Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Resumo

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Resumo

A maioria das bactérias, incluindo as micobactérias, gera vesículas extracelulares (EVs). Uma vez que os EVs bacterianos (bEVs) contêm um subconjunto de componentes celulares, incluindo metabólitos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, vários grupos avaliaram as versões nativas ou recombinantes de bEVs por sua potência protetora como candidatos a vacinas de subunidades. Ao contrário dos EVs nativos, os EVs recombinantes são projetados molecularmente para conter um ou mais imunógenos de interesse. Na última década, diferentes grupos têm explorado diversas abordagens para a geração de bEVs recombinantes. No entanto, aqui relatamos o projeto, construção e enriquecimento de EVs micobacterianos recombinantes (mEVs) em micobactérias. Para tanto, utilizamos como sistema modelo o Mycobacterium smegmatis (Msm), uma micobactéria avirulenta do solo. Primeiramente descrevemos a geração e o enriquecimento de EVs nativos de Msm. Em seguida, descrevemos o projeto e a construção de mEVs recombinantes que contêm mCherry, uma proteína repórter fluorescente vermelha, ou EsxA (Esat-6), um imunógeno proeminente do Mycobacterium tuberculosis. Conseguimos isso fundindo separadamente mCherry e EsxA N-termini com o término C de uma pequena proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 é uma das poucas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. O protocolo para gerar e enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm permanece idêntico à geração e enriquecimento de EVs nativos de Msm.

Introdução

Apesar do desenvolvimento e administração de uma ampla gama de vacinas contra doenças infecciosas, até hoje, ~30% de todas as mortes humanas ainda ocorrem por doenças transmissíveis¹. Antes do advento da vacina contra a tuberculose (TB) - Bacilo Calmette Guerin (BCG) - a TB era a principal causa de morte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)². Com a administração de BCG e o fácil acesso a medicamentos anti-TB de primeira e segunda linha, em 2022, as mortes relacionadas à TB caíram drasticamente para ~1 milhão/ano em 2022 (ou seja, ~15-20/100.000 habitantes¹). No entanto, em populações endêmicas de TB do mundo, as mortes relacionadas à TB continuam a ser de ~100-550/100.000 habitantes¹. Embora os especialistas reconheçam várias razões que levam a esses números distorcidos, a proteção mediada por BCG que não dura nem mesmo a primeira década de vida parece ser a razão proeminente 3,4,5,6,7. Consequentemente, dados os renovados "Objetivos de Desenvolvimento Sustentável" da ONU e a "Estratégia para Acabar com a TB", da OMS, há um esforço global concertado para desenvolver uma alternativa vacinal muito superior à BCG que talvez forneça proteção vitalícia contra a TB.

Com esse objetivo, vários grupos estão atualmente avaliando cepas de BCG modificadas/recombinantes, espécies de micobactérias não patogênicas e atenuadas que não a BCG e candidatas a subunidades 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Normalmente, as vacinas de subunidades são lipossomas seletivamente carregadas com poucas proteínas imunogênicas purificadas (~1-6) completas ou truncadas do patógeno. No entanto, devido ao seu enovelamento espúrio em conformações não-nativas e/ou interações aleatórias não funcionais entre as proteínas carregadas, as subunidades frequentemente carecem de epítopos nativos e alemães e, portanto, não conseguem preparar suficientemente o sistema imune^14,19,20.

Consequentemente, vesículas extracelulares (EVs) de bactérias têm ganhado ritmo como uma alternativa promissora21,22,23,24,25,26. Tipicamente, os EVs bacterianos (bEVs) contêm um subconjunto de seus componentes celulares, incluindo algumas porções de ácidos nucléicos, lipídios e centenas de metabólitos e proteínas^27,28. Ao contrário dos lipossomas, onde algumas proteínas purificadas são carregadas artificialmente, os bEVs contêm centenas de proteínas naturalmente carregadas, dobradas nativamente, com maior propensão a estimular o sistema imunológico, especialmente sem o impulso/auxílio de adjuvantes e agonistas do receptor Toll-like (TLR)^27,28,29. É nessa linha de pesquisa que nós e outros exploramos a utilidade dos EVs micobacterianos como potenciais impulsionadores de subunidades para BCG³⁰. Apesar das preocupações de que os bEVs não possuem cargas antigênicas uniformes, EVs de Neisseria meningitidis atenuada têm protegido com sucesso os humanos contra o meningococo do sorogrupo B^31,32.

Pelo menos teoricamente, os melhores EVs que poderiam impulsionar bem o BCG são os EVs enriquecidos a partir de bactérias patogênicas. No entanto, o enriquecimento de EVs gerados por micobactérias patogênicas é caro, demorado e arriscado. Além disso, os EVs gerados por patógenos podem ser mais virulentos do que protetores. Diante dos riscos potenciais, relatamos aqui um protocolo bem testado para o enriquecimento de EVs gerados por Msm, uma micobactéria avirulenta cultivada axenicamente.

No entanto, apesar de codificarem vários ortólogos de proteínas patogênicas, as micobactérias avirulentas carecem de vários antígenos vacinais/epítopos proteicos patogênicos necessários para preparar suficientemente o sistema imune em direção à proteção³³. Portanto, também exploramos a construção e o enriquecimento de EVs recombinantes de Msm por meio de engenharia molecular, de modo que uma parcela significativa de qualquer proteína patogênica de interesse expressa e traduzida em Msm, deve atingir seus EVs. Nós hipotetizamos que uma ou mais das 10 principais proteínas abundantes de Msm EVs, quando fundidas à proteína de interesse, ajudarão nessa translocação.

Enquanto estávamos começando a padronizar o enriquecimento de EVs micobacterianos (mEVs) em nosso laboratório, em 2011, Prados-Rosales et al., pela primeira vez, relataram a visualização e o enriquecimento de mEVs in vitro³⁰. Posteriormente, em 2014, o mesmo grupo publicou uma versão modificada de seu método de 2011³⁴. Em 2015, Lee e col. também relataram um método padronizado independentemente para enriquecimento de mEV novamente a partir de culturas axênicas de micobactérias³⁵. Combinando ambos os protocolos^34,35 e incorporando algumas de nossas modificações após padronização completa^, descrevemos aqui um protocolo que ajuda a enriquecer rotineiramente mEVs de culturas axênicas de micobactérias³⁶.

Aqui, detalhamos particularmente o enriquecimento de EVs Msm-específicos, que é uma extensão de um protocolo publicado³⁶ para o enriquecimento de EVs micobacterianos em geral. Também detalhamos como construir mEVs recombinantes (R-mEVs) que contêm a proteína mCherry (como um repórter fluorescente vermelho) e EsxA (Esat-6)^37,38,39, um imunógeno predominante e uma potencial subunidade vacinal do Mycobacterium tuberculosis. O protocolo para o enriquecimento dos R-mEVs permanece idêntico ao que descrevemos para o enriquecimento dos EVs nativos de Msm.

