JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

רוב החיידקים, כולל מיקובקטריה, מייצרים בועיות חוץ-תאיות (EV). מאחר שרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של רכיבים תאיים, כולל מטבוליטים, שומנים, חלבונים וחומצות גרעין, מספר קבוצות העריכו את הגרסאות המקוריות או הרקומביננטיות של bEV על עוצמת ההגנה שלהן כמועמדים לחיסון תת-יחידתי. שלא כמו כלי רכב חשמליים מקומיים, כלי רכב חשמליים רקומביננטיים מהונדסים מולקולרית כך שיכילו אימונוגן אחד או יותר בעלי עניין. במהלך העשור האחרון, קבוצות שונות בחנו גישות מגוונות ליצירת bEV רקומביננטי. עם זאת, כאן אנו מדווחים על תכנון, בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים רקומביננטיים (mEVs) במיקובקטריה. לשם כך, אנו משתמשים ב-Mycobacterium smegmatis (Msm), מיקובקטריום אדמה אלים כמערכת המודל. תחילה נתאר את היצירה וההעשרה של כלי רכב חשמליים מקומיים של Msm. לאחר מכן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של mEV רקומביננטי המכיל mCherry, חלבון כתב פלואורסצנטי אדום, או EsxA (Esat-6), אימונוגן בולט של Mycobacterium tuberculosis. אנו משיגים זאת על ידי מיזוג נפרד של mCherry ו- EsxA N-termini עם C-terminus של חלבון Msm קטן Cfp-29. Cfp-29 הוא אחד החלבונים הבודדים שנמצאים בשפע של MsmEVs. הפרוטוקול ליצירה והעשרה של mEV רקומביננטי מ-Msm נותר זהה ליצירה ולהעשרה של כלי רכב חשמליים מקוריים של Msm.

Introduction

למרות הפיתוח והניהול של מגוון רחב של חיסונים נגד מחלות זיהומיות, אפילו עד עצם היום הזה, ~ 30% מכלל מקרי המוות האנושיים עדיין מתרחשים ממחלות מידבקות1. לפני הופעת החיסון נגד שחפת - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - שחפת הייתה גורם התמותה מספר אחת (~10,000 עד 15,000/100,000 תושבים)2. עם מתן BCG וגישה קלה לתרופות קו ראשון ושני נגד שחפת, עד 2022, מקרי מוות הקשורים לשחפת ירדו באופן דרמטי ל~1 מיליון לשנה עד 2022 (כלומר, ~ 15-20/100,000 אוכלוסייה1). עם זאת, באוכלוסיות אנדמיות לשחפת בעולם, מקרי מוות הקשורים לשחפת ממשיכים לעמוד על ~ 100-550/100,000 אוכלוסייה1. בעוד מומחים מכירים במספר סיבות שהובילו למספרים מוטים אלה, נראה כי הגנה בתיווך BCG שאינה נמשכת אפילו בעשור הראשון לחיים היא הסיבה הבולטת 3,4,5,6,7. כתוצאה מכך, בהתחשב ב"יעדי פיתוח בר-קיימא" המחודשים של האו"ם וב"אסטרטגיית סוף השחפת" של ארגון הבריאות העולמי, ישנו מאמץ עולמי מרוכז לפתח חלופה חיסונית עדיפה בהרבה ל-BCG, שאולי מספקת הגנה לכל החיים מפני שחפת.

לקראת מטרה זו, מספר קבוצות מעריכות כעת זני BCG מותאמים/רקומביננטיים, זנים מיקובקטריאליים לא פתוגניים ומוחלשים שאינם BCG, ומועמדים לתת-יחידות 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . בדרך כלל, חיסונים תת-יחידות הם ליפוזומים הנטענים באופן סלקטיבי עם מעט חלבונים אימונוגניים מטוהרים (~1-6) באורך מלא או קטועים של הפתוגן. עם זאת, בגלל הקיפול המזויף שלהם לקונפורמציות לא ילידיות ו / או אינטראקציות אקראיות לא פונקציונליות בין החלבונים הטעונים, תת-יחידות חסרות לעתים קרובות אפיטופים מקומיים וגרמניים ולכן אינן מצליחות להכשיר מספיק את מערכת החיסון14,19,20.

כתוצאה מכך, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) של חיידקים תפסו תאוצה כחלופה מבטיחה 21,22,23,24,25,26. בדרך כלל, כלי רכב חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של המרכיבים התאיים שלהם, כולל חלקים מסוימים של חומצות גרעין, שומנים ומאות מטבוליטים וחלבונים27,28. שלא כמו ליפוזומים שבהם כמה חלבונים מטוהרים נטענים באופן מלאכותי, bEV מכילים מאות חלבונים טעונים באופן טבעי, מקופלים באופן טבעי עם נטייה טובה יותר להפעיל את מערכת החיסון, במיוחד ללא דחיפה/סיוע של אדג'ובנטים ואגוניסטים לקולטן דמוי אגרה (TLR)27,28,29. בקו מחקר זה אנו ואחרים בחנו את התועלת של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים כמאיצי תת-יחידות פוטנציאליים ל-BCG30. למרות החששות כי bEVs חסרים עומסי אנטיגן אחידים, EVs מ Neisseria meningitidis מוחלש הגנו בהצלחה על בני אדם מפני מנינגוקוק serogroup B31,32.

לפחות תיאורטית, כלי הרכב החשמליים הטובים ביותר שיכולים להגביר היטב את BCG הם כלי הרכב החשמליים המועשרים מחיידקים פתוגניים. עם זאת, העשרת כלי רכב חשמליים הנוצרים על ידי מיקובקטריום פתוגני היא יקרה, גוזלת זמן ומסוכנת. בנוסף, כלי רכב חשמליים שנוצרו על ידי פתוגן עשויים להיות אלימים יותר מאשר מגנים. בהתחשב בסיכונים הפוטנציאליים, כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול בדוק היטב להעשרת כלי רכב חשמליים שנוצר על ידי Msm שגדל באופן אקסני, מיקובקטריום אלים.

עם זאת, למרות קידוד מספר אורתולוגים של חלבונים פתוגניים, מיקובקטריה אלימים חסרים מספר אנטיגנים חיסוניים / אפיטופים של חלבון פתוגני הדרושים כדי להכין מספיק את מערכת החיסון לקראת הגנה33. לכן, בחנו גם בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים רקומביננטיים של MSM באמצעות הנדסה מולקולרית, כך שחלק משמעותי מכל חלבון פתוגני בעל עניין המובע ומתורגם ב-MSM, חייב להגיע לרכבים החשמליים שלו. שיערנו כי אחד או יותר מ-10 החלבונים הנפוצים ביותר של Msm EVs כאשר הם מאוחים לחלבון המעניין יסייעו בטרנסלוקציה כזו.

בזמן שהתחלנו לתקנן את ההעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים (mEVs) במעבדה שלנו, בשנת 2011, Prados-Rosales ועמיתיו דיווחו לראשונה על הדמיה והעשרה של mEV במבחנה30. מאוחר יותר, בשנת 2014, אותה קבוצה פרסמה גרסה שונה של שיטת2011 34. בשנת 2015, Lee et al. דיווחו גם על שיטה סטנדרטית עצמאית להעשרת mEV שוב מתרביות אקסניות של מיקובקטריה35. בשילוב שני הפרוטוקולים34,35 ושילוב כמה מהשינויים שלנו לאחר סטנדרטיזציה יסודית, אנו מתארים כאן פרוטוקול המסייע להעשיר באופן שגרתי mEV מתרביות אקסניות של מיקובקטריה 36.

כאן אנו מפרטים במיוחד את ההעשרה של כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Msm, שהיא הרחבה של פרוטוקול36 שפורסם להעשרת רכבים חשמליים מיקובקטריאליים בכלל. אנו גם מפרטים כיצד לבנות mEV רקומביננטי (R-mEVs) המכילים את חלבון mCherry (ככתב פלואורסצנטי אדום) ואת EsxA (Esat-6)37,38,39, אימונוגן דומיננטי ותת-יחידה פוטנציאלית מחוסנת של Mycobacterium tuberculosis. הפרוטוקול להעשרת ה-R-mEV נותר זהה לזה שתיארנו להעשרת כלי רכב חשמליים מקומיים מ-Msm.

Protocol

1. תנאי גדילה של Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, ונגזרותיהם

