생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

요약

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

초록

복막 조직에 상주하는 대식세포는 항상성 유지에 광범위한 기능을 하며 국소 및 인접 조직 내의 병리학에 관여합니다. 그들의 기능은 미시 환경 단서에 의해 결정됩니다. 따라서 생체 내 생리학적 틈새에서 그들의 행동을 조사하는 것이 필수적입니다. 현재 특정 복막 대식세포 표적화 방법론은 전체 마우스 형질전환 모델을 사용합니다. 여기에서는 렌티바이러스 입자를 이용한 복막 대식세포에서 mRNA 및 small RNA 종(예: microRNA) 발현의 효과적인 in vivo 조절을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 렌티바이러스 제제는 HEK293T 세포에서 제조하고 단일 슈크로스 층에서 정제하였다. 복강내 주사 후 렌티바이러스 효과에 대한 in vivo 검증에서 국소 조직에 국한된 대식세포의 우세한 감염이 밝혀졌습니다. 복막 대식세포의 표적화는 항상성 및 티오글리콜레이트 유발 복막염 동안 성공적이었습니다. 렌티바이러스의 복강 내 전달에 의해 유발되는 낮은 수준의 염증과 잠재적인 실험을 위한 시간 제한을 포함한 프로토콜의 한계에 대해 논의합니다. 전반적으로 이 연구는 생체 내 복막 대식세포의 유전자 기능을 신속하게 평가하기 위한 빠르고 접근 가능한 프로토콜을 제시합니다.

서문

조직 상주 대식세포(Tissue-resident macrophage, Mφ)는 침입하는 병원체를 감지하고 이에 반응하는 식세포 면역세포의 이질적인 집단입니다 ^1,2. 또한 조직 발달, 리모델링 및 항상성 유지에 필수적인 역할을 합니다 ^1,3. 많은 조직 Mφ는 배아 발생 동안 난황낭 전구 세포에서 파생되며 평생 동안 조직에 남아 있습니다 ^4,5. 이들 세포의 표현형과 기능은 특정 전사 인자와 국소 미세환경 ^6,7,8,9의 협력적이고 계층적인 상호작용에 의해 결정된다. 이러한 의존성에 대한 이해가 증가함에 따라 생리학적으로 관련된 틈새 내에서 Mφ의 유전자 조작을 위한 효과적인 in viv....

프로토콜

모든 동물 작업은 기관 및 영국 내무부 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 렌티바이러스에 대한 모든 in vivo 연구는 연구에서 동물의 윤리적 사용에 대한 지역 및 국가 지침에 따라 수행되어야 하며, 카테고리 II 감염 물질의 사용과 관련된 모든 규정을 준수해야 합니다. 동물 복지 또한 현지 규정에 따라 모니터링해야 합니다. 프로토콜의 이 단계에서는 렌티바이러스 입자 및 날카로운 물질로 작업할 때 극도의 주의를 기울여야 합니다.

1. transfection을 위한 HEK293T 세포 준비

참고: 멸균 조직 배양 생물 안전 작업대에서 다음 단계를 수행합니다.

1. 450mL의 DMEM과 10%(v/v) 태아 송아지 혈청(50mL) 및 최종 농도 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 결합하여 HEK293T 세포를 위한 완전한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(cDMEM)을 준비합니다.
2. 계획된 transfection 최소 1주일 전에 HEK293T 세포를 해동합니다. 건강한 성장 조건을....

토론

조직에 상주하는 대식세포는 생리^{적 환경6,7,8,9}에 의해 좌우되는 다양한 항상성 및 염증성 조직 특이적 기능^(1,2)을 수행한다. 이 프로토콜에서는 렌티바이러스 입자를 사용하여 생체 내에서 복막 상주 대식세포를 조작하는 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm sterile millex GP filter	Merck	SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm strainer	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	prepared in house
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b	Biolegend	101222	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b	BD	550993	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117317	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117333	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	BD	560375	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	Biolegend	152410	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226	Biolegend	128808	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	BD	560527	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	Biolegend	152313	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4	Biolegend	100412	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123133	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123147	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A	User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cell line			grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line			grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice			here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid		Naldini, L. et al. 1996	encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer	prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-well cell culture plate	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
surgical scissors	N/A	N/A	User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180