Protocolo

1. Condições de crescimento de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli e seus derivados

1. Mídia
   1. Caldo líquido Middlebrook 7H9
      1. Prepare a solução-estoque de Tween-80 a 20% pré-aquecendo o volume necessário de água bidestilada (ddw) em um copo de vidro a ~45-50 o C em um micro-ondas, adicione o volume necessário de Tween-80 usando um cilindro de medição apropriado e mexa continuamente em um pequeno agitador magnético para trazer ^oTween-80 a 20% para uma solução uniforme. Filtrar o Tween-80 a 20% através de um filtro de eliminação de 0,22 um e armazenar a solução-mãe amarelo pálido a 4 ^oC.
         NOTA: Todos os vestígios de Tween-80 no cilindro de medição devem ser transferidos para o copo para uma concentração final precisa. Não autoclave o estoque preparado Tween-80. Filtrar (utilizar 0,22 μM) esterilizar e conservar a 4 ^oC.
      2. Siga as instruções do fabricante para o preparo do caldo 7H9. Suspender 4,7 g de pó 7H9 em 900 mL de ddw. Adicionar 2 mL de glicerol, misturar o conteúdo e autoclave a 121 ^oC, 15 psi por 20 min.
         Observação : não adicione enriquecimento ADC (ADC) Middlebrook e Tween-80 antes da autoclavagem.
      3. Após o resfriamento do meio autoclavado à temperatura ambiente (RT, ou seja, ~25 ^oC), em um gabinete de biossegurança padrão tipo A2, adicionar assepticamente 10x estoque de 100 mL de ADC (final 1x) e 2,5 mL (final 0,05%) de Tween-80 a 20%. Filtrar a mistura através de uma unidade de filtragem descartável de 0,22 μm e conservar a solução-mãe transparente verde-amarelada muito clara a 4 ^oC.
         NOTA: O pH do meio deve ser de ~6,6 a 6,8 (se <6,4 ou >7,0, descarte e faça fresco). Armazenar a 4 ^oC (estável por 3-4 semanas). É altamente recomendável filtrar o meio 7H9 (após a adição de ADC e Tween-80) duas vezes através de duas unidades de filtro descartáveis independentes de 0,22 μm.
   2. Caldo líquido de Sauton (meio mínimo)
      1. Dissolver L-asparagina (0,4% p/v) e ácido cítrico (0,2% p/v) em 950 mL de ddw. Adicionar 1 mL de 1.000x estoques recém-preparados (em ddw) de fosfato dibásico de potássio (incolor; estoque 10 g/20 mL; final 1x 0,5 g/L); sulfato de magnésio heptahidratado (incolor; estoque 10 g/20 mL; final 1x 0,5 g/L); e citrato de amônio férrico (marrom muito claro; estoque 1,6 g/40 mL; final 1x 0,04 g/L) e agitar bem em um agitador magnético.
         NOTA: Na melhor das hipóteses, os estoques de 1.000x podem ter 2 semanas; se for mais antigo do que isso, preparar novas existências; guarde-os no RT no escuro (por exemplo, dentro de um armário/prateleira). Se o citrato de amônio férrico for marrom escuro, elimine-o e torne-o fresco. É melhor adicionar os três sais na ordem mencionada na etapa 1.1.2.1. Agite a solução sempre antes de adicionar cada solução de sal.
      2. Meça e anote o pH usando um medidor de pH; Certifique-se de que está em torno de 3,1 a 3,2. Se o pH for superior a 3,7, descarte os caldos e prepare frescos. Para ajustar o pH a 7,4, use quantas gotas de hidróxido de sódio 10 N forem necessárias. Monitore o pH final enquanto agita continuamente a solução/meio em um agitador magnético.
      3. Adicionar 4,76 mL de glicerol, 0,25 mL de Tween-80 a 20% (0,005% final, ver também nota para o passo 2.2.1.3) e, só então, completar o volume para 1 L. Em seguida, filtrar-esterilizar duas vezes o 1 L do meio com dois filtros de descarte separados de 0,22 μm. Conservar o meio límpido e incolor a 4 ^oC (estável durante 2 semanas).
         NOTA: Somente após o pH ser ajustado para 7,4, adicionar glicerol. Caso contrário, a mídia ficará branca e turva. Se estiver nublado, descarte (não tente aquecê-lo) e prepare-o fresco. Para todas as preparações de mEVs, use Sauton's recém-preparados.
   3. Base de ágar Middlebrook 7H11
      1. Siga as instruções do fabricante para a preparação. Suspender 19 g de pó 7H11 em 900 mL de ddw. Adicionar 5 mL de glicerol, agitar em um agitador magnético para obter uma suspensão uniforme (verde pálido; pH 6,6 a 6,8; se >7,2, descartar e preparar fresco) e autoclave a 121 ^oC, 15 psi e por 20 min.
         NOTA: Não adicione ADC e 0,05% Tween-80 antes da autoclavação.
      2. Quando o meio esfriar a ~50 ^oC, assepticamente em uma cabine de biossegurança tipo A2, adicionar 100 mL de ADC (levado à RT) e 2,5 mL de 20% (final 0,05%) de Tween-80 (trazido à RT). Imediatamente dispensar assepticamente em placas de Petri.
         NOTA: As placas são estáveis a 4 ^oC por pelo menos 4-6 semanas. Certifique-se de que as placas estejam em RT durante a noite antes de enrolá-las para armazenamento de 4 ^oC. Caso contrário, a umidade ficará presa nas placas durante a incubação a 37 ^oC.
   4. Caldo Miller Luria Bertani (LB) e base de Agar
      1. Siga as instruções do fabricante para a preparação. Para preparar o caldo LB, suspenda 25 g de pó em 1.000 mL de ddw e mexa suavemente por 5 min em um copo de vidro em um agitador magnético. Após suspensão uniforme, aliquote os volumes necessários em frascos de mídia (por exemplo, 300 mL em um frasco de mídia de 500 mL) e autoclave. Para preparar Agar LB, suspender 40 g de pó em 1.000 mL de ddw e autoclave (12 g de pó em 300 mL ddw em um frasco de 500 mL de vidro médio).
2. Condições de crescimento
   OBS: Todas as etapas do trabalho de cultura bacteriana devem ser realizadas em gabinete de biossegurança (tipo A2). Todas as culturas devem ser processadas com tubos estéreis, frascos e ponteiras de pipetas.
   1. Dia 1
      1. Adicionar 1 mL de cada estoque de glicerol de Msm (de -80 o C freezer) a 2 x 10 mL (em 50 mL de tubos estéreis cônicos centrifugados) de caldo 7H9 recém-autoclavado, resfriado e pré-aquecido (~37 o C), girar três vezes, fechar as tampas e incubar os tubos durante a noite a 37 ^oC e 200-220 rpm (agitador de incubadora).
         NOTA: Para cultivar Mycobacterium tuberculosis (Mtb), siga etapas semelhantes, mas incube os tubos de 50 mL por 4-6 dias a 37 ^oC e 120-150 rpm (agitador de incubadora) em configurações BSL3. Seguir TODAS as diretrizes internacionais e práticas de biossegurança dos patógenos BSL3 e Grupo de Risco 3 ao manusear e descartar o M. tuberculosis e suas culturas. Utilizar cabine de biossegurança tipo B2 para manuseio do M. tuberculosis e suas culturas.
   2. Dia 2
      1. Quando OD₆₀₀ (A_600nm; densitômetro de células) atingir ~1,0, centrifugar as culturas de Msm por 10 min a 3.200 × g e RT (centrífuga de bancada). Descarte os sobrenadantes com ponteiras de pipeta estéreis de 1 mL.
         NOTA: O passo acima permanece o mesmo para culturas de M.B., exceto que o número de dias é de 4-7. Certifique-se de não tocar o pellet bacteriano com a ponta da pipeta.
      2. Lavagem: A cada pastilha de Msm, adicionar 1 mL de meio de Sauton pré-aquecido (em RT) (passo 1.1.2) e ressuspender suavemente com pontas de pipeta de 1 mL para obter uma suspensão uniforme. Usando ponteiras de pipeta estéreis, perfaça os volumes de 10 mL (em cada) com o mesmo meio. Centrifugar as suspensões por 10 min a 3.200 × g e RT e descartar os sobrenadantes. Repita esta etapa mais uma vez.
         NOTA: O passo acima permanece o mesmo para culturas de Mtt.
      3. Ressuspender as células de Msm duplamente lavadas em 20 mL (cada) de Sauton pré-aquecido (pré-aquecido em uma placa ou incubadora de agitação) e medir a densidade óptica das células a 600 nm. Inocular o volume necessário de culturas de Msm em frascos de Erlenmeyer estéreis de 1 L contendo ~330 mL de Sauton's estéreis de tal forma que o OD₆₀₀ final seja ~0,05.
         NOTA: As ressuspensões devem sempre começar em um volume pequeno. Se o volume final for adicionado diretamente ao pellet como um único passo, as células permanecerão como pellets difusos (um indicador de má reuspensão). A única maneira de resolver o problema é girar as culturas para baixo e refazer a ressuspensão conforme recomendado. O passo acima permanece o mesmo para as culturas de M. tuberculosis.
   3. Dia 2/3
      1. Incubar os 330 mL de cultura no agitador da incubadora a 200 rpm e 37 ^oC até que a cultura OD₆₀₀ atinja ~0,3. Em seguida, lave as células uma vez (semelhante ao passo 1.2.2.2, mas com volume igual) e, em seguida, ressuspenda o pellet no mesmo volume. Distribuir 50 mL das culturas ressuspensas cada uma em seis frascos estéreis de 1 L de Erlenmeyer estéreis, cada um contendo 280 mL de Sauton's pré-aquecidos estéreis com 1/10^th de Tween-80 normalmente usado (0,05%), ou seja, 0,005% (veja também a nota do passo 2.2.1.3. para entender por que 1/10^th). O OD₆₀₀ final deve ser aprox. 0,05.
         NOTA: Para culturas de M. B, em vez de frascos de Erlenmeyer, utilizar garrafas de rolo (de capacidade de 1/2/4 L). Ajustar o volume de cultura por frasco de modo que, quando mantida no aparelho de roletes, a cultura não atinja a boca do frasco. O volume real na garrafa de rolo dependerá da capacidade da garrafa de rolo.
      2. Incubar cada uma das culturas de 330 mL no agitador da incubadora a 200 rpm e 37 o C até que ^oOD₆₀₀ atinja 2,0 a 2,5 (~15-18 h).
         NOTA: Para culturas de Mtt, certifique-se de que o OD₆₀₀ final é ~1.0-1.2 (leva ~5-8 dias).

2. Enriquecimento de mEVs de Msm empregando centrifugação por gradiente de densidade

1. Dia 4
   1. Centrifugar os ~2 L de culturas de Msm de estágio médio exponencial em frascos de centrífuga estéreis de 6 x 400 mL a 4 ^oC por 20 min a ~8.000 × g (centrífuga modelo chão). Recolher o sobrenadante de meio/cultura gasto em dois frascos de Erlenmeyer de 1 L pré-refrigerados e autoclavados e armazenar uma alíquota do pellet para quaisquer procedimentos analíticos (tais como SDS-PAGE e western blotting-não detalhados aqui).
      NOTA: Todas as etapas subsequentes devem ser executadas a frio (~ 4 °C) para melhor manter a integridade dos mEVs. Os mEVs são bastante estáveis no RT, mas a refrigeração é essencial para a estabilidade a longo prazo (congelamento e descongelamento repetidos não são recomendados). Durante o crescimento da cultura axênica, os mEVs se desassociam da superfície de Msm/Mtb e se acumulam no sobrenadante/meio gasto da cultura.
   2. Filtrar primeiro o sobrenadante da cultura de Msm através da(s) unidade(s) filtrante(s) de eliminação de 0,45 μm e, em seguida, através da(s) unidade(s) filtrante(s) de eliminação de 0,22 μm para remover todos os vestígios de bactérias.
      NOTA: A filtração directa através dos filtros de 0,22 μm sufoca frequentemente as unidades filtrantes (uma vez que o pellet bacteriano pode ser perturbado durante a execução do passo 2.1.1.). Para gerar sobrenadantes de cultura de M. B. tuberculosis, realizar três filtrações de culturas de M. tuberculosis (isto é, primeira etapa de filtração com uma unidade de filtro descartável de 0,45 μm; duas etapas consecutivas de filtração com unidades de filtro descartáveis de 0,22 μm) antes de mover os filtrados de cultura para configurações BSL-2.
2. Dia 4/5
   1. Use os concentradores de membrana de 30 kDa para concentrar o filtrado de cultura de Msm (~2 L) até ~ 38 mL, centrifugando o filtrado de cultura a 4 ^oC, 20 min e a 3.200 × g.
      1. Pré-lave os concentradores primeiro com ddw frio estéril (~15 mL) (lave a 4 ^oC, 5 min e a 3.200 × g).
      2. Lavar com ~15 ml de Sauton's pré-filtrados e frios (mesmas condições que para a água (2.2.1.1.)) para remover todos os vestígios de produtos químicos (utilizados durante o fabrico).
      3. Uma vez que ~130 centrícones (se um uso apenas) são tecnicamente necessários para concentrar ~2 L de filtrado de cultura, reutilize os centríconos pelo menos 3-4 vezes, se necessário. Siga estas etapas: concentrar 15 mL a 0,5 a 1,0 mL (seguir o passo 2.2.1), transferir o concentrado para um tubo de ultracentrífuga de 38 mL limpo, autoclavado e frio e, em seguida, transferir novamente o filtrado de cultura não concentrado restante para os centrícones usados para concentração repetida.
         NOTA: Usar concentradores de 24, 30 kDa para concentrar 2 L de filtrado de cultura levará até 6 h. Ao concentrar o filtrado de cultura, o Tween-80 também fica concentrado e pode bloquear o concentrador. Usar Tween-80 para 0,005% final (em vez de 0,05%) na mídia de Sauton ajuda a prevenir esse bloqueio. A concentração reduzida de Tween-80 não afeta a suspensão uniforme de Msm durante o crescimento e não causa aglomeração de células de Msh. No entanto, como as células Mtb se aglomeram a 0,005% de Tween-80, use 0,05% de Tween-80 para EVs específicos para Mtb.
   2. Transfira o filtrado de cultura de Msm concentrado (~38 mL) para um tubo de centrifugação de polipropileno limpo, lavado (com ddw) e pré-resfriado de 40-50 mL e submeta-o a uma centrifugação em duas etapas, primeiro a 4.000 × g e depois a 15.000 × g, ambas as etapas a 4 ^oC por 20 min (para remover todos os detritos). Use uma centrífuga tipo piso para o mesmo.
3. Dia 5/6
   1. Transferir o sobrenadante da cultura para um tubo de ultracentrífuga de polipropileno pré-resfriado de 38,5 mL e girá-lo em uma ultracentrífuga a 100.000 × g por 4 h a 4 ^oC.
      NOTA: Uma caçamba oscilante funciona melhor nessa velocidade. Certifique-se de encher o tubo ultracentrífugo até a borda e ter um tubo de ultracentrífuga de equilíbrio de peso equivalente. Se qualquer um dos tubos estiver preso à caçamba oscilante após a centrifugação (o que acontece devido à condensação), usando pinças, remova-o suavemente do rotor. Limpar a umidade condensada presente na superfície externa da ultracentrífuga antes da ultracentrifugação evita a aderência.
   2. Guarde o sobrenadante num tubo pré-refrigerado de 50 ml (ver nota). Inverta o tubo de ultracentrífuga em um papel absorvente fresco sem fiapos para remover vestígios do sobrenadante. Ressuspender o pellet em 600 μL de solução tampão HEPES (50 mM HEPES e 150 mM NaCl, pH 7,4; filtrar-esterilizar antes do uso).
      Observação : salve o sobrenadante somente como um backup. A pelota nativa de mEV aparece como uma mancha gelatinosa, de 5 a 7 mm de diâmetro, amarelo acinzentado opaco a translúcido. Se nenhuma pastilha estiver visível, repita a etapa 2.3.1 reutilizando o sobrenadante salvo. Se nenhum pellet aparecer após a repetição da etapa 2.3.1, descarte e reinicie a partir da etapa 1.2. A pelota leva tempo para ressuspender. Recomenda-se adicionar o tampão HEPES e deixá-lo durante a noite a 4 ^oC para facilitar a reuspensão. Ressuspenda suavemente, mas com pipetagem repetida (use pontas P200 para melhor reuspensão) até uma reuspensão uniforme.
4. Dia 6
   1. Submeter o pellet ressuspendido à centrifugação por gradiente de densidade à base de 'iodixanol'.
      1. Coloque o pellet ressuspendido no fundo do tubo de ultracentrífuga de polipropileno ultratransparente de 13 mL limpo, lavado (com ddw) e pré-resfriado e misture suavemente (use pipeta de 1 mL) com ~4 mL de solução de gradiente de densidade inerte 'iodixanol' (comercialmente disponível como uma solução de ~60% p/v). Após a colocação em camadas do pellet ressuspendido no fundo do tubo (até um máximo de 5 mL), sobreponha com 1 mL (p/v) cada um dos subestoques de 40%, 30%, 20% e 10% de 'iodixanol' na respectiva ordem (prepare sub-estoques (com tampão HEPES) a partir de 60% de estoque). Em seguida, adicione 4 mL de 6% de sub-estoque (preparado a partir de 60% de estoque com tampão HEPES) na parte superior para encher o tubo.
         NOTA: Prepare o gradiente imediatamente antes de usar; Nunca armazene e use.
      2. Com cuidado (sem agitar), pese o tubo em um copo de vidro e transfira-o suavemente para o rotor da caçamba oscilante.
         NOTA: A pesagem é necessária para equilibrar com um tubo fictício (também pesado).
      3. Submeter-se a ultracentrifugação a 141.000 × g por 16 h a 4 ^oC.
5. Dia 7
   1. Remover cuidadosamente o tubo (ver nota do passo 2.3.1) e recolher fracções de 1 ml em tubos de microcentrífuga recém-autoclavados; preste atenção às frações 4^a 6^, que normalmente contêm os mEVs Msm.
      NOTA: Os mEVs dessas frações normalmente fracionam em três ou quatro bandas de mEVs (uma é a banda principal) que são de cor branca fosca. Os R-mEVs contendo mCherry fracionam na 5ª a^7ª frações e aparecem roxo escuro a magenta. Os Mtb EVs tipicamente fracionam na^5ª a^7ª frações. A separação dos mEVs no gradiente depende da concentração do gradiente usado e quão bem o gradiente é estratificado. Se os mEVs se romperem parcialmente, eles podem fracionar em frações anteriores. Alternativamente, se o pellet obtido após a etapa 2.3.2 não for bem ressuspenso, as vesículas formam micropellets densos que se fracionam como frações posteriores. Recomendamos a coleta precisa das frações somente quando o usuário quiser avaliar qual das frações de 1 mL contém os mEVs. Os usuários podem gostar de alíquota em frações menores ou maiores com base em sua conveniência. Quando os usamos para determinadas aplicações, por exemplo, testando-os como um potencial reforço vacinal de subunidade para BCG, limitamos nossa coleta dos mEVs a menos de 250 μL das frações (onde os mEVs fracionam) para que possamos coletar especificamente apenas as bandas de mEVs e processá-los conforme indicado em 2.7.5. Isso ajuda a remover de forma mais eficaz todos os vestígios de iodixanol que podem interferir no caminho de nossos experimentos a jusante.
6. Dia 8
   1. Agrupar as frações contendo mEVs, diluir com tampão HEPES até 38 mL e repetir a ultracentrifugação a 4 o C por 16 ^ha 100.000 × g. Ressuspenda o pellet (como na etapa 2.3.2 com os mesmos cuidados) em tampão HEPES ou em qualquer tampão que experimentos a jusante (não detalhados aqui), como estimativa de proteínas, análises de nano-rastreamento, coloração negativa, microscopia eletrônica de transmissão, western blotting e marcação imuno-ouro exigem.
      NOTA: Para uma melhor ressuspensão, sonicate o tubo contendo mEV por 10 minutos usando um sonicador de banho de água ultrassônico. Sonicating por um tempo mais longo pode iniciar a ruptura e perda de mEVs intactos. Se bem suspenso, a sonicação é desnecessária. Todas as etapas da 2.1 a 2.6 são idênticas, enriquecendo os EVs gerados por Mtb.

3. Construção e enriquecimento de mEVs recombinantes.

NOTA: Uma das 10 proteínas mais abundantes (identificadas por espectrometria de massa) de Msm EVs é a Cfp-29³⁰. Dado seu pequeno tamanho (29 kDa), estrutura secundária simples 40, localização na membrana 41 e propensão a ser secretada em meios usados em culturas axênicas (por exemplo, como uma proteína filtrada de cultura; secretada por Msm e Mtb^42,43, aqui^, ela tem sido explorada para entregar um repórter fluorescente vermelho e uma proteína de interesse (EsxA_Mtb) em mEVs. Para isso,

1. Empregar primers diretos e reversos apropriados (Tabela 1; compatível para ser clonado diretamente em um vetor de vaivém como pMV261) para amplificar cfp-29 de Msm. Usando ~50 ng de DNA genômico de alto peso molecular (~>20 kb) como modelo, amplificar por PCR o fragmento do gene cfp-29 com uma polimerase de DNA de revisão de alta fidelidade (como Phusion ou Q5). Siga as recomendações do fabricante para PCR.
   NOTA: Projete os locais de restrição necessários em primers para facilitar a clonagem em qualquer vetor de transporte alternativo de interesse. As condições e o volume da PCR variam de acordo com o tipo e a marca da DNA polimerase de revisão que está sendo usada. O volume da mistura de reação irá variar dependendo da quantidade de molde de DNA e quantidade de revisão de DNA polimerase. Siga as recomendações do fabricante para condições de PCR, sucesso da amplificação e eliminação do recozimento inespecífico dos primers.
2. A PCR purifica o amplicon eluído com qualquer kit de purificação de PCR disponível comercialmente e verifica o comprimento do amplicon por eletroforese em gel de agarose padrão. Digerir o amplicon purificado.
   1. Estimar a quantidade de amplicon purificado em um espectrofotômetro. Use pelo menos 2 μg de cfp-29 amplicon para digestão.
   2. Digerir primeiro com BstB1 ^a65 o C durante 1 h (tipo e quantidade de tampão e enzima, de acordo com as recomendações do fabricante), reduzir a temperatura de reacção para RT e, em seguida, digerir com HindIII durante 1 h a 37 ^oC (tipo e quantidade de tampão e enzima, de acordo com as recomendações do fabricante).
   3. A PCR purifica e elui o amplicon digerido em 50 μL de ddw livre de nuclease autoclavada.
   4. Estimar a concentração e o rendimento do amplicon digerido usando um espectrofotômetro. Conservar a -20 ^oC até à fixação da ligadura. NOTA: Após a PCR, verifique o comprimento do amplicon (~798 + 50 pb) e o rendimento por eletroforese de 10 μL da mistura PCR-reação em um gel de agarose a 1%. Embora a digestão dupla não seja possível com esta combinação de enzimas, um tampão compatível evitará a purificação repetida da PCR e a subsequente perda do amplicon digerido. A concentração de amplicon digerido varia de acordo com o kit utilizado para purificação por PCR. Também varia com o comprimento (em pb) de quaisquer vetores alternativos de escolha.
3. Empregar os primers forward e reverse (Tabela 1), uma revisão de DNA polimerase, e ~50 ng de DNA genômico Mtb, PCR amplificar esxA- ou esxA-3X FLAG-tag amplificcon específico. Use ~5 ng de DNA plasmidial apropriado para amplificar o mCherry por PCR. Os detalhes do plasmídeo e da sequência estão no Arquivo Suplementar 1.
   NOTA: Use um ligador de glicina, glicina, glicina, glicina, serina ^44,45(^G4S) entre cfp-29 e mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; antes do início do mCherry, o linker G4S ajuda o mCherry a não sofrer dobras não funcionais espúrias (incluindo aquelas acionadas pelo Cfp-29). Consulte as sequências cfp-29, hsp60 promoter, mCherry e esxA no Arquivo Suplementar 1. Plasmídeos servindo como modelos para mCherry estão disponíveis em diferentes repositórios/bancos de plasmídeos. Diferentes versões (sequências ligeiramente alteradas) do mCherry estão disponíveis que exigirão sequências de primer para frente e para trás alteradas. Os primers (Tabela 1) auxiliam na amplificação do mCherry mencionado no Arquivo Suplementar 1. A fusão do término N de mCherry/esxA/esxA::3XFLAG com a extremidade do terminal C de Cfp-29 funciona bem.
4. Digerir 1 μg de DNA dos amplicons mCherry/esxA/esxA::3XFLAG e purificar o DNA digerido.
   1. Digerir duas vezes cada amplicon com HindIII e HpaI por 1 h a 37 ^oC (ou conforme recomendações do fabricante).
   2. Use um kit de purificação de PCR disponível comercialmente e as recomendações do fabricante para purificar o amplicon digerido. Eluir o amplicon digerido em 50 μL de ddw livre de nuclease autoclavada.
   3. Estimar a concentração e o rendimento do amplicon digerido usando um espectrofotômetro. Conservar a -20 ^oC até à fixação da ligadura.
5. Digestir 2 μg de pMV261-Kan^R (Arquivo Suplementar 1) ou um vetor de clonagem adequado com a(s) enzima(s) de escolha.
   1. Digerir primeiro com BstB1 ^a65 o C durante 1 h (tipo e quantidade de tampão e enzima, de acordo com as recomendações do fabricante), reduzir a temperatura de reacção para RT e, em seguida, digerir com HindIII durante 1 h a 37 ^oC (tipo e quantidade de tampão e enzima, de acordo com as recomendações do fabricante).
   2. Gel purificar e eluir em 50 μL de ddw livre de nuclease autoclavada.
   3. Estimar a concentração e o rendimento do vetor digerido usando um espectrofotômetro. Conservar a -20 ^oC até à fixação da ligadura.
      Observação : clonagem de dois fragmentos de uma etapa é possível com os primers acima para pMV261. Qualquer vetor de vaivém alternativo que sobreviva como um epissoma funcionará. Plasmídeos integrativos também funcionarão, mas o rendimento de proteínas recombinantes será relativamente menor por base celular.
6. Ligate e transformar-se em uma cepa compatível de E. coli.
   1. Para a ligadura, utilizar 125 ng do vetor. Use amplicons mCherry/esxA/esxA::3XFLAG adequadamente digeridos em uma proporção molar de 1:3. Realizar ligadura durante a noite usando T4 DNA Ligase (quantidade de acordo com as recomendações do fabricante) a 16 °C em banho-maria circulante refrigerado.
      NOTA: Use controles apropriados, como vetor apenas com e sem T4 DNA Ligase para avaliar a eficiência da digestão e prever a eficiência do sucesso da clonagem.
   2. Transformação
      1. Descongelar alíquotas de células quimicamente competentes NEB5α (~100 μL por transformação) no gelo por 15 min. Misture suavemente duas vezes com uma ponta de pipeta estéril. Adicionar a mistura de ligadura (até 20 μL) às células competentes a frio.
      2. Misture suavemente as células da pipeta + o DNA ligado. Incube a mistura no gelo por mais 30 min.
      3. Fornecer choque térmico a 42 °C (em banho-maria circulante) por 60 s e transferir imediatamente de volta para o gelo por mais 15 minutos.
      4. Recuperar as células transformadas adicionando 1 mL do caldo SOC (2% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₄ e 20 mM de glicose) e incubar a 37 °C por 1 h a 200 rpm.
      5. Gire as bactérias recuperadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (3000 × g, RT e 10 min), descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de LB estéril, pré-aquecido e recém-preparado e espalhe a suspensão em placas de ágar LB Miller recém-derramadas contendo os antibióticos necessários em concentrações apropriadas.
      6. Incubar as placas de Petri em uma incubadora de placas preajustada a 37 ^oC.
7. Rastreie (não detalhado aqui) possíveis clones, verifique (por PCR de colônia/enzimas de restrição)⁴⁶ e sequencie-os (sequenciamento de Sanger) para confirmar a fusão.
8. Extrair o DNA plasmidial (~200 ng/1-2 μL; qualquer kit disponível comercialmente) do clone confirmado (fundo de E. coli ) e transformá-lo em células eletrocompetentes recém-fabricadas de Msm.
9. Preparação de células eletrocompetentes Msm
   1. Recém-cultivar Msm (como nas etapas 1.2.1 e 1.2.2). Lave o Msm recém-crescido como nos passos 1.3.3 e 1.3.4 (exceto, use 7H9 + ADC + Tween-80 (rico) em vez de Sauton).
   2. Adicionar uma alíquota das células de Msm lavadas a um OD₆₀₀ final de ~0,05 num balão de Erlenmeyer estéril de 500 ml contendo 150 ml de meios ricos.
   3. Incubar no agitador da incubadora a 200 rpm e 37 ^oC até que a cultura OD₆₀₀ atