JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Özet

Periton dokusunda yerleşik makrofajlar, homeostazın sürdürülmesinde geniş işlevlere sahiptir ve lokal ve komşu dokulardaki patolojilerde rol oynarlar. İşlevleri mikro-çevresel ipuçları tarafından belirlenir; Bu nedenle, davranışlarını in vivo fizyolojik bir niş içinde araştırmak önemlidir. Şu anda, spesifik peritoneal makrofaj hedefleme metodolojileri, tüm fare transgenik modellerini kullanmaktadır. Burada, lentivirüs partikülleri kullanılarak peritoneal makrofajlarda mRNA ve küçük RNA türlerinin (örneğin, mikroRNA) ekspresyonunun etkili in vivo modülasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Lentivirüs preparatları HEK293T hücrelerde yapıldı ve tek bir sükroz tabakası üzerinde saflaştırıldı. İntraperitoneal enjeksiyonu takiben lentivirüs etkinliğinin in vivo olarak doğrulanması, lokal dokuya sınırlı makrofajların baskın enfeksiyonunu ortaya çıkardı. Peritoneal makrofajların hedeflenmesi homeostaz ve tiyoglikolat ile indüklenen peritonit sırasında başarılı olmuştur. Lentivirüsün intraperitoneal verilmesinin neden olduğu düşük seviyeli inflamasyon ve potansiyel deneyler için zaman kısıtlamaları dahil olmak üzere protokolün sınırlamaları tartışılmaktadır. Genel olarak, bu çalışma in vivo peritoneal makrofajlarda gen fonksiyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için hızlı ve erişilebilir bir protokol sunmaktadır.

Giriş

Dokuda yerleşik makrofajlar (Mφ), istilacı patojenleri algılayan ve bunlara yanıt veren heterojen bir fagositik bağışıklık hücresi popülasyonudur 1,2. Ek olarak, doku gelişiminde, yeniden şekillenmede ve homeostazın korunmasında önemli bir rol oynarlar 1,3. Birçok doku Mφ, embriyogenez sırasında yolk kesesi progenitörlerinden türetilir ve yaşam boyunca dokuda kalır 4,5. Bu hücrelerin fenotipi ve işlevleri, spesifik transkripsiyon faktörlerinin ve yerel mikro çevrenin işbirlikçi ve hiyerarşik etkileşimleri tarafından belirlenir 6,7,8,9. Bu bağımlılığın giderek daha iyi anlaşılması, Mφ'nin fizyolojik olarak ilgili nişleri içinde gen manipülasyonu için etkili in vivo yöntemlere olan ihtiyacı artırmaktadır.

Lentiviral vektörler, özellikle hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte etme ve konakçı genomuna stabil bir şekilde entegre olma yetenekleri nedeniyle, in vivo10,11,12 spesifik hücre popülasyonlarında nükleik asitlerin manipülasyonu için sıklıkla kullanılan bir araçtır13,14. Son yirmi yılda, lentivirüs dağıtım teknolojisi optimize edilmiş ve soya özgü hedeflemeyi artırmak için alternatif zarflar ve sentetik destekleyiciler araştırılmıştır 8,15. Geniş hücre tropizmi nedeniyle, veziküler stomatit virüsü saran glikoprotein (VSV-G)16,17, lentivirüs teknolojisinde kullanılan "altın standart" zarf haline gelmiştir.

Bu protokol18'de, kısa firkete RNA'sının (shRNA) ve mikroRNA'nın (miR) fare peritoneal Mφ'ye (pMφ) in vivo, kararlı durumda19 hedefli ve etkili bir şekilde verilmesini göstermek için VSV-G psödotipli lentiviral partiküller kullanılır. Transgen ekspresyonu, dalak odak oluşturan virüs (SFFV) promotörü tarafından yönlendirildi. Hücrelerin üretken enfeksiyonu, lentivirüs türevli gelişmiş yeşil floresan proteinin (GFP) ekspresyonu ile tanımlandı. Bu yaklaşımın kullanılması, optimal dozu ve deneysel zaman çerçevesini tanımlamak için in vivo lentivirüs deneyleri için kolay okumaya izin verdi. Son olarak, tiyoglikolatın neden olduğu inflamasyon sırasında farelerin in vivo lentiviral mücadelesi, seçici pMφ enfeksiyonu için doğal eğilimi ortaya çıkardı.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Kurumsal ve Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.

NOT: Lentivirüs ile yapılan tüm in vivo çalışmalar, araştırmada hayvanların etik kullanımına ilişkin yerel ve ulusal yönergelere göre ve ayrıca kategori II bulaşıcı materyallerin kullanımıyla ilgili tüm düzenlemelere bağlı kalarak yapılmalıdır. Hayvan refahı da yerel düzenlemelere uygun olarak izlenmelidir. Protokolün bu adımında, lentiviral partiküller ve kesici aletlerle çalışırken çok dikkatli olunması gerekir.

1. Transfeksiyon için HEK293T hücrelerinin hazırlanması

NOT: Bu adımları steril bir doku kültürü biyolojik güvenlik kabini altında gerçekleştirin.

  1. 450 mL DMEM'i% 10 (h / h) fetal buzağı serumu (50 mL) ve 100 U / mL penisilin / streptomisin nihai konsantrasyonu ile birleştirerek HEK293T hücreler için tam Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (cDMEM) hazırlayın.
  2. Planlanan transfeksiyondan en az 1 hafta önce HEK293T hücrelerinin buzunu çözün. Hücreleri şişeden ayırmak için tripsin + EDTA kullanarak sağlıklı yetiştirme koşullarını ve geçişi 2-3 günde bir koruyun.
  3. Transfeksiyondan bir gün önce, büyüme ortamını hücrelerden dikkatlice aspire edin ve hücreleri steril DPBS ile nazikçe yıkayın. Şişeye 1-5 mL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 2-5 dakika inkübe edin.
  4. 5-10 mL cDMEM ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 350 x g'da döndürün. Sıvıyı çıkarın ve hücre peletini 10 mL cDMEM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve 20 mL cDMEM'de T175 şişesi başına 10-11 x10 6 canlı HEK293T hücresi tohumlayın.
  5. HEK293T hücrelerinin %70-80 birleşmeye ulaşmasını sağlamak için gece boyunca %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Ertesi gün, ışık mikroskobu altında hücrelerin birleştiğini onaylayın.
  7. Hücre tek tabakasını bozmadan ortamı 25 mL'lik bir serolojik şerit ile şişeden çıkarın.
  8. Yavaşça 10 mL DPBS ekleyin ve hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek hücreleri yıkamak için plakayı sallayın.
  9. DPBS'yi 25 mL serolojik stripet ile çıkarın.
  10. Hücre tek tabakasını rahatsız etmemek için T175 şişesi başına duvara 15 mL yeni cDMEM ekleyin ve plakayı 37 ° C'de inkübatöre geri koyun.

2. Lipozomal olmayan lipid transfeksiyon reaktifi kullanılarak HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu

  1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, lentiviral bileşenleri hazırlayın: 2 μg lentiviral plazmit, 1.5 μg pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) ve 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) Tampon EC (Transfeksiyon reaktif kiti) ile 600 μL'lik bir nihai hacme kadar.
  2. 36 μL arttırıcı solüsyon ekleyin. Bileşenleri 1 mL'lik bir pipet kullanarak, sıvının bir kısmını tekrar tekrar emerek ve doğrudan kalan çözeltinin üzerine damla damla geri koyarak karıştırın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.
  3. 120 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin ve yukarıdaki gibi yaklaşık 20 kez karıştırın. RT'de 10 dakika inkübe edin.
  4. 5.2 mL cDMEM ekleyin ve yukarıdaki gibi 5 mL serolojik şerit ile karıştırın.
  5. Tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak, transfeksiyon karışımını damla damla doğrudan HEK293T hücrelerinin tek tabakasına (şişe duvarlarından kaçınarak) ekleyin ve karışımı şişenin farklı noktalarına yayın.
  6. Şişeyi bir yandan diğer yana hafifçe sallayarak plazmidi dağıtın. Şişe kapağına herhangi bir sıvı girmesinden kaçının.
  7. Şişeyi 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde 48 saat inkübe edin. Bir hücre görüntüleme floresan mikroskobu altında izlenen transfeksiyondan sonraki 24 saat içinde bir floresan işaretleyicinin, burada GFP'nin ortaya çıkmasıyla HEK293T hücrelerinin etkili transfeksiyonunu onaylayın.
    NOT: Floresan işaretleyicisi olmayan yapılar için, HEK293T hücreleri, kullanılan işaretleyici genin varlığı veya uygun tekniklerle, örneğin qPCR ile ilgilenilen gen/proteindeki ekspresyon değişikliği açısından test edilmelidir. Alternatif olarak, başarılı transfeksiyon, protokolün sonraki aşamalarında Jurkat hücreleri üzerindeki lentivirüs koleksiyonunun test edilmesi sırasında yukarıdaki tekniklerle dolaylı olarak doğrulanabilir.
    DİKKAT: Transfekte edilmiş HEK293T hücreleri bulaşıcı olarak kabul edilir ve bu hücrelerle işlem yapılırken uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. Tipik olarak bir kategori II biyoloji güvenlik kabini altında çalışmayı, çift eldiven kullanımını ve dezenfeksiyon için uygun dekontaminasyon solüsyonunu, örneğin kurumsal biyogüvenlik yönergelerine göre artan atık ağartıcı konsantrasyonu (2.000 ppm) veya eşdeğer çözeltiyi içerebilecek yerel kurallara uyulmalıdır. Lentivirüs preparatı ile temas eden tüm solüsyonlar ve plastikler kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine göre dezenfekte edilmelidir.

3. Lentiviral partiküllerin toplanması

  1. Dekontaminasyon solüsyonu, yüksek konsantrasyonlu (2.000 ppm) bir ağartıcı (sodyum hipoklorit) solüsyonu veya kurumsal biyogüvenlik yönergelerine göre eşdeğer bir ajanı bir kovada hazırlayın ve biyoloji güvenlik kabinine yerleştirin.
  2. Boş tüp rafları vb. gibi fazla öğeleri çıkararak biyoloji güvenlik kabinini hazırlayın.
  3. T175 HEK293T hücreleri şişesi başına 50 mL'lik bir santrifüj tüpünü önceden etiketleyin ve kapağı santrifüj tüpünden çıkarın. Tüpleri sabit bir rafa yerleştirin.
  4. Şişeyi inkübatörden alın ve 488 nm lazerli bir floresan mikroskobu kullanarak GFP ekspresyonunu onaylayın (Şekil 1A). Sinyalin yoğunluğu, prosedürün transfeksiyon verimliliğine ve kullanılan yapılara bağlıdır.
  5. Ortamı hücrelerden önceden etiketlenmiş 50 mL'lik santrifüj tüpüne toplayın. T175 HEK293T şişesini, ortamın şişenin alt köşesinde toplanacak şekilde transfekte edilmiş hücrelerle eğin. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, hücre tek tabakasını rahatsız etmeden ortamı toplayın. Bu noktada bazı yüzen hücreler görünebilir. Ortamı 50 mL'lik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve kapağı kapatın.
    1. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, şişeye 25 mL taze, ılık cDMEM ekleyin. Hücre tek tabakasını rahatsız etmemek için orta akışını şişenin duvarlarına yönlendirdiğinizden emin olun. Transfekte edilmiş HEK293T hücreli şişeyi inkübatöre geri koyun (37 °C,% 5 CO2).
      NOT: Yukarıdaki adımlarda belirtilen prosedürü takiben 24 saat daha sonra ikinci bir lentivirüs koleksiyonu ve daha fazla saflaştırma gerçekleştirilebilir.
  6. Lentivirüs toplama işlemi 24 saat veya 48 saat sonra tamamlandığında, hücrelere dekontaminasyon solüsyonu ekleyin ve hücre tek tabakasını kapladığından emin olun. Şişeyi sonraki 24 saat boyunca yatay tutun, ardından uygun kategori II düzenlemelerine göre atın.

4. Lentivirüsün saflaştırılması

  1. Adım 3.5'ten itibaren filtre toplama ortamı.
    1. Pistonu 50 mL şırıngadan çıkarın ve şırınga ucuna düşük protein bağlayıcı polieter sülfon veya poliviniliden florür 0.45 μm steril filtre yerleştirin. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, toplanan ortamı adım 3.5.1'den şırıngaya ekleyin ve pistonu yavaşça geri koyun.
    2. Ortamı filtreden 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne geçirmek için tapayı yavaşça itin. Akış önemli ölçüde azalırsa, şırıngayı filtre yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve ortamı filtreden temizlemek için pistonu yeterince dışarı çekin.
    3. Şırınga üzerindeki filtreyi dikkatlice yenisiyle değiştirin ve kullanılmış filtreyi dekontaminasyon solüsyonuna atın. Orta filtrasyona devam edin. Bittiğinde, filtreyi suya batırarak ve şırıngayı dekontaminasyon solüsyonu ile doldurarak filtreyi ve şırıngayı dekontamine edin.
  2. Sıcaklığı 4 °C'ye ayarlayarak ultrasantrifüjü önceden soğutun ve sıcaklığın alışmasını sağlamak için kapağı kapatın.
  3. Konik ultrasantrifüj tüpünün dibine 3 mL %20 sükroz çözeltisi (ultra saf suda %20 w/v, filtre 0.22 μm filtre kullanılarak sterilize edilmiştir) ekleyin.
  4. 25 mL'lik bir serolojik şerit kullanarak, katmanları rahatsız etmemeye dikkat ederek sakaroz tabakasının üzerine filtrelenmiş ortamı kaplayın.
    1. Pipet çocuğundaki en düşük hız ayarını kullanın. Konik ultrasantrifüj tüpünü yaklaşık 45 ° C'ye getirin ve filtrelenmiş lentivirüs içeren ortamı adım 4.1'den tüp duvarına yavaşça ekleyin. Ortam ve sükrozun karışmadığından ve katmanların net bir şekilde ayrıldığından emin olun (Şekil 1B). Orta tabakanın hacmi arttıkça, ultrasantrifüj tüpünü yavaşça dik konuma geri eğin.
  5. Ultrasantrifüj tüpündeki sükroz ve ortam dahil toplam hacim 29 mL'den azsa, sıkma sırasında tüpün çökmesini önlemek için taze cDMEM ile doldurun. Birden fazla T175 mL koleksiyonu için, filtrelenmiş ortam preparatlarını karıştırın ve birden fazla ultrasantrifüj tüpü kullanın. Son ultrasantrifüj tüpünü gerektiği gibi ortamla doldurun.
  6. Ultrasantrifüj kovalarının temiz olduğundan emin olun; Kovanın dibinde veya kapaklarında orta kalıntı yoktur. Gerekirse ~%70 alkol ile silin. Her kovanın dibine uygun tüp adaptörleri koyun (Şekil 1C) ve ultrasantrifüj tüplerini yavaşça kovalara indirin.
  7. Kovaları güvenli bir şekilde kapatın ve döndürme rotorunda ayrılan boşluklara asın.
  8. Kovaların aynı hacimlerde sakaroz ve orta ile dengelendiğinden emin olun. Karşılıklı kovalar boş bırakılabilmesine rağmen, bir döner rotor asla kovalar olmadan çalıştırılmamalıdır20 (Şekil 1D).
  9. Rotoru dikkatlice ultrasantrifüje yerleştirin ve vakumu açın. Ultrasantrifüj hızlanma ve yavaşlama oranını en düşük ayara getirin ve lentivirüs preparatlarını 85.000 x g'da 90 ° C'de 4 dakika boyunca çalıştırın.
  10. Rotorun düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden ve dönüşün sona ermeyeceğinden emin olmak için uzaklaşmadan önce ultrasantrifüjün gerekli hıza (yaklaşık 3-5 dakika) ulaşmasını bekleyin.
  11. Ultrasantrifüj çalışırken, çalışma alanını kategori II güvenlik gereksinimlerine göre temizleyin ve alanı sonraki adımlar için hazırlayın.
  12. Sıkma işlemi bittiğinde, vakumu devre dışı bırakın ve numuneleri rahatsız etmemek için rotoru dikkatlice çıkarın.
  13. Ultrasantrifüjde herhangi bir dökülme olup olmadığını araştırın ve kovalarda sızıntı olmadığını doğrulayın. Dökülme durumunda, çift eldiven ile santrifüjü ve kovaların dış yüzeyini antiviral ürünlerle dekontamine edin.
  14. Kovaları ultrasantrifüjden çıkarın ve kovaları dikkatlice kategori II biyoloji güvenlik kabinine taşıyın.
    NOT: Lentivirus parçacıkları ultrasantrifüj tüpünün dibinde toplanır. Pelet çıplak gözle görülemez.
  15. Sükroz ve besiyerini tek bir yumuşak hareketle doğrudan dekontaminasyon solüsyonu ile birlikte atık kabına dökün.
  16. Ultrasantrifüj tüpünü ters çevirerek, çift doku tabakasına aktarın ve 10 dakika kurumaya bırakın. Bu arada, kovaların içini suya batırılmış mendille silin ve baş aşağı havayla kurutun.
  17. Ultrasantrifüj tüpünün kenarından kalan sıvıyı dik konuma getirmeden önce doku ile dikkatlice kurulayın. Dokuyu ve altındaki yüzeyi dezenfekte edin.
  18. Virüs peletini 1 mL serumsuz ortamda veya çözeltiyi yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek daha fazla deney için gereken çözeltide yeniden süspanse edin. Kategori II biyoloji güvenlik kabininin içindeki RT'de 15 dakika bekletin.
  19. Lentivirüs preparatlarını 1.5 mL'lik vidalı tüplere (örn., kriyotüpler) ayırmadan önce 1 mL pipet kullanarak nazikçe karıştırın. Alikotları in vivo çalışma (100 μL'lik çokluk) ve Jurkat T hücrelerinde (1 x 20 μL) lentivirüs titresi için hazırlayın (bkz. adım 5).
  20. Donma-çözülme döngülerinden kaçının; lentiviral preparatlar, bulaşıcılık üzerinde olumsuz bir etki olmaksızın -80 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir.

5. Jurkat T hücrelerinde lentivirüs üretiminin titrasyonu

  1. 500 mL RPMI-1640'ı %10 (h/h) fetal buzağı serumu ve son konsantrasyon 100 U/mL penisilin / streptomisin ile takviye ederek Jurkat T hücreleri için komple Roswell Park Memorial Institute 1640 ortamı (cRPMI-1640) hazırlayın.
  2. Jurkat T hücrelerinin sağlıklı bir kültürünü sağlamak için, hücreleri enfeksiyondan önce 1 haftaya kadar kültürde tutun.
  3. Lentivirüs titrasyonunun yapıldığı gün, cRPMI-1640 oyuğu başına 200 μL'de 2 x 105 hücre / oyukta 24 oyuklu bir plakada canlı Jurkat T hücrelerini plakalayın.
  4. Taze toplanmış lentivirüs kullanın veya 20 μL içeren lentivirüs şişesini buz üzerinde çözdürün ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın.
  5. cRPMI-1640'ta seri seyreltme kullanarak, Jurkat T hücrelerini 0.25 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2.5 μL, 5 μL ve 10 μL lentivirüs stoğu ile enfekte edin. Lentivirüsün eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. Enfekte olmayan Jurkat T hücreleri negatif kontrol görevi görür.
  6. Plakayı 37 °C'de inkübe edin. 4 saat sonra, her bir kuyucuğu cRPMI ile toplam 400 μL hacme kadar doldurun. Plakayı 3 gün boyunca 37 ° C'de inkübatöre geri koyun.
  7. Enfeksiyondan 48 saat sonra, bir floresan görüntüleme sistemi altında GFP ekspresyonunu doğrulayın.
  8. Enfeksiyondan 3 gün sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğu ayrı 1.5 mL toplama tüplerine toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı atın. Pelet, DPBS'de %2'ye (a/h) hazırlanmış 300 μL %2 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspanse edin ve karanlıkta buz üzerinde 15 dakika bekletin.
  10. Hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin ve peleti floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunda (steril DPBS +% 4 FCS + 1 mM steril EDTA) yeniden süspanse edin.
  11. Akış sitometrisi kullanarak enfekte olmuş lentivirüs ve kontrol hücrelerinin GFP ekspresyon frekansını ve ortalama floresan yoğunluğunu analiz edin (Şekil 2).

6. Dokuda yerleşik peritoneal makrofajların in vivo lentivirüs enfeksiyonu

  1. Kategori II biyolojik güvenlik kabininde, gerekli miktarda lentivirüs içeren toplam hacim 200 μL serumsuz ortam ortamı ile insülin iğneleri yükleyin (tek kullanımlık iğneler, hayvan refahı için ve iğnede sıvı kaybını önlemek için 30 G kullanın).
  2. Tek elle kepçe tekniğini kullanarak iğne kılıfını iğnenin üzerine geri yerleştirin. İğneyi buz üzerinde tutun ve 30 dakika içinde enjekte edin.
  3. Hayvan tesisinde, enjeksiyonlardan önce bir kategori II biyolojik güvenlik kabini kurun (Şekil 1E).
    1. Temiz bir doku tabakası koyun. Lentivirüs içeren insülin iğnesinin üzerindeki kılıfı gevşetin.
    2. Küçük doku parçaları ve klorheksidin glukonat bazlı dezenfektan, dekontaminasyon solüsyonu (2.000 ppm çamaşır suyu solüsyonu) içeren 50 mL'lik bir tüp ve keskin bir güvenli kap içeren bir Petri kabı hazırlayın.
  4. Boynun ensesindeki cildi kavrayarak fareyi dizginleyin21. Düzgün bir şekilde kısıtlanmış fare hareketsizdir ve bu güvenlik için gereklidir.
  5. Karın yukarı bakacak şekilde, hayvanın başını hafifçe aşağı doğru çevirin. Lentivirüsü intraperitoneal olarak karın boşluğunun sağ alt kadranına enjekte edin. Bu, herhangi bir periton boşluğu organına enjeksiyondan kaçınmak içindir.
  6. Fareyi serbest bırakmadan önce, şırıngayı dekontaminasyon solüsyonu ile doldurun ve keskin güvenli bir kutuya atın.
  7. Farenin karnındaki enjeksiyon bölgesini dezenfektana batırılmış doku ile silin ve hayvanı kafese geri koyun.
  8. Lentivirüs enjekte edilen fareyi, enjeksiyondan sonra en az 72 saat boyunca kategori II scantainer veya ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde (IVC) (yüksek verimli hava filtrasyonlu izole kafesler) barındırın. Kafesin ön tarafına uygun bir bilgi kartı yerleştirin.
  9. Yerel güvenlik onaylarına bağlı olarak, enfeksiyondan 72 saat sonra fareyi yeni kategori I tutma kafesine taşıyın. Fareleri enjeksiyondan itibaren toplam 3 gün boyunca günlük olarak izleyin.

7. Lentivirüs ile enfekte olmuş fareden periton hücrelerinin toplanması

DİKKAT: Lentivirüs enjeksiyonundan sonraki 72 saat içindeki koleksiyonlar için kurumsal kategori II biyolojik güvenlik kurallarına uyun. Enfekte hayvanların lentivirüs enjeksiyonundan sonraki ilk 72 saat içinde tutulduğu yatak takımları ve tutma kafesi, kurumsal kategori II biyolojik güvenlik kurallarına göre dekontamine edilmelidir.

  1. Kurumsal düzenlemelere uygun olarak farelere ötenazi yapın, örneğin, artan CO2 konsantrasyonunun solunması ve ardından servikal çıkık ile ölümün doğrulanması.
  2. Farenin karnını %70 izopropanol ile temizleyin ve periton boşluğu zarını ortaya çıkarmak için cildi dikkatlice kesin.
  3. 10 mL'lik bir şırınga ve 23 G iğne kullanarak periton boşluğunu 6 mL buz gibi soğuk FACS tamponu ile lavajlayın. Herhangi bir organı delmekten kaçının.
  4. Hücreleri FACS tamponuna çıkarmak için peritona hafifçe masaj yapın.
  5. Aynı şırınga ve iğneyi kullanarak periton sıvısını toplayın.
  6. İğneyi çıkarın ve hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  7. Periton lavajlarını buz üzerinde tutun.
  8. Gerekli diğer organları toplayın ve çalışmaya uygun şekilde saklayın.
  9. Hayvan leşlerini yerel hayvan ve güvenlik yönergelerine göre atın.

8. Peritoneal hücre boyama ve analizi

  1. Periton lavajını 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı dekontaminasyon solüsyonunda atın ve hücreleri 1 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  2. Toplanan hücreleri ve plakayı sayın: V tabanlı 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 x10 5 hücre.
  3. Üretici talimatlarına göre sabitlenebilir bir reaktif (örneğin, burada kullanılan Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti) kullanarak canlılık boyama yapın.
  4. Hücreler son 72 saat içinde enfekte olmuşsa, hücreleri 15 dakika boyunca% 2 PFA'da buz üzerinde sabitleyin. Eşit hacimde soğuk DPBS ekleyin ve 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
  5. Bloke edici tamponu hazırlayın: 4 μg / mL 2.4G2 antikoru% 10 (h / h) sıçan serumunda yüzey boyama için FACS tamponunda veya hücre içi boyama için geçirgenlik tamponunda karıştırın.
  6. Her bir kuyucuk içeren hücre peletini 50 μL bloke edici tampon içinde yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  7. Her numune için 50 μL FACS tamponunda (yüzey boyama için) veya geçirgenlik tamponunda (hücre içi boyama için) antikor karışımı hazırlayın. Her numune için son boyama hacmi, 50 μL bloke edici tampon dahil olmak üzere 100 μL olacaktır. Antikor konsantrasyonlarını buna göre hesaplayın (Tablo 1).
  8. Numunelere 50 μL antikor karışımı ve numuneleri kontrol etmek için 50 μL izotip kontrolleri ve kontrol tamponu ekleyin. Numuneleri karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Boyanmamış hücreleri ve izotip denetimlerini gerektiği gibi dahil edin.
  9. Her kuyuyu 100-200 μL buz gibi soğuk DPBS ile yıkayın ve plakayı 5 dakika boyunca 4 ° C'de 350 x g'da santrifüjleyin. Bağlanmamış antikorları yıkamak için bu adımı tekrarlayın. Numuneleri bir akış sitometresinde analiz edin.

9. Organlardan hücrelerin çıkarılması

  1. Organ başına 1 mL sindirim karışımı hazırlayın: Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS), 2 mg / mL kollajenaz tip IV ve 0.03 mg / mL DNaz I'i (akciğer sindirimi için 1.5 mg / mL hyaluronidaz içerir) karıştırın.
  2. Toplanan organı 1 mL sindirim karışımına aktarın ve makasla kıyın.
  3. Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  4. Hücreleri akciğer, dalak veya karaciğerden izole ediyorsanız, ACK lizis tamponu (150 mMNH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mMNa2EDTA pH = 7.4) kullanarak kırmızı kan hücrelerini parçalayın. Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Hücreleri bölüm 8'de açıklandığı gibi boyayın ve analiz edin.

Sonuçlar

Tam ve doğru bir şekilde takip edildiğinde, bu protokol, bu çalışmada belirlenen optimal hacimde on iki in vivo enjeksiyon için yeterli olan, tek bir preparat başına toplam 1.5 mL yüksek kaliteli lentivirüs stoğu verir18. Transfeksiyonun başarısı protokolün erken aşamalarında değerlendirilebilir. Sağlıklı ve birleşen HEK293T hücreleri, plazmitlerde mevcutsa, plazmit transfeksiyonundan 48 saat sonra kolayca tespit edilebilir bir iş...

Tartışmalar

Dokuda yerleşik makrofajlar, fizyolojik çevreleri 6,7,8,9 tarafından belirlenen bir dizi homeostatik ve inflamatuar dokuya özgü işlevi 1,2 yerine getirir. Bu protokolde, peritoneal yerleşik makrofajların lentivirüs partikülleri kullanılarak in vivo olarak manipülasyonu için etkili ...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, tamamen veya kısmen, Wellcome Trust Araştırmacı Ödülü [107964/Z/15/Z] tarafından finanse edilmiştir. PRT ayrıca Birleşik Krallık Demans Araştırma Enstitüsü tarafından da desteklenmektedir. MAC, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Keşif Bursu (BB / T009543/1) tarafından desteklenmektedir. Açık Erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Tarafından Kabul Edilen Makale sürümüne bir CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamıştır. LCD, Swansea Üniversitesi'nde öğretim görevlisi ve Cardiff Üniversitesi'nde fahri araştırma görevlisidir. Bu çalışma, Ipseiz ve ark. 202018 tarafından yürütülen çalışma ile desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μm sterile millex GP filterMerckSLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filterMerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)BD324892
1 Litre Sharps ContainerN/AN/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μm strainerThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax SupplementThermo Fisher Scientific31035025
Blocking bufferprepared in house
Brewer thioglycolate mediumSigma-AldrichB25514% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11bBiolegend101222Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11bBD550993Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117317Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117333Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19BD560375Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19Biolegend152410Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226Biolegend128808Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBD560527Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBiolegend152313Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4Biolegend100412Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73eBioscience16-0731-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8aeBioscience48-0081-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mmBeckman Coulter358126
CentrifugesBeckman CoulterUltracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IVSigma-AldrichC5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene transfection reagentQiagen301425
F4/80Biolegend123123Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123133Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123147Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1eBioscience48-5898-80Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometerThermo Fisher Scientific Attune NxT
Flow cytometry (FACS) bufferprepared in house
Fluorescent tissue culture microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
ForcepsN/AN/AUser preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T cell linegrown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigenBeckman Coulter6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanserEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1Becton Dickinson554970Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell linegrown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kitThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Micehere used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gprepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmidZuffrey, R., et al. 1997encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dishGreiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmidRosas, M. et al. 2014modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmidNaldini, L. et al. 1996encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype controlBecton Dickinson550617Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serumSigma-AldrichR9759-10ML
Red blood ACK lysis bufferprepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamineThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
Sterile 24-well cell culture plateGreiner Bio One662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - freeThermo Fisher Scientific14190144
Sterile EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)VWR612-4515
SucroseThermo Fisher Scientific15503022
surgical scissorsN/AN/AUser preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plateGreiner Bio One650180

Referanslar

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146 (2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047 (2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. . Available from: https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023)
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1 (2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152 (2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875 (2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85 (2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Lentiviral Vekt rGen Mod lasyonuMikroRNA Mod lasyonuPeritoneal Makrofajlarn VivoHomeostazPeritonitHEK293T H creleriS kroz Safla t rmasntraperitoneal EnjeksiyonGen Fonksiyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır