Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Özet

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Özet

Periton dokusunda yerleşik makrofajlar, homeostazın sürdürülmesinde geniş işlevlere sahiptir ve lokal ve komşu dokulardaki patolojilerde rol oynarlar. İşlevleri mikro-çevresel ipuçları tarafından belirlenir; Bu nedenle, davranışlarını in vivo fizyolojik bir niş içinde araştırmak önemlidir. Şu anda, spesifik peritoneal makrofaj hedefleme metodolojileri, tüm fare transgenik modellerini kullanmaktadır. Burada, lentivirüs partikülleri kullanılarak peritoneal makrofajlarda mRNA ve küçük RNA türlerinin (örneğin, mikroRNA) ekspresyonunun etkili in vivo modülasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Lentivirüs preparatları HEK293T hücrelerde yapıldı ve tek bir sükroz tabakası üzerinde saflaştırıldı. İntraperitoneal enjeksiyonu takiben lentivirüs etkinliğinin in vivo olarak doğrulanması, lokal dokuya sınırlı makrofajların baskın enfeksiyonunu ortaya çıkardı. Peritoneal makrofajların hedeflenmesi homeostaz ve tiyoglikolat ile indüklenen peritonit sırasında başarılı olmuştur. Lentivirüsün intraperitoneal verilmesinin neden olduğu düşük seviyeli inflamasyon ve potansiyel deneyler için zaman kısıtlamaları dahil olmak üzere protokolün sınırlamaları tartışılmaktadır. Genel olarak, bu çalışma in vivo peritoneal makrofajlarda gen fonksiyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için hızlı ve erişilebilir bir protokol sunmaktadır.

Giriş

Dokuda yerleşik makrofajlar (Mφ), istilacı patojenleri algılayan ve bunlara yanıt veren heterojen bir fagositik bağışıklık hücresi popülasyonudur ^1,2. Ek olarak, doku gelişiminde, yeniden şekillenmede ve homeostazın korunmasında önemli bir rol oynarlar ^1,3. Birçok doku Mφ, embriyogenez sırasında yolk kesesi progenitörlerinden türetilir ve yaşam boyunca dokuda kalır ^4,5. Bu hücrelerin fenotipi ve işlevleri, spesifik transkripsiyon faktörlerinin ve yerel mikro çe....

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Kurumsal ve Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.

NOT: Lentivirüs ile yapılan tüm in vivo çalışmalar, araştırmada hayvanların etik kullanımına ilişkin yerel ve ulusal yönergelere göre ve ayrıca kategori II bulaşıcı materyallerin kullanımıyla ilgili tüm düzenlemelere bağlı kalarak yapılmalıdır. Hayvan refahı da yerel düzenlemelere uygun olarak izlenmelidir. Protokolün bu adımında, lentiviral partiküller ve kesici aletlerle çalışırken çok dikkatli olunması gerekir.

1. Transfeksiyon için HEK293T hücreleri....

Tartışmalar

Dokuda yerleşik makrofajlar, fizyolojik çevreleri ^6,7,8,9 tarafından belirlenen bir dizi homeostatik ve inflamatuar dokuya özgü işlevi ^1,2 yerine getirir. Bu protokolde, peritoneal yerleşik makrofajların lentivirüs partikülleri kullanılarak in vivo olarak manipülasyonu için etkili .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm sterile millex GP filter	Merck	SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm strainer	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	prepared in house
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b	Biolegend	101222	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b	BD	550993	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117317	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117333	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	BD	560375	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	Biolegend	152410	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226	Biolegend	128808	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	BD	560527	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	Biolegend	152313	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4	Biolegend	100412	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123133	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123147	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A	User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cell line			grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line			grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice			here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid		Naldini, L. et al. 1996	encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer	prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-well cell culture plate	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
surgical scissors	N/A	N/A	User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180