  1. מדיה
    1. Middlebrook 7H9 מרק נוזלי
      1. הכינו תמיסת מלאי 20% Tween-80 על ידי חימום מראש של הנפח הנדרש של מים מזוקקים פעמיים (ddw) בכוס זכוכית ל~45-50 מעלותצלזיוס במיקרוגל, הוסיפו את הנפח הנדרש של Tween-80 באמצעות גליל מדידה מתאים, וערבבו ברציפות על מערבל מגנטי קטן כדי להביא את 20% Tween-80 לתמיסה אחידה. סנן את 20% Tween-80 דרך מסנן סילוק 0.22 אום ואחסן את תמיסת המניות בצבע צהוב בהיר בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס.
        הערה: יש להעביר את כל עקבות Tween-80 בגליל המדידה לתוך הכד לקבלת ריכוז סופי מדויק. אין לבצע autoclave את מלאי Tween-80 מוכן. יש לסנן (להשתמש ב-0.22 מיקרומטר) לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. בצע את הוראות היצרן להכנת מרק 7H9. להשעות 4.7 גרם של אבקת 7H9 ב 900 מ"ל של ddw. מוסיפים 2 מ"ל גליצרול, מערבבים את התכולה ואוטקלוב בטמפרטורה של 121 מעלותצלזיוס, 15 psi למשך 20 דקות.
        הערה: אל תוסיף את Middlebrook ADC enrichment (ADC) ואת Tween-80 לפני autoclaving.
      3. לאחר שהמדיה האוטומטית מתקררת לטמפרטורת החדר (RT, כלומר, ~ 25 oC), בארון בטיחות ביולוגית סטנדרטי מסוג A2, הוסף מלאי של 10x של 100 מ"ל ADC (1x סופי) ו- 2.5 מ"ל (0.05% סופי) של 20% Tween-80. סננו את התערובת דרך יחידת מסנן חד פעמית של 0.22 מיקרומטר ואחסנו את תמיסת הציר השקופה בצבע ירוק צהבהב בהיר מאוד בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס.
        הערה: ה- pH של המדיה חייב להיות ~ 6.6 עד 6.8 (אם <6.4 או >7.0, יש להשליך וליצור טרי). יש לאחסן ב 4 oC (יציב במשך 3-4 שבועות). מומלץ מאוד לסנן את חומרי ההדפסה 7H9 (לאחר הוספת ADC ו-Tween-80) פעמיים באמצעות שתי יחידות סינון חד-פעמיות עצמאיות של 0.22 מיקרומטר.
    2. מרק נוזלי של סאוטון (מדיה מינימלית)
      1. ממיסים L-אספרגין (0.4% w/v) וחומצת לימון (0.2% w/v) ב-950 מ"ל של ddw. הוסף 1 מ"ל כל אחד ממלאי 1,000x טרי מוכן (ב- ddw) של אשלגן פוספט דו-בסיסי (חסר צבע; מלאי 10 גרם/20 מ"ל; סופי 1x 0.5 גרם/ליטר); מגנזיום גופרתי heptahydrate (חסר צבע; מלאי 10 גרם/20 מ"ל; סופי 1x 0.5 גרם/ליטר); וברזל אמוניום ציטראט (חום בהיר מאוד; ציר 1.6 גרם/40 מ"ל; סופי 1x 0.04 גרם/ליטר) ומערבבים היטב על בחש מגנטי.
        הערה: במקרה הטוב, מניות פי 1,000 יכולות להיות בנות שבועיים; אם ישן מזה, להכין מלאי טרי; אחסנו אותם ב-RT בחושך (למשל, בתוך ארון/מדף). אם ברזל אמוניום ציטראט הוא חום כהה, להשליך אותו ולעשות אותו טרי. עדיף להוסיף את שלושת המלחים בסדר המוזכר בשלב 1.1.2.1. מערבלים את התמיסה בכל פעם לפני הוספת כל תמיסת מלח.
      2. למדוד ולציין את ה- pH באמצעות מד pH; ודא שזה סביב 3.1 עד 3.2. אם ה- pH הוא יותר מ 3.7, להשליך את המניות ולהכין טרי. כדי להתאים את ה- pH ל -7.4, השתמש בטיפות רבות של 10 N נתרן הידרוקסידי לפי הצורך. יש לעקוב אחר רמת החומציות הסופית תוך ערבוב מתמשך של התמיסה/המדיה על בוחש מגנטי.
      3. הוסף 4.76 מ"ל של גליצרול, 0.25 מ"ל של 20% Tween-80 (סופי 0.005%, ראה גם הערה לשלב 2.2.1.3), ורק אז, לפצות את נפח ל 1 L. לאחר מכן, יש לעקר את המסנן פי שניים מ-1 ליטר של מדיום באמצעות שני מסנני סילוק נפרדים של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום השקוף וחסר הצבע בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס (יציב למשך שבועיים).
        הערה: רק לאחר התאמת ה- pH ל- 7.4, הוסף גליצרול. אחרת, התקשורת תהפוך לבנה מעוננת. אם מעונן, השליכו אותו (אל תנסו לחמם אותו) והכינו אותו טרי. עבור כל ההכנות mEVs, השתמשו ב-Sauton's טריים.
    3. בסיס אגר מידלברוק 7H11
      1. בצע את הוראות היצרן להכנה. להשעות 19 גרם של אבקת 7H11 ב 900 מ"ל של ddw. מוסיפים 5 מ"ל גליצרול, מערבלים על מערבל מגנטי לקבלת מתלה אחיד (ירוק בהיר; pH 6.6 עד 6.8; אם >7.2, יש להשליך ולהכין טריים), ולבצע autoclave בטמפרטורה של 121 oC, 15 psi ולמשך 20 דקות.
        הערה: אין להוסיף ADC ו- 0.05% Tween-80 לפני autoclaving.
      2. כאשר המדיום מתקרר ל~50 oC, באופן אספטי בארון בטיחות ביולוגית מסוג A2, הוסף 100 מ"ל של ADC (שהובא ל- RT) ו- 2.5 מ"ל של 20% (0.05% סופי) Tween-80 (הובא ל- RT). יש לזרוק מיד לתוך צלחות פטרי.
        הערה: הצלחות יציבות בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס למשך 4-6 שבועות לפחות. ודא שהצלחות נמצאות ב- RT למשך הלילה לפני שאתה עוטף את הצלחות לאחסון של 4 oC. אחרת, לחות תילכד בצלחות במהלך הדגירה ב 37 oC.
    4. מרק מילר לוריא ברטאני (LB) ובסיס אגר
      1. בצע את הוראות היצרן להכנה. להכנת ציר LB יש להשהות 25 גרם אבקה ב-1,000 מ"ל של ddw ולערבב בעדינות במשך 5 דקות בכוס זכוכית על מערבל מגנטי. עם השעיה אחידה, יש להכניס את הנפחים הנדרשים לבקבוקי מדיה (למשל, 300 מ"ל בבקבוק מדיה של 500 מ"ל) ולאוטוקלאב. כדי להכין LB אגר, להשהות 40 גרם של אבקה ב 1,000 מ"ל של ddw ו autoclave (12 גרם של אבקה ב 300 מ"ל ddw בבקבוק מדיה זכוכית 500 מ"ל).
  2. תנאי גידול
    הערה: כל השלבים של עבודת תרבית חיידקים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית (סוג A2). כל התרביות חייבות להיות מעובדות עם צינורות סטריליים, צלוחיות וקצוות פיפטה.
    1. יום 1
      1. הוסף 1 מ"ל כל אחד של מלאי גליצרול של Msm (מ -80 o C מקפיא) ל 2 x 10 מ"ל (ב 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות סטריליות) של אוטוקלאבל טרי, מקורר, מחומם מראש (~ 37 o C) 7H9 מרק, מערבלים שלוש פעמים, לסגור את המכסים ולדגור את הצינורות לילה ב 37 oC ו 200-220 סל"ד (שייקר אינקובטור).
        הערה: כדי לגדל Mycobacterium tuberculosis (Mtb), בצע צעדים דומים אך דגור על צינורות 50 מ"ל במשך 4-6 ימים ב 37 oC ו 120-150 סל"ד (שייקר אינקובטור) בהגדרות BSL3. עקוב אחר כל ההנחיות הבינלאומיות ונוהלי הבטיחות הביולוגית של פתוגנים BSL3 וקבוצת סיכון 3 תוך טיפול והשלכת Mtb ותרביותיו. השתמש בארון בטיחות ביולוגית מסוג B2 לטיפול ב- Mtb ובתרביותיו.
    2. יום 2
      1. כאשר OD 600 (A600nm; צפיפות תאים) מגיע ~ 1.0, צנטריפוגה את תרביות Msm במשך 10 דקות ב3,200 × גרם ו- RT (צנטריפוגת benchtop). השליכו את הסופרנאטנטים בעזרת קצוות פיפטה סטריליים של 1 מ"ל.
        הערה: השלב לעיל נשאר זהה עבור תרבויות Mtb, אלא שמספר הימים הוא 4-7. הקפידו לא לגעת בכדורית החיידקים עם קצה הפיפטה.
      2. שטיפה: לכל גלולת Msm, יש להוסיף 1 מ"ל של מדיית Sauton שחוממה מראש (בשלב RT) (שלב 1.1.2) ולהשהות מחדש בעדינות עם קצות פיפטה 1 מ"ל לקבלת מתלה אחיד. באמצעות קצות פיפטה סטריליים, לפצות את נפחים עד 10 מ"ל (בכל אחד) עם אותה מדיה. צנטריפוגו את המתלים למשך 10 דקות ב-3,200 × גרם ו-RT והשליכו את הסופרנאטנטים. חזור על שלב זה פעם נוספת.
        הערה: השלב לעיל נשאר זהה עבור תרבויות Mtb.
      3. יש להשהות מחדש את תאי ה-Msm שנשטפו פעמיים ב-20 מ"ל (כל אחד) של סאוטון שחומם מראש (שחומם מראש בצלחת או באינקובטור שייקר) ולמדוד את הצפיפות האופטית של התאים ב-600 ננומטר. חסן את הנפח הנדרש של תרביות Msm לצלוחיות סטריליות של 1 L Erlenmeyer המכילות ~330 מ"ל של Sauton סטרילי כך שה- OD600 הסופי הוא ~0.05.
        הערה: המתלים חייבים להתחיל תמיד בנפח קטן. אם הנפח הסופי מתווסף ישירות לגלולה כצעד אחד, התאים יישארו ככדורים מפוזרים (אינדיקטור להשעיה גרועה). הדרך היחידה לפתור את הבעיה היא לסובב את התרביות ולבצע מחדש את ההשעיה כפי שהומלץ. הצעד הנ"ל נשאר זהה עבור תרבויות Mtb.
    3. יום 2/3
      1. דוגרים על תרבית 330 מ"ל בשייקר האינקובטור ב 200 סל"ד ו 37 oC עד שהתרבות OD600 מגיע ~ 0.3. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעם אחת (בדומה לשלב 1.2.2.2 אבל עם נפח שווה) ולאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה באותו נפח. חלק 50 מ"ל של התרביות המושעות כל אחת לשש צלוחיות סטריליות של 1 ליטר Erlenmeyer, שכל אחת מהן מכילה 280 מ"ל של Sauton's סטריליים שחוממו מראש עם 1/10עשירית מהשימוש הרגיל (0.05%) Tween-80 כלומר 0.005% (ראה גם הערה של שלב 2.2.1.3. כדי להבין מדוע 1/10th). OD600 הסופי חייב להיות כ- 0.05.
        הערה: עבור תרביות Mtb, במקום צלוחיות Erlenmeyer, השתמש בבקבוקי רולר (בקיבולת של 1/2/4 ליטר). התאימו את נפח התרבית לבקבוק כך שכאשר שומרים אותו על מכשיר הגלילה, התרבית לא תגיע לפה של הבקבוק. הנפח בפועל בבקבוק הרולר יהיה תלוי בקיבולת של בקבוק הרולר.
      2. לדגור על כל אחת מתרביות 330 מ"ל בשייקר האינקובטור ב 200 סל"ד ו 37 oC עד OD600 מגיע 2.0 עד 2.5 (~ 15-18 שעות).
        הערה: עבור תרביות Mtb, ודא כי OD600 הסופי הוא ~ 1.0-1.2 (לוקח ~ 5-8 ימים).

