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요약

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

초록

복막 조직에 상주하는 대식세포는 항상성 유지에 광범위한 기능을 하며 국소 및 인접 조직 내의 병리학에 관여합니다. 그들의 기능은 미시 환경 단서에 의해 결정됩니다. 따라서 생체 내 생리학적 틈새에서 그들의 행동을 조사하는 것이 필수적입니다. 현재 특정 복막 대식세포 표적화 방법론은 전체 마우스 형질전환 모델을 사용합니다. 여기에서는 렌티바이러스 입자를 이용한 복막 대식세포에서 mRNA 및 small RNA 종(예: microRNA) 발현의 효과적인 in vivo 조절을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 렌티바이러스 제제는 HEK293T 세포에서 제조하고 단일 슈크로스 층에서 정제하였다. 복강내 주사 후 렌티바이러스 효과에 대한 in vivo 검증에서 국소 조직에 국한된 대식세포의 우세한 감염이 밝혀졌습니다. 복막 대식세포의 표적화는 항상성 및 티오글리콜레이트 유발 복막염 동안 성공적이었습니다. 렌티바이러스의 복강 내 전달에 의해 유발되는 낮은 수준의 염증과 잠재적인 실험을 위한 시간 제한을 포함한 프로토콜의 한계에 대해 논의합니다. 전반적으로 이 연구는 생체 내 복막 대식세포의 유전자 기능을 신속하게 평가하기 위한 빠르고 접근 가능한 프로토콜을 제시합니다.

서문

조직 상주 대식세포(Tissue-resident macrophage, Mφ)는 침입하는 병원체를 감지하고 이에 반응하는 식세포 면역세포의 이질적인 집단입니다 1,2. 또한 조직 발달, 리모델링 및 항상성 유지에 필수적인 역할을 합니다 1,3. 많은 조직 Mφ는 배아 발생 동안 난황낭 전구 세포에서 파생되며 평생 동안 조직에 남아 있습니다 4,5. 이들 세포의 표현형과 기능은 특정 전사 인자와 국소 미세환경 6,7,8,9의 협력적이고 계층적인 상호작용에 의해 결정된다. 이러한 의존성에 대한 이해가 증가함에 따라 생리학적으로 관련된 틈새 내에서 Mφ의 유전자 조작을 위한 효과적인 in vivo 방법에 대한 필요성이 증가하고 있습니다.

렌티바이러스 벡터는 생체 내 특정 세포 집단(10,11,12)에서 핵산을 조작하기 위해 자주 사용되는 도구이며, 특히 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포를 모두 감염시키고 숙주 게놈13,14에 안정적으로 통합할 수 있는 능력 때문에 더욱 그렇습니다. 지난 20년 동안 렌티바이러스 전달 기술이 최적화되었으며, 계통 특이적 표적화를 증가시키기 위해 대체 외피 및 합성 프로모터가 조사되었습니다 8,15. 수포성 구내염 바이러스는 광범위한 세포 영양성으로 인해 당단백질(VSV-G)을 둘러싸고 있습니다.16,17은 렌티바이러스 기술에서 사용되는 "황금 표준" 외피가 되었습니다.

이 프로토콜18에서는 VSV-G pseudotyped lentiviral 입자를 사용하여 정상 상태19에서 생체 내에서 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 microRNA(miR)를 마우스 복막 Mφ(pMφ)에 표적화하고 효과적으로 전달하는 것을 입증합니다. 전이유전자 발현은 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV) 프로모터에 의해 주도되었습니다. 세포의 생산적 감염은 렌티바이러스 유래의 향상된 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현에 의해 정의되었습니다. 이 접근법을 활용하면 in vivo 렌티바이러스 실험에서 최적의 용량과 실험 기간을 정의하기 위해 쉽게 판독할 수 있었습니다. 마지막으로, 티오글리콜레이트 유발 염증 중 마우스의 생체 내 렌티바이러스 챌린지는 선택적 pMφ 감염에 대한 자연적인 경향을 드러냈습니다.

프로토콜

모든 동물 작업은 기관 및 영국 내무부 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 렌티바이러스에 대한 모든 in vivo 연구는 연구에서 동물의 윤리적 사용에 대한 지역 및 국가 지침에 따라 수행되어야 하며, 카테고리 II 감염 물질의 사용과 관련된 모든 규정을 준수해야 합니다. 동물 복지 또한 현지 규정에 따라 모니터링해야 합니다. 프로토콜의 이 단계에서는 렌티바이러스 입자 및 날카로운 물질로 작업할 때 극도의 주의를 기울여야 합니다.

1. transfection을 위한 HEK293T 세포 준비

참고: 멸균 조직 배양 생물 안전 작업대에서 다음 단계를 수행합니다.

  1. 450mL의 DMEM과 10%(v/v) 태아 송아지 혈청(50mL) 및 최종 농도 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 결합하여 HEK293T 세포를 위한 완전한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(cDMEM)을 준비합니다.
  2. 계획된 transfection 최소 1주일 전에 HEK293T 세포를 해동합니다. 건강한 성장 조건을 유지하고 trypsin + EDTA를 사용하여 플라스크에서 세포를 분리하는 2-3일마다 통과시킵니다.
  3. transfection 하루 전, 세포에서 성장 배지를 조심스럽게 흡인하고 멸균 DPBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 플라스크에 1-5mL의 트립신을 넣고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 2-5분 동안 배양합니다.
  4. 5-10mL의 cDMEM을 추가하고 350 x g 에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 액체를 제거하고 세포 펠릿을 10mL의 cDMEM에 재현탁시킵니다. 세포를 세고 20mL의 cDMEM에서 T175 플라스크당 10-11 x 106 개의 생존 가능한 HEK293T 세포를 파종합니다.
  5. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하여 HEK293T 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 수 있도록 합니다.
  6. 다음 날, 광학 현미경으로 세포의 밀도를 확인합니다.
  7. 세포 단층을 방해하지 않고 25mL 혈청학적 스트리펫으로 플라스크에서 배지를 제거합니다.
  8. DPBS 10mL를 부드럽게 추가하고 플레이트를 흔들어 세포를 세척하고 세포 단층을 방해하지 않도록 주의합니다.
  9. 25mL 혈청학적 스트리펫으로 DPBS를 제거합니다.
  10. 세포 단층을 방해하지 않도록 T175 플라스크당 벽에 15mL의 새 cDMEM을 추가하고 플레이트를 37°C에서 인큐베이터로 되돌립니다.

2. non-liposomal lipid transfection 시약을 사용한 HEK293T 세포의 transfection

  1. 15mL 원심분리 튜브에서 렌티바이러스 성분인 2μg 렌티바이러스 플라스미드, 1.5μg pΔ8.91(pCMV-Δ8.91) 및 1μg pMD2.G(pCMV-MD2.G)를 Buffer EC(Transfection reagent kit)를 사용하여 최종 부피 600μL로 준비합니다.
  2. 36μL의 인핸서 용액을 추가합니다. 1mL 피펫을 사용하여 액체의 일부를 반복적으로 빨아들이고 나머지 용액에 직접 한 방울씩 다시 넣어 구성 요소를 혼합합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 그대로 둡니다.
  3. transfection 시약 120μL를 첨가하고 위와 같이 약 20회 혼합합니다. RT에서 10분 동안 배양합니다.
  4. 5.2mL의 cDMEM을 추가하고 위와 같이 5mL의 혈청학적 스트리펫과 혼합합니다.
  5. 일회용 전사 피펫을 사용하여 transfection 혼합물을 HEK293T 세포 단층에 직접 적하하여(플라스크 벽을 피하고) 혼합물을 플라스크의 다른 지점에 펴 바릅니다.
  6. 플라스크를 좌우로 부드럽게 흔들어 플라스미드를 분포시킵니다. 플라스크 뚜껑에 액체가 들어가지 않도록 하십시오.
  7. 플라스크를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 배양합니다. 세포 이미징 형광 현미경으로 transfection을 모니터링한 후 24시간 이내에 형광 마커(여기서는 GFP)의 출현으로 HEK293T 세포의 효과적인 transfection을 확인합니다.
    참고: 형광 마커가 없는 구조체의 경우, 사용된 마커 유전자의 존재 여부를 검사하거나 적절한 기술(예: qPCR)에 의한 관심 유전자/단백질의 발현 변화에 의해 HEK293T 세포를 테스트해야 합니다. 또는, 성공적인 transfection은 위의 기법에 의해 프로토콜의 후기 단계에서 Jurkat 세포에 대한 렌티바이러스 수집을 테스트하는 동안 간접적으로 검증될 수 있습니다.
    주의: 형질주입된 HEK293T 세포는 감염성이 있는 것으로 간주되며, 이러한 세포를 취급할 때는 적절한 안전 예방 조치를 취해야 합니다. 현지 규칙을 따라야 하며, 여기에는 일반적으로 카테고리 II 생물학 안전 캐비닛에서 작업, 이중 장갑 사용, 소독을 위한 적절한 오염 제거 용액(예: 폐기물 표백제(2,000ppm) 농도 증가 또는 기관 생물 안전 지침에 따른 동등한 용액)이 포함될 수 있습니다. 렌티바이러스 제제와 접촉하는 모든 용액 및 플라스틱은 기관의 생물안전 절차에 따라 소독해야 합니다.

3. 렌티바이러스 입자 수집

  1. 오염 제거 용액, 고농도(2,000ppm) 표백제(차아염소산나트륨) 용액 또는 기관 생물 안전 지침에 따라 이에 상응하는 약제를 양동이에 준비하여 생물학 안전 캐비닛에 넣습니다.
  2. 빈 튜브 랙 등과 같은 과도한 품목을 제거하여 생물학 안전 캐비닛을 준비합니다.
  3. T175 HEK293T 세포 플라스크에 따라 50mL 원심분리기 튜브에 사전 라벨을 부착하고 원심분리기 튜브에서 뚜껑을 제거합니다. 튜브를 안정적인 랙에 놓습니다.
  4. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 488nm 레이저가 장착된 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인합니다(그림 1A). 신호의 강도는 절차와 사용된 구조체의 transfection 효율성에 따라 달라집니다.
  5. 세포의 배지를 사전 라벨링된 50mL 원심분리 튜브로 수집합니다. 형질주입된 세포로 T175 HEK293T 플라스크를 기울여 배지가 플라스크의 하단 모서리에 모이도록 합니다. 25mL 혈청학적 스트리펫을 사용하여 세포 단층을 방해하지 않고 배지를 수집합니다. 이 시점에서 일부 부동 셀이 표시될 수 있습니다. 배지를 깨끗한 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 뚜껑을 닫습니다.
    1. 25mL의 혈청학적 스트리펫을 사용하여 플라스크에 신선하고 따뜻한 cDMEM 25mL를 추가합니다. 세포 단층을 방해하지 않도록 매체 흐름이 플라스크 벽에 향하도록 하십시오. transfection된 HEK293T 세포가 있는 플라스크를 인큐베이터(37°C, 5%CO2)로 되돌립니다.
      참고: 렌티바이러스의 두 번째 채취 및 추가 정제는 위 단계에 설명된 절차에 따라 추가 24시간 후에 수행할 수 있습니다.
  6. 24시간 또는 48시간 후에 렌티바이러스 수집이 완료되면 세포에 오염 제거 용액을 추가하여 세포 단층을 덮도록 합니다. 다음 24시간 동안 플라스크를 수평으로 유지한 다음 적절한 카테고리 II 규정에 따라 폐기하십시오.

4. 렌티바이러스의 정제

  1. 필터는 3.5 단계에서 매체를 수집합니다.
    1. 50mL 주사기에서 플런저를 제거하고 단백질 결합이 적은 폴리에테르 설폰 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 0.45μm 멸균 필터를 주사기 끝에 삽입합니다. 25mL 혈청학적 스트리펫을 사용하여 3.5.1단계에서 수집된 배지를 주사기에 추가하고 플런저를 부드럽게 되돌립니다.
    2. 플러그를 천천히 밀어 매체를 필터를 통해 새 50mL 원심분리기 튜브로 통과시킵니다. 유량이 크게 감소하면 필터가 위쪽을 향하도록 주사기를 놓고 필터에서 매체를 제거할 수 있을 만큼 플런저를 당겨 빼냅니다.
    3. 주사기의 필터를 새 것으로 조심스럽게 교체하고 사용한 필터를 오염 제거 용액에 폐기하십시오. 중간 여과를 계속합니다. 완료되면 필터를 물에 담그고 주사기에 오염 제거 용액을 채워 필터와 주사기의 오염을 제거합니다.
  2. 온도를 4°C로 설정하여 초원심분리기를 사전 냉각하고 온도가 적응할 수 있도록 뚜껑을 닫습니다.
  3. 20% 자당 용액 3mL(초순수에서 20% w/v, 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균)를 원추형 초원심분리기 튜브의 바닥에 추가합니다.
  4. 25mL 혈청학적 스트리펫을 사용하여 여과된 배지를 자당 층 위에 오버레이하고 층을 방해하지 않도록 주의합니다.
    1. 피펫 보이에서 가장 낮은 속도 설정을 사용하십시오. 원뿔형 초원심분리기 튜브의 각도를 약 45°로 조정하고 4.1단계에서 여과된 렌티바이러스 함유 배지를 튜브 벽에 천천히 추가합니다. 매체와 자당이 혼합되지 않고 층의 명확한 분리가 보이는지 확인하십시오(그림 1B). 중간 층의 부피가 증가함에 따라 초원심분리기 튜브를 다시 수직 위치로 천천히 기울입니다.
  5. 초원심분리기 튜브의 자당과 배지를 포함한 총 부피가 29mL 미만인 경우 회전 중에 튜브가 무너지지 않도록 새 cDMEM을 보충합니다. 여러 T175 mL 수집의 경우 여과된 배지 제제를 혼합하고 여러 개의 초원심분리기 튜브를 사용하십시오. 필요에 따라 최종 초원심분리기 튜브에 매체를 충전합니다.
  6. 초원심분리기 버킷이 깨끗한지 확인하십시오. 양동이나 캡의 바닥에 매체 잔류물이 없습니다. 필요한 경우 ~70% 알코올로 닦아내십시오. 각 버킷의 바닥에 적절한 튜브 어댑터를 넣고(그림 1C) 초원심분리기 튜브를 버킷 안으로 부드럽게 내립니다.
  7. 버킷을 단단히 닫고 스핀아웃 로터의 할당된 공간에 걸어둡니다.
  8. 버킷이 동일한 양의 자당과 매체로 균형을 이루는지 확인하십시오. 스핀아웃 로터는 버킷 없이 작동해서는 안 되지만, 반대쪽 버킷은 비어 있을 수 있습니다20 (그림 1D).
  9. 로터를 초원심분리기에 조심스럽게 삽입하고 진공을 켭니다. 초원심분리기 가속 및 감속 속도를 가장 낮게 설정하고 렌티바이러스 전처리를 85,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 실행합니다.
  10. 초원심분리기가 필요한 속도(약 3-5분)에 도달할 때까지 기다렸다가 로터가 제대로 삽입되고 회전이 종료되지 않는지 확인합니다.
  11. 초원심분리기가 작동하는 동안 카테고리 II 안전 요구 사항에 따라 작업 공간을 청소하고 다음 단계를 위한 공간을 준비합니다.
  12. 회전이 끝나면 진공을 비활성화하고 샘플을 방해하지 않도록 로터를 조심스럽게 제거합니다.
  13. 초원심분리기에 유출물이 있는지 조사하고 버킷에서 누출이 없는지 확인합니다. 유출된 경우 이중 장갑을 끼고 원심분리기와 버킷의 외부 표면을 항바이러스 제품으로 오염을 제거하십시오.
  14. 초원심분리기에서 버킷을 제거하고 버킷을 카테고리 II 생물학 안전 작업대로 조심스럽게 운반합니다.
    참고: 렌티바이러스 입자는 초원심분리기 튜브의 바닥에 모입니다. 펠릿은 육안으로 볼 수 없습니다.
  15. 자당과 매체를 한 번의 부드러운 동작으로 오염 제거 용액과 함께 폐기물 용기에 직접 붓습니다.
  16. 초원심분리기 튜브를 거꾸로 뒤집은 상태에서 조직의 이중층으로 옮기고 10분 동안 건조시킵니다. 그동안 물에 적신 티슈로 양동이 내부를 닦고 거꾸로 자연 건조시킵니다.
  17. 초원심분리기 튜브 가장자리에 남아 있는 액체를 티슈로 조심스럽게 건조시킨 후 똑바로 세웁니다. 조직과 그 아래 표면을 소독합니다.
  18. 추가 실험에 필요한 무혈청 배지 또는 용액 1mL에 바이러스 펠릿을 현탁시킵니다. 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 추가 실험에 필요합니다. 카테고리 II 생물학 안전 캐비닛 내부의 RT에서 15분 동안 그대로 두십시오.
  19. 1.5mL 스크류 탑 튜브(예: 크라이오튜브)에 분취하기 전에 1mL 피펫을 사용하여 렌티바이러스 제제를 부드럽게 혼합합니다. in vivo 작업(100 μL의 다중성) 및 Jurkat T 세포(1 x 20 μL)에서 렌티바이러스 역가를 위한 부분 표본을 준비합니다(5단계 참조).
  20. 동결-해동 주기를 피하십시오. 렌티바이러스 제제는 감염성에 부정적인 영향을 미치지 않고 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

5. Jurkat T 세포의 렌티바이러스 생산 적정

  1. 500mL의 RPMI-1640에 10%(v/v) 태아 송아지 혈청을 보충하고 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신의 최종 농도를 보충하여 Jurkat T 세포를 위한 완전한 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(cRPMI-1640)를 준비합니다.
  2. Jurkat T 세포의 건강한 배양을 보장하기 위해 감염 전 최대 1주일 동안 세포를 배양 상태로 유지하십시오.
  3. 렌티바이러스 적정 당일, cRPMI-1640 웰당 200 μL의 2 x 105 세포/웰로 24웰 플레이트에 생존 가능한 Jurkat T 세포를 플레이트링합니다.
  4. 갓 채취한 렌티바이러스를 사용하거나 20μL가 함유된 렌티바이러스 바이알을 얼음 위에서 해동하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
  5. cRPMI-1640에서 연속 희석을 사용하여 0.25 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2.5 μL, 5 μL 및 10 μL의 렌티바이러스 스톡으로 Jurkat T 세포를 감염시킵니다. 렌티바이러스가 균등하게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 감염되지 않은 Jurkat T 세포는 음성 대조군 역할을 합니다.
  6. 37 °C에서 플레이트를 배양합니다. 4시간 후 각 웰에 cRPMI를 총 400μL까지 보충합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 3일 동안 다시 넣습니다.
  7. 감염 후 48시간 후 형광 이미징 시스템에서 GFP 발현을 확인합니다.
  8. 감염 3일 후, 24웰 플레이트의 각 웰을 별도의 1.5mL 수집 튜브에 모으고 세포를 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
  9. 상층액을 버립니다. DPBS에서 2%(w/v)로 준비된 2% 파라포름알데히드(PFA) 300μL에 펠릿을 재현탁시키고 어두운 얼음 위에서 15분 동안 그대로 둡니다.
  10. 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 세포를 원심분리하고 펠릿을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting) 완충액(멸균 DPBS + 4% FCS + 1mM 멸균 EDTA)에 재현탁시킵니다.
  11. 유세포 분석을 사용하여 감염된 렌티바이러스 및 그 대조 세포의 GFP 발현 빈도와 평균 형광 강도를 분석합니다(그림 2).

6. 조직 상주 복막 대식세포의 생체 내 렌티바이러스 감염

  1. 카테고리 II 생물 안전 작업대에서 필요한 양의 렌티바이러스가 포함된 총 200μL의 무혈청 배지 배지를 인슐린 바늘에 로드합니다(일회용 바늘 사용, 동물 복지 및 바늘의 체액 손실을 방지하기 위해 30G).
  2. 한 손으로 떠서 먹는 기법을 사용하여 바늘 칼집을 바늘에 다시 놓습니다. 바늘을 얼음 위에 놓고 30분 이내에 주입하십시오.
  3. 동물 시설에서 주사 전에 카테고리 II 생물 안전 캐비닛을 설정합니다(그림 1E).
    1. 깨끗한 티슈 한 장을 깔아줍니다. 렌티바이러스가 들어있는 인슐린 바늘의 칼집을 풉니다.
    2. 작은 조직 조각과 클로르헥시딘 글루코네이트 기반 소독제가 들어 있는 페트리 접시, 오염 제거 용액(2,000ppm 표백제 용액)이 들어있는 50mL 튜브 및 날카로운 안전 용기를 준비합니다.
  4. 목덜미21의 피부를 잡고 마우스를 제지합니다. 적절하게 구속된 마우스는 움직이지 않으며 이는 안전을 위해 필요합니다.
  5. 복부가 위를 향하게 하여 동물의 머리를 약간 아래로 향하게 합니다. 렌티바이러스를 복강내 내 복강의 오른쪽 아래 사분면에 주입합니다. 이는 복막강 장기에 주사하는 것을 피하기 위함입니다.
  6. 마우스를 놓기 전에 주사기에 오염 제거 용액을 채우고 날카로운 안전 상자에 안전하게 폐기하십시오.
  7. 소독제에 적신 조직으로 쥐의 복부에 있는 주사 부위를 닦고 동물을 케이지로 되돌려 보냅니다.
  8. 렌티바이러스가 주입된 마우스를 카테고리 II 스캔테이너 또는 개별 환기 케이지(IVC)(고효율 공기 여과 기능이 있는 격리 케이지)에 주입 후 최소 72시간 동안 보관합니다. 케이지 앞면에 적절한 정보 카드를 놓습니다.
  9. 감염 후 72시간 후에 현지 안전 승인에 따라 마우스를 새로운 범주 I 홀딩 케이지로 이동합니다. 주입 후 총 3일 동안 매일 마우스를 모니터링합니다.

7. 렌티바이러스에 감염된 쥐의 복막 세포 수집

주의: 렌티바이러스 주입 후 72시간 이내에 채취한 경우, 기관 카테고리 II 생물학적 안전 규칙을 따르십시오. 렌티바이러스 주입 후 처음 72시간 동안 감염된 동물이 보관된 침구 및 보관 케이지는 기관 카테고리 II 생물학적 안전 규칙에 따라 오염을 제거해야 합니다.

  1. 예를 들어, 증가하는 CO2 농도를 흡입한 후 자궁경부 탈구에 의한 사망 확인을 통해 제도적 규정에 따라 마우스를 안락사시킵니다.
  2. 70% 이소프로판올로 쥐의 복부를 청소하고 피부를 조심스럽게 잘라 복막이 노출되도록 합니다.
  3. 10mL 주사기와 23G 바늘을 사용하여 6mL의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액으로 복막강을 세척합니다. 장기에 구멍을 뚫지 마십시오.
  4. 복막을 부드럽게 마사지하여 세포를 FACS 완충액으로 제거합니다.
  5. 동일한 주사기와 바늘을 사용하여 복막액을 채취합니다.
  6. 바늘을 제거하고 세포를 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  7. 복막 세척을 얼음 위에 두십시오.
  8. 기타 필요한 장기를 수집하여 연구에 적합하게 보관합니다.
  9. 지역 동물 및 안전 지침에 따라 동물 사체를 처리하십시오.

8. 복막 세포 염색 및 분석

  1. 복막 세척액을 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 원심분리하고, 오염 제거 용액에서 상층액을 버리고, 세포를 1mL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다.
  2. 수집된 세포를 계산하고 V-바닥 96웰 플레이트에서 웰당 4 x 105 셀을 플레이트합니다.
  3. 제조업체 지침에 따라 고정성 시약(예: 여기에 사용된 Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit)을 사용하여 생존도 염색을 수행합니다.
  4. 세포가 지난 72시간 이내에 감염된 경우 얼음에서 15분 동안 2% PFA에 세포를 고정합니다. 동일한 양의 차가운 DPBS를 추가하고 4°C에서 350 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
  5. 차단 완충액 준비: 표면 염색을 위해 FACS 완충액의 10%(v/v) 랫트 혈청에 4μg/mL 2.4G2 항체를 혼합하거나 세포 내 염색을 위해 투과성 완충액을 혼합합니다.
  6. 세포 펠릿이 포함된 각 웰을 50μL의 차단 완충액에 재현탁시키고 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
  7. 각 샘플당 50μL의 FACS 완충액(표면 염색용) 또는 투과성 완충액(세포 내 염색용)에 항체 혼합물을 준비합니다. 각 샘플의 최종 염색량은 50μL의 차단 완충액을 포함하여 100μL입니다. 이에 따라 항체 농도를 계산한다(표 1).
  8. 시료에 50 μL의 항체 혼합물을 추가하고 대조군에 50 μL의 isotype 대조군 및 대조군 완충액을 첨가하여 대조군에 첨가합니다. 어두운 얼음 위에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 필요에 따라 염색되지 않은 세포와 isotype 컨트롤을 포함합니다.
  9. 100-200 μL의 얼음처럼 차가운 DPBS로 각각을 잘 세척하고 플레이트를 350 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 이 단계를 반복하여 결합되지 않은 항체를 씻어냅니다. 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다.

9. 장기에서 세포 추출

  1. 장기당 1mL의 분해 혼합물 준비: Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 2mg/mL 콜라겐분해효소 IV형 및 0.03mg/mL DNase I(폐 소화를 위한 히알루로니다제 1.5mg/mL 포함)을 혼합합니다.
  2. 채취한 장기를 분해 믹스 1mL에 옮기고 가위로 다진다.
  3. 40μm 스트레이너와 원심분리기를 통해 4°C에서 350 x g , 5분 동안 세포를 여과합니다.
  4. 폐, 비장 또는 간에서 세포를 분리하는 경우 ACK 용해 완충액(150mMNH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mMNa2EDTA pH = 7.4)을 사용하여 적혈구를 용해합니다. 40μm 스트레이너와 원심분리기를 통해 4°C에서 350 x g , 5분 동안 세포를 여과합니다.
  5. 섹션 8에 설명된 대로 세포를 염색하고 분석합니다.

결과

이 프로토콜을 완전하고 정확하게 따를 경우, 단일 제제당 총 1.5mL의 고품질 렌티바이러스 스톡을 생성하며, 이는 이 연구에서 결정된 최적의 부피로 12회의 in vivo 주사에 충분합니다18. transfection의 성공 여부는 프로토콜 초기에 평가할 수 있습니다. 건강하고 융합된 HEK293T 세포는 플라스미드에 존재하는 경우 플라스미드 transfection 후 48시간 후에 ?...

토론

조직에 상주하는 대식세포는 생리적 환경6,7,8,9에 의해 좌우되는 다양한 항상성 및 염증성 조직 특이적 기능(1,2)을 수행한다. 이 프로토콜에서는 렌티바이러스 입자를 사용하여 생체 내에서 복막 상주 대식세포를 조작하는 ?...

공개

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]의 지원을 받았습니다. P.R.T는 영국 치매 연구소(UK Dementia Research Institute)의 지원도 받고 있습니다. MAC는 Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship(BB/T009543/1)의 지원을 받습니다. 오픈 액세스를 위해, 저자는 이 제출물로 인해 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 CC BY 공개 저작권 라이선스를 적용했습니다. L.C.D는 스완지 대학교의 강사이자 카디프 대학교의 명예 연구원입니다. 이 작업은 Ipseiz et al. 202018에서 수행한 작업에 의해 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μm sterile millex GP filterMerckSLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filterMerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)BD324892
1 Litre Sharps ContainerN/AN/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μm strainerThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax SupplementThermo Fisher Scientific31035025
Blocking bufferprepared in house
Brewer thioglycolate mediumSigma-AldrichB25514% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11bBiolegend101222Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11bBD550993Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117317Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117333Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19BD560375Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19Biolegend152410Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226Biolegend128808Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBD560527Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBiolegend152313Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4Biolegend100412Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73eBioscience16-0731-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8aeBioscience48-0081-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mmBeckman Coulter358126
CentrifugesBeckman CoulterUltracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IVSigma-AldrichC5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene transfection reagentQiagen301425
F4/80Biolegend123123Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123133Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123147Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1eBioscience48-5898-80Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometerThermo Fisher Scientific Attune NxT
Flow cytometry (FACS) bufferprepared in house
Fluorescent tissue culture microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
ForcepsN/AN/AUser preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T cell linegrown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigenBeckman Coulter6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanserEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1Becton Dickinson554970Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell linegrown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kitThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Micehere used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gprepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmidZuffrey, R., et al. 1997encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dishGreiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmidRosas, M. et al. 2014modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmidNaldini, L. et al. 1996encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype controlBecton Dickinson550617Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serumSigma-AldrichR9759-10ML
Red blood ACK lysis bufferprepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamineThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
Sterile 24-well cell culture plateGreiner Bio One662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - freeThermo Fisher Scientific14190144
Sterile EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)VWR612-4515
SucroseThermo Fisher Scientific15503022
surgical scissorsN/AN/AUser preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plateGreiner Bio One650180

참고문헌

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