マウスにおける腹腔組織常在マクロ ファージの 効率的な遺伝子およびマイクロRNA調節のためのレンチウイルスベクター調製

要約

私たちは、レンチウイルスベクターを使用して、 in vivoで腹膜組織に常在するマクロファージの遺伝子機能を調べるための段階的なプロトコルを示します。

要約

腹膜組織に常在するマクロファージは、恒常性の維持に広範な機能を持ち、局所組織および隣接組織内の病状に関与しています。それらの機能は、微小環境の手がかりによって決定されます。したがって、 in vivo の生理学的ニッチにおける彼らの行動を調査することが不可欠です。現在、特定の腹膜マクロファージターゲティング方法論は、マウス全体のトランスジェニックモデルを採用しています。ここでは、レンチウイルス粒子を用いて腹膜マクロファージにおけるmRNAおよびsmall RNA種(例えば、microRNA)発現の効果的な in vivo 調節のためのプロトコルについて説明します。レンチウイルス製剤はHEK293T細胞で作製し、単一のスクロース層で精製しました。腹腔内注射後のレンチウイルスの有効性の in vivo 検証により、局所組織に限定されたマクロファージの主な感染が明らかになりました。腹膜マクロファージの標的化は、ホメオスタシスおよびチオグリコール酸誘発性腹膜炎において成功しました。レンチウイルスの腹腔内送達によって誘発される低レベルの炎症や、潜在的な実験の時間制限など、プロトコルの限界について説明します。全体として、この研究は、 in vivo の腹膜マクロファージにおける遺伝子機能を迅速に評価するための迅速でアクセス可能なプロトコルを示しています。

概要

組織常在性マクロファージ(Mφ)は、侵入する病原体を感知して応答する食作用免疫細胞の不均一な集団です^1,2。さらに、それらは組織の発達、リモデリング、および恒常性の維持において重要な役割を果たします^1,3。多くの組織Mφは、胚形成中に卵黄嚢前駆細胞に由来し、生涯を通じて組織に持続します^4,5。これらの細胞の表現型と機能は、特定の転写因子と局所微小環境との協調的および階層的な相互作用によって決定される6,7,8,9。この依存性についての理解が深まるにつれ、生理学的に重要なニッチ内でMφを遺伝子操作するための効果的なin vivo法の必要性が高まっています。

レンチウイルスベクターは、i....

プロトコル

すべての動物の作業は、機関および英国内務省のガイドラインに従って行われました。

注:レンチウイルスを用いたすべての in vivo 研究は、研究における動物の倫理的使用に関する地域および国のガイドラインに従って実施し、カテゴリーIIの感染性物質の使用に関連するすべての規制を遵守する必要があります。動物福祉も地域の規制に従って監視する必要があります。このステップでは、レンチウイルス粒子や鋭利物を扱う際には細心の注意を払う必要があります。

1. トランスフェクション用HEK293T細胞の調製

注:これらの手順は、滅菌組織培養生物学的安全キャビネットの下で行ってください。

1. 450 mLのDMEMを10%(v / v)のウシ胎児血清(50 mL)および最終濃度100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシンと組み合わせて、HEK293T細胞用の完全なダルベッコ修正イーグル培地(cDMEM)を調製します。
2. 予定されているトランスフェクションの少なくとも1週間前にHEK293T細胞を解凍してください。健康な成長条件を維持し、トリプシン+ EDTAを使用して2〜3日ごとに通過し、フラスコから細胞を分離します。
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ディスカッション

組織に常在するマクロファージは、その生理^学的環境6,7,8,9によって決定されるさまざまな恒常性および炎症性の組織特異的機能^1,2を実行します。このプロトコルでは、レンチウイルス粒子を使用してin vivoで腹膜に常在?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm sterile millex GP filter	Merck	SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm strainer	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	prepared in house
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b	Biolegend	101222	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b	BD	550993	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117317	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117333	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	BD	560375	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	Biolegend	152410	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226	Biolegend	128808	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	BD	560527	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	Biolegend	152313	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4	Biolegend	100412	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123133	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123147	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A	User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cell line			grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line			grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice			here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid		Naldini, L. et al. 1996	encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer	prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-well cell culture plate	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
surgical scissors	N/A	N/A	User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180