2. העשרת Msm mEV על ידי שימוש בצנטריפוגות שיפוע צפיפות

  1. יום 4
    1. צנטריפוגה ~ 2 L של תרביות Msm בשלב מעריכי ביניים בבקבוקי צנטריפוגות סטריליות 6 x 400 מ"ל ב 4 oC למשך 20 דקות ב ~ 8,000 × גרם (צנטריפוגת מודל הרצפה). אספו את הסופרנאטנט התקשורתי/תרבותי המשומש בשתי צלוחיות 1 L Erlenmeyer מקוררות מראש ואחסנו אליציטוט של הגלולה לכל הליך אנליטי (כגון SDS-PAGE ו-Western Blotting - לא מפורט כאן).
      הערה: כל השלבים הבאים חייבים להתבצע בקור (~ 4 ° C) כדי לשמור טוב יותר על שלמות mEVs. ה-mEV יציבים למדי ב-RT אך קירור הוא הכרחי ליציבות לטווח ארוך (הקפאה והפשרה חוזרות אינן מומלצות). במהלך צמיחת התרבות האקסנית, mEV מתנתקים מפני השטח של Msm/Mtb ומצטברים במדיה התרבותית/מבוזבזת.
    2. סנן את הסופרנאטנט של תרבית Msm תחילה דרך יחידות מסנן הסילוק של 0.45 מיקרומטר ולאחר מכן, דרך יחידות מסנן הסילוק של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את כל עקבות החיידקים.
      הערה: סינון ישיר דרך מסנני 0.22 מיקרומטר חונק לעתים קרובות את יחידות המסנן (מכיוון שכדורית החיידקים עלולה להיות מופרעת בעת ביצוע שלב 2.1.1). כדי ליצור סופרנאטנטים של תרביות Mtb, בצע שלושה סינון של תרביות Mtb (כלומר, שלב סינון ראשון עם יחידת מסנן חד פעמית של 0.45 מיקרומטר; שני שלבי סינון רצופים עם יחידות מסנן חד פעמיות של 0.22 מיקרומטר) לפני העברת תסנין התרבית להגדרות BSL-2.
  2. יום 4/5
    1. השתמש ברכזי הממברנה של 30 kDa כדי לרכז את תסנין תרבית Msm (~ 2 L) עד ~ 38 מ"ל על ידי צנטריפוגה של תסנין התרבית ב 4 oC, 20 דקות וב 3,200 × גרם.
      1. שטפו תחילה את הרכזים ב-ddw סטרילי וקר (~15 מ"ל) (שטפו ב-4 מעלותצלזיוס, 5 דקות וב-3,200 × גרם).
      2. יש לשטוף עם ~15 מ"ל של Sauton's מסוננים מראש וקרים (אותם תנאים כמו מים (2.2.1.1.)) כדי להסיר את כל עקבות הכימיקלים (המשמשים במהלך הייצור).
      3. מכיוון ש~130 צנטריקונים (אם משתמשים בהם בלבד) נדרשים טכנית כדי לרכז ~2 ליטר של תסנין תרבית, עשו שימוש חוזר בצנטריקונים לפחות 3-4 פעמים במידת הצורך. בצע את השלבים הבאים: רכז 15 מ"ל עד 0.5 עד 1.0 מ"ל (בצע את שלב 2.2.1), העבר את התרכיז לצינור אולטרה-צנטריפוגה נקי, אוטוקלאבי וקר של 38 מ"ל, ולאחר מכן העבר מחדש את סינון התרבית הלא מרוכז שנותר לצנטריקונים המשומשים לריכוז חוזר.
        הערה: שימוש ברכזי 24, 30 kDa לריכוז 2 ליטר של תסנין תרבית ייקח עד 6 שעות. עם ריכוז תסנין התרבית, Tween-80 גם מתרכז ויכול לחסום את המרכז. שימוש ב-Tween-80 עד 0.005% סופי (במקום 0.05%) במדיה של סאוטון מסייע למנוע חסימה זו. הריכוז המופחת של Tween-80 אינו משפיע על התרחיף האחיד של Msm במהלך הגדילה ואינו גורם להתגבשות של תאי Msm. עם זאת, מכיוון שתאי Mtb מתגבשים ב-0.005% Tween-80, השתמש ב-0.05% Tween-80 עבור כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Mtb.
    2. מעבירים את תסנין תרבית ה-Msm המרוכז (~38 מ"ל) לצינור צנטריפוגה פוליפרופילן נקי, שטוף (עם ddw) ומקורר מראש בנפח 40-50 מ"ל ומעבירים אותו לצנטריפוגה דו-שלבית, תחילה ב-4,000 × גרם ולאחר מכן ב-15,000 × גרם, שני השלבים ב-4 מעלותצלזיוס למשך 20 דקות (כדי להסיר את כל הפסולת). השתמש בצנטריפוגה מסוג רצפה עבור אותו הדבר.
  3. יום 5/6
    1. מעבירים את הסופרנאטנט של התרבית לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליפרופילן בנפח 38.5 מ"ל ומסובבים אותו באולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 4 שעות ב-4 מעלותצלזיוס.
      הערה: דלי נדנדה פועל בצורה הטובה ביותר במהירות זו. יש להקפיד למלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה עד שוליו ושיהיה לו צינור אולטרה-צנטריפוגה מאוזן במשקל שווה. אם אחד הצינור נדבק לדלי הנדנדה לאחר צנטריפוגה (מה שקורה עקב עיבוי), באמצעות מלקחיים, הסר אותו בעדינות מהרוטור. ניגוב הלחות המעובה הקיימת על פני השטח החיצוניים של האולטרה-צנטריפוגה לפני אולטרה-צנטריפוגה מונע הידבקות.
    2. שמור את supernatant בצינור precooled 50 מ"ל (ראה הערה). הפוך את צינור האולטרה-צנטריפוגה על נייר סופג טרי ללא סיבים כדי להסיר עקבות של הסופר-נטנט. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-600 מיקרוליטר של תמיסת חיץ HEPES (50 mM HEPES ו-150 mM NaCl, pH 7.4; יש לסנן-לעקר לפני השימוש).
      הערה: שמור את supernatant רק כגיבוי. גלולת mEV המקומית מופיעה ככתם דמוי ג'לי, קוטר 5-7 מ"מ, צהוב אפרפר עמום עד כתם שקוף. אם אף כדור אינו גלוי, חזור על שלב 2.3.1 על-ידי שימוש חוזר בסופרנטנט שנשמר. אם לא מופיעה גלולה לאחר חזרה על שלב 2.3.1, מחק והפעל מחדש משלב 1.2. לוקח זמן להתלות את הגלולה מחדש. מומלץ להוסיף את חיץ HEPES ולהשאיר אותו לילה על 4 מעלותצלזיוס למתלים קלים. יש להשהות בעדינות אך עם צנרת חוזרת ונשנית (השתמשו בקצוות P200 למתלים טובים יותר) עד להשעיה אחידה.
  4. יום 6
    1. יש להעביר את הגלולה המרחפת לצנטריפוגה הדרגתית מבוססת יודיקסנול.
      1. שכב את הגלולה המרחפת בתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליפרופילן אולטרה-צלול נקי 13 מ"ל 13 מ"ל וערבב בעדינות (השתמש בפיפט 1 מ"ל) עם ~ 4 מ"ל של תמיסת 'יודיקסנול' הדרגתית בצפיפות אינרטית (זמין מסחרית כתמיסת ~ 60% w/v). לאחר שכבות הגלולה המרחפת בתחתית הצינור (עד למקסימום של 5 מ"ל), לאחר מכן כיסוי עם 1 מ"ל (w/v) כל אחד של 40%, 30%, 20% ו 10% מלאי משנה של 'יודיקסנול' בסדר המתאים (להכין מלאי משנה (עם מאגר HEPES) מ 60% מלאי). לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של 6% תת מלאי (מוכן מ 60% מלאי עם חיץ HEPES) בחלק העליון כדי למלא את הצינור.
        הערה: יש להכין את שיפוע הצבע ממש לפני השימוש; לעולם אל תאחסן ותשתמש.
      2. בזהירות (ללא טלטול), לשקול את הצינור בתוך זכוכית, ולהעביר אותו בעדינות לתוך רוטור דלי מתנדנד.
        הערה: שקילה נחוצה כדי לאזן עם צינור דמה (גם נשקל).
      3. נושא אותו אולטרה צנטריפוגה ב 141,000 × גרם במשך 16 שעות ב 4 oC.
  5. יום 7
    1. בזהירות להסיר את הצינור (ראה הערה של שלב 2.3.1) ולאסוף 1 מ"ל שברים לתוך צינורות microcentrifuge autoclaved טרי; שימו לב לשבריםה-4 עד ה-6, שבדרך כלל מכילים אתה-Msm mEVs.
      הערה: ה-mEVs משברים אלה מתחלקים בדרך כלל לשלושה או ארבעה תחומי תדרים של mEV (אחד מהם הוא הפס הראשי) שצבעם לבן עמום. ה-R-mEV המכילים mCherry מתחלקים בשבריםה-5 עדה-7 ונראים סגולים כהים עד מגנטה. כלי הרכב החשמליים Mtb מתחלקים בדרך כלל בשברים ה-5 עדה-7. ההפרדה של mEV במעבר הצבע תלויה בריכוז השיפוע שבו נעשה שימוש ובאיזו מידה השיפוע הוא שכבתי. אם mEV נקרעים באופן חלקי, הם עשויים להיפרד בשברים מוקדמים יותר. לחלופין, אם הגלולה המתקבלת לאחר שלב 2.3.2 אינה תלויה היטב, השלפוחיות יוצרות מיקרו-כדוריות צפופות המתחלקות כשברים מאוחרים יותר. אנו ממליצים על איסוף מדויק של השברים רק כאשר המשתמש רוצה להעריך איזה מהשברים של 1 מ"ל מכיל את ה- mEVs. משתמשים עשויים לרצות aliquot לשברים קטנים או גדולים יותר בהתבסס על הנוחות שלהם. כאשר אנו משתמשים בהם עבור יישומים מסוימים, לדוגמה, ובודקים אותם כמאיץ חיסוני פוטנציאלי לתת-יחידה ל-BCG, אנו מגבילים את איסוף ה-mEV שלנו לפחות מ-250 מיקרוליטר מהשברים (כאשר mEV מתחלקים) כך שנוכל לאסוף באופן ספציפי רק את רצועות ה-mEV ואת התהליכים כפי שמצוין ב-2.7.5. זה עוזר להסיר בצורה יעילה יותר את כל עקבות היודיקסנול שעלולים להפריע לניסויים שלנו במורד הזרם.
  6. יום 8
    1. אגרו את השברים המכילים mEVs, דללו עם חיץ HEPES ל-38 מ"ל, וחזרו על האולטרה-צנטריפוגה ב-4 oC במשך 16 שעות ב-100,000 × גרם. יש להשהות מחדש את הגלולה (כמו בשלב 2.3.2 עם אותן אזהרות) במאגר HEPES או בכל חיץ שניסויים במורד הזרם (לא מפורט כאן) כגון הערכת חלבונים, ניתוחי ננו-מעקב, צביעה שלילית, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, כתמים מערביים ותיוג חיסון-זהב.
      הערה: למתלים טובים יותר, סוניק את הצינור המכיל mEV למשך 10 דקות באמצעות סוניק אמבט מים על-קולי. סוניקציה למשך זמן רב יותר עלולה לגרום לקרע ולאובדן של mEV שלמים. אם מושעה היטב, סוניקציה היא מיותרת. כל השלבים מ-2.1 עד 2.6 זהים תוך העשרת כלי רכב חשמליים שנוצרו על ידי Mtb.

3. בנייה והעשרה של mEV רקומביננטי.

הערה: אחד מ-10 החלבונים הנפוצים ביותר (המזוהים על ידי ספקטרומטריית מסות) של Msm EV הוא Cfp-2930. בהתחשב בגודלו הקטן (29 kDa), מבנה משני פשוט 40, לוקליזציה לממברנה 41, ונטייתו להיות מופרש למדיה משומשת בתרביות אקסניות (למשל, כחלבון תסנין תרבית; מופרש הן על ידי Msm והן על ידי Mtb42,43, כאן, הוא נוצל כדי לספק כתב פלואורסצנטי אדום וחלבון מעניין (EsxAMtb) לתוך mEVs. כדי להשיג זאת,

  1. השתמש בפריימרים מתאימים קדימה ואחורה (טבלה 1; תואם לשיבוט ישיר לווקטור מעבורת כגון pMV261) להגברת cfp-29 מ- Msm. באמצעות ~ 50 ng של משקל מולקולרי גבוה (~>20 kb) Msm DNA גנומי כתבנית, PCR מגביר את מקטע הגן cfp-29 עם הגהה גבוהה DNA פולימראז (כגון Phusion או Q5). פעל בהתאם להמלצות היצרן עבור PCR.
    הערה: עצבו את אתרי ההגבלה הנחוצים לפריימרים לשכפול קל לכל וקטור מעבורת חלופי שמעניין אתכם. תנאי ה-PCR והנפח ישתנו בהתאם לסוג ולמותג של DNA פולימראז לקריאת הגהה הנמצא בשימוש. נפח תמהיל התגובה ישתנה בהתאם לכמות תבנית ה- DNA וכמות ההגהה של DNA פולימראז. עקוב אחר המלצות היצרן לתנאי PCR, הצלחת הגברה וביטול חישול לא ספציפי של פריימרים.
  2. PCR מטהרים את האמפליקון המדולל עם כל ערכת טיהור PCR זמינה מסחרית ומוודאים את אורך האמפליקון על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל אגרוז. לעכל את המגבר מטוהר.
    1. הערך את כמות האמפליקון המטוהר על ספקטרופוטומטר. יש להשתמש לפחות ב-2 מיקרוגרם של אמפליקון cfp-29 לעיכול.
    2. יש לעכל תחילה עם BstB1 בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוסלמשך שעה אחת (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן), להוריד את טמפרטורת התגובה ל-RT, ולאחר מכן לעכל עם HindIII למשך שעה אחת ב-37 מעלותצלזיוס (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן).
    3. PCR לטהר ולנטרל את האמפליקון המעוכל ב 50 μL של ddw נטול nuclease autoclaved.
    4. להעריך את הריכוז ואת התפוקה של אמפליקון מעוכל באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC עד להגדרת הקשירה. הערה: לאחר PCR, אמת את אורך האמפליקון (~ 798 + 50 bp) ותשואה על ידי אלקטרופורזה של 10 μL של תערובת תגובת PCR על ג'ל אגרוז 1%. למרות שעיכול כפול אינו אפשרי עם שילוב זה של אנזימים, חיץ תואם ימנע טיהור PCR חוזר ולאחר מכן אובדן של אמפליקון מעוכל. ריכוז האמפליקון המעוכל משתנה בהתאם לערכה המשמשת לטיהור PCR. זה גם משתנה עם האורך (ב bp) של כל וקטורים חלופיים של בחירה.
  3. השתמש בפריימרים קדימה ואחורה (טבלה 1), הגהה DNA פולימראז, ו~ 50 ng של DNA גנומי Mtb, PCR להגביר esxA או esxA-3X FLAG-tag ספציפי אמפליקון. השתמש ~ 5 ng של DNA פלסמיד מתאים כדי PCR להגביר mCherry. פרטי פלסמיד ורצף נמצאים בקובץ משלים 1.
    הערה: השתמש במקשר גליצין, גליצין, גליצין, גליצין, סרין44,45(G4S) בין cfp-29 לבין mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; לפני תחילת mCherry, מקשר G4S מסייע ל- mCherry לא לעבור קפלים מזויפים שאינם פונקציונליים (כולל אלה המונעים על ידי Cfp-29). עיין ברצפי cfp-29, hsp60 promoter, mCherry ו-esxA בקובץ משלים 1. פלסמידים המשמשים כתבניות עבור mCherry זמינים במאגרים / בנקים שונים של פלסמיד. קיימות גרסאות שונות (רצפים שהשתנו מעט) של mCherry שידרשו שינוי רצפי פריימר קדימה ואחורה. הפריימרים (טבלה 1) מסייעים בהגברת הדובדבן המוזכר בקובץ משלים 1. מיזוג של N-terminus של mCherry/esxA/esxA::3XFLAG לקצה מסוף C של Cfp-29 עובד היטב.
  4. לעכל 1 מיקרוגרם של DNA של mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplicons ולטהר DNA מעוכל.
    1. יש לעכל פעמיים כל אמפליקון עם HindIII ו-HpaI למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלותצלזיוס (או לפי המלצות היצרן).
    2. השתמש בערכת טיהור PCR זמינה מסחרית ובהמלצות היצרן לטיהור המגבר המעוכל. יש להצדיע לאמפליקון המעוכל ב-50 מיקרוליטר של ddw נטול נוקלאז אוטוקלאבי.
    3. להעריך את הריכוז ואת התפוקה של אמפליקון מעוכל באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC עד להגדרת הקשירה.
  5. תקעול 2 מיקרוגרם של pMV261-KanR (קובץ משלים 1) או וקטור שיבוט מתאים עם האנזים (ים) לבחירה.
    1. יש לעכל תחילה עם BstB1 בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוסלמשך שעה אחת (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן), להוריד את טמפרטורת התגובה ל-RT, ולאחר מכן לעכל עם HindIII למשך שעה אחת ב-37 מעלותצלזיוס (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן).
    2. ג'ל לטהר ו elute ב 50 μL של ddw autoclaved nuclease חינם.
    3. להעריך את הריכוז והתשואה של הווקטור המעוכל באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC עד להגדרת הקשירה.
      הערה: שכפול חד-שלבי של שני מקטעים אפשרי עם הפריימרים לעיל עבור pMV261. כל וקטור מעבורת חלופי שישרוד כאפיזום יעבוד. פלסמידים אינטגרטיביים יעבדו גם הם, אך תפוקת החלבון הרקומביננטי תהיה נמוכה יחסית לכל בסיס תא.
  6. לקשור ולהפוך לזן תואם של E. coli.
    1. עבור קשירה, השתמש 125 ng של הווקטור. יש להשתמש באמפליקונים mCherry/esxA/esxA::3XFLAG מעוכלים כראוי ביחס מולארי של 1:3. יש לבצע קשירה למשך הלילה באמצעות T4 DNA Ligase (כמות בהתאם להמלצות היצרן) בטמפרטורה של 16°C באמבט מים במחזור קירור.
      הערה: השתמש בפקדים מתאימים כגון וקטור רק עם וללא ליגאז דנ"א T4 להערכת יעילות העיכול וחיזוי יעילות הצלחת השיבוט.
    2. שינוי
      1. הפשיר NEB5α תאים מוכשרים כימית aliquots (~ 100 μL לכל טרנספורמציה) על קרח במשך 15 דקות. מערבבים בעדינות פעמיים עם קצה פיפטה סטרילי. הוסף תערובת קשירה (עד 20 μL) לתאים המוכשרים הקרים.
      2. מערבבים בעדינות תאי פיפטה + DNA קשור. דוגרים על התערובת על קרח למשך 30 דקות נוספות.
      3. ספק הלם חום ב 42 ° C (באמבט מים במחזור) במשך 60 שניות ומיד להעביר בחזרה לקרח למשך 15 דקות נוספות.
      4. לשחזר את התאים מותמרים על ידי הוספת 1 מ"ל של מרק SOC (2% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, ו 20 mM גלוקוז) ולדגור ב 37 ° C במשך 1 שעה ב 200 סל"ד.
      5. סחררו את החיידקים שנמצאו בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (3000 × גרם, RT ו-10 דקות), השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מצעי LB סטריליים, מחוממים מראש וטריים, ופרשו את התרחיף על צלחות אגר LB Miller שזה עתה נמזגו המכילות אנטיביוטיקה נדרשת בריכוזים מתאימים.
      6. דוגרים על צלחות הפטרי באינקובטור צלחות שנקבע מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
  7. מסך (לא מפורט כאן) עבור שיבוטים פוטנציאליים, לאמת (על ידי מושבה PCR-/אנזימי הגבלה מבוססים)46 ולרצף (ריצוף Sanger) אותם כדי לאשר איחוי.
  8. חלץ DNA פלסמיד (~ 200 ng/1-2 μL; כל ערכה זמינה מסחרית) של השיבוט המאושר (רקע E. coli ) והפוך אותו לתאים אלקטרו-מוכשרים טריים של Msm.
  9. הכנת תאים אלקטרו-כשירים של Msm
    1. Msm טרי לגדל (כמו בשלבים 1.2.1 ו 1.2.2). שטפו את ה-Msm הטרי כמו בשלבים 1.3.3 ו-1.3.4 (למעט, השתמשו ב-7H9 + ADC + Tween-80 (עשיר) במקום בזה של Sauton).
    2. הוסף aliquot של תאי Msm שטופים OD 600 סופי של ~0.05 בבקבוק Erlenmeyer סטרילי500 מ"ל המכיל 150 מ"ל של מדיה עשירה.
    3. דגירה בשייקר האינקובטור ב 200 סל"ד ו 37 oC עד התרבית OD600 מגיע ~ 0.8 ל 1.0 (~ 12-14 שעות).
    4. מעבירים את התרבית לבקבוק צנטריפוגה מצונן של 400 מ"ל ודגרים על קרח למשך 60-90 דקות. לאחר מכן, כדורו את התאים למטה ב 4 oC במשך 15 דקות ב 4,000 × גרם.
    5. שטפו את התאים פעמיים (כל שטיפה עם 150 מ"ל, בטמפרטורה של 4,000 × גרם, 4 מעלותצלזיוס ו-15 דקות) עם גליצרול 10% סטרילי וקר כקרח.
      הערה: עם כל כביסה, הגלולה הופכת רופפת. יש לנקוט משנה זהירות בעת השלכת כל הסופרנאטנט (לאחר כל שטיפה). אחרת, רוב התאים יאבדו בסופרנטנט שהושלכ.
    6. לשטוף את התאים פעם נוספת עם 75 מ"ל של קר כקרח, סטרילי 10% גליצרול המכיל 0.005% Tween-80.
    7. להשעות מחדש את גלולת התא ב 7.5 מ"ל של 10% גליצרול עם 0.005% Tween-80 ו aliquot לתוך 400 μL aliquots.
      הערה: למרות שתאי Msm electrocompetent מוכשרים לפחות 4 חודשים, תאים אלקטרו-מוכשרים טריים נותנים את התוצאות הטובות ביותר. בעת שימוש בתאים מוכשרים ישנים, כמה מושבות שאינן ורודות (לבנים) מופיעות כטרנספורמציות מזויפות. ככל שהתאים המוכשרים ישנים יותר, כך המושבות הלבנות גדולות יותר.
  10. טרנספורמציה של Msm
    1. הפשירו את התאים המוכשרים של Msm על קרח.
      הערה: הפשרה ב-RT והפיכת תאים כאלה מניבה פחות יעילות.
    2. הוסף 1-2 μL של DNA פלסמיד (~ 200 ng סה"כ) לתאים המוכשרים קרים, לערבב בעדינות עם קצה פיפטה סטרילי 1 מ"ל, ולהעביר לקובט אלקטרופורציה סטרילי 2 מ"מ מקורר מראש.
    3. מעבירים את הקובטה הסגורה עם תאים מוכשרים Msm + תערובת DNA פלסמיד לעכבר של האלקטרופורטור, סוגרים את המכסה בעדינות ומורחים פולס (סוג דעיכה מעריכית) ב 2.5 קילו וולט (מתח), 25 מיקרו F (קיבול) ו 1000 Ω (התנגדות).
    4. מוסיפים מיד 1 מ"ל של חומר סטרילי עשיר שחומם מראש (7H9 + ADC + Tween-80) בינוני לקובט, מערבבים בעדינות עם קצה פיפטה סטרילי 1 מ"ל, ומעבירים את כל התוכן לצינור סטרילי 10 מ"ל.
    5. לדגור את התוכן במשך 3 שעות בשייקר אינקובטור להגדיר 37 oC ו 200 סל"ד. יש לסובב את התכולה בצינור מיקרוצנטריפוגה (4,000 × גרם, RT ו-10 דקות), להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של תווך עשיר סטרילי שחומם מראש, ולמרוח את התרחיף על צלחות אגר 7H11 שזה עתה נמזגו המכילות ADC, Tween-80 והאנטיביוטיקה הנדרשת בריכוזים מתאימים.
      הערה: עבור Msm, בעת הצורך, השתמש Hygromycin, Kanamycin, ו Apramycin בריכוזים הסופיים של 50 מיקרוגרם / מ"ל, 25 מיקרוגרם / מ"ל ו 50 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה. Msm כשלעצמה אינה עמידה לאנטיביוטיקה זו. השתמש באנטיביוטיקה זו רק בעת שימוש בפלסמידים עם הגנים העמידים המתאימים לבחירה/צמיחה של מושבות טרנספורמטים/רקומביננטיות MSM.
    6. לדגור את צלחות פטרי באינקובטור צלחת מוגדר מראש ל 37 oC. בדרך כלל, טרנספורמנטים מופיעים בין 3-5 ימים.
      הערה: אם חלבון מעניין רעיל ל-Msm, הטרנספורמטורים עשויים להופיע מאוחר יותר או לא לצאת. במקרים כאלה, שכפל גרסאות חתוכות באורך מלא.
    7. צור מלאי גליצרול של מושבות MSM המתהוות לאחר אימות לשיבוטים חיוביים (זהה לשלב 3.7)
  11. כדי להעשיר חלבוני R-mEV המכילים חלבוני mCherry או EsxA, יש לגדל תחילה R-Msm המבטא mCherry או exsA או esxA::3X FLAG על ידי ביצוע שלבים 1.2.1 עד 1.2.3 ולאחר מכן בצע את שלבים 2.1 עד 2.6. להעשיר R-mEVs. ה-R-mEVs נפלטים לתוךהשברים ה-4-7 לאחר ספין שיפוע הצפיפות (שלב 2.5). כדורי R-mEV לאחר שלב האולטרה-צנטריפוגה הראשון (2.3.1). לאחר ביצוע זהה לשלב 2.3.1, ודא כי R-mEV נראים כגלולה סגולה כהה עד מגנטה בקוטר 5-7 מ"מ במרכז התחתון של אולטרה צנטריפוגה.
  12. בצע ניתוחים מערביים47 (לא מפורט כאן) כדי לזהות חלבונים בעלי עניין בתוך R-mEV מועשר.

תוצאות

אנו משתמשים ב-M. smegmatis (Msm) כמודל מיקובקטריום כדי להדגים את ההעשרה של mEV מקומיים ורקומביננטיים (R-mEVs). פרוטוקול העשרה סכמטי זה של mEVs (איור 1) פועל גם להעשרה של R-mEV של Msm ושל כלי רכב חשמליים מקומיים של Mtb (עם שינויים קלים כמו בהערות פרוטוקול של 1.2). הדמיה של כלי רכב חשמליים מועשרי?...

Discussion

מאחר שפיתוח חיסון חדשני לשחפת שעדיף על BCG ויכול להחליף אותו נותר אתגר עצום, כחלופה, מספר קבוצות מחפשות גילוי של חיסוני שחפת תת-יחידות שונות שיכולים להגביר את עוצמתו של BCG ולהאריך את משך ההגנה שלו48,49. בהתחשב בתשומת הלב הגוברת לרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) כתת-יח...

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי עבודת מחקר זו נערכה בהיעדר קשרים/אינטרסים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

Acknowledgements

המחברים מודים מקרב לב לפרופ' שרה מ. פורצ'ן על שיתוף המניות של M. smegmatis mc2155. הם גם מכירים ב-Servier Medical Art (smart.servier.com) על כך שהוא מספק כמה אלמנטים בסיסיים עבור איור 1. הם מודים בכנות על תמיכתם של שאר חברי המעבדה בהתאמות המטופלים שלהם במהלך השימוש הממושך בשייקרים של האינקובטור, הצנטריפוגות והאולטרה-צנטריפוגות להעשרת mEV. הם גם מודים למר סורג'יט יאדאב, עוזר המעבדה, על כך שתמיד דאג שכלי הזכוכית והחומרים המתכלים הדרושים יהיו תמיד זמינים ושימושיים. לבסוף, הם מודים לצוותי הניהול, הרכישה והכספים של THSTI על תמיכתם המתמדת ועזרתם בביצוע חלק של הפרויקט.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A2 type Biosafety CabinetThermo Fisher Scientific, USA1300 series
Bench top CentrifugeEppendorf, USA5810 R
BstB1, HindIII, HpaINEB, USANEB
Cell densitometerGE Healthcare, USAUltraspec 10
Citric AcidSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
Dibasic Potassium PhosphateSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
Double Distilled WaterMerck, USA~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettesBio-Rad, USA2 mm
ElectroporatorBio-Rad, USAElectroporator
EsxA-specific AbAbcam, UKRabbit polyclonal
Ferric Ammonium CitrateSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
Floor model centrifugeThermo Fisher Scientific, USASorvall RC6 plus
GlasswareBorosil, INDIA1 L Erlenmeyer flasks
GlycerolSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
HEPES and Sodium ChlorideSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
Incubator shakersThermo Fisher Scientific, USAMaxQ 6000 & 8000
L-AsparagineSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, MillerHi Media, INDIAHi Media
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
Magnetic stirrerTarsons, INDIATarsons
mCherry-specific AbAbcam, UKRabbit monoclonal
MicrowaveLG, INDIAMC3286BLT
Middlebrook 7H9 BrothBD, USADifco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichmentBD, USABBL Middlebrook ADC enrichment
NanodropThermo Fisher Scientific, USASpectronic 200 UV-Vis
NEB5aNEB, USAa derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)Merck, USAAvailable as 60% stock solution (in water)
PCR purification kitHi Media, INDIAHi Media
pH MeterMettler Toledo, USAMettler Toledo
Plasmid DNA mini kitHi Media, INDIAHi Media
Plate incubatorThermo Fisher Scientific, USANew Series
Plasmid pMV261Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific, USAPhusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA PolymeraseNEB, USANEB
Refrigerated circulating water bathThermo Fisher Scientific, USAR20
Middlebrock 7H11 Agar baseBD, USABBL Seven H11 Agar base
SOC brothHi Media, INDIAHi Media
Sodium HydroxideSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
T4 DNA LigaseNEB, USANEB
Tween-80Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
UltracentrifugeBeckman Coulter, USAOptima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mLBeckman Coulter, USAPolyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mLBeckman Coulter, USAPolypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicatorThermo Fisher Scientific, USASonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filtersThermo Fisher Scientific, USANunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentratorsMerck, USAAmicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibodySigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific, USANunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubesCorning, USASterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coliNEB, USANEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherryThis studyMC2 155
Msm expressing cfp29::esxAThis studyMC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAGThis studyMC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA MC2 155

References

  1. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -. F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -. H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -. N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 2/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202Esat 6ExsAmCherryCfp 29

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved