eBioscience48-5898-80Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometerThermo Fisher Scientific Attune NxT
Flow cytometry (FACS) bufferprepared in house
Fluorescent tissue culture microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
ForcepsN/AN/AUser preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T cell linegrown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigenBeckman Coulter6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanserEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1Becton Dickinson554970Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell linegrown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kitThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Micehere used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gprepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmidZuffrey, R., et al. 1997encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dishGreiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmidRosas, M. et al. 2014modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmidNaldini, L. et al. 1996encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype controlBecton Dickinson550617Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serumSigma-AldrichR9759-10ML
Red blood ACK lysis bufferprepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamineThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
Sterile 24-well cell culture plateGreiner Bio One662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - freeThermo Fisher Scientific14190144
Sterile EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)VWR612-4515
SucroseThermo Fisher Scientific15503022
surgical scissorsN/AN/AUser preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plateGreiner Bio One650180

Ссылки

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146 (2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047 (2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. . Available from: https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023)
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1 (2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152 (2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875 (2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85 (2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vivoHEK293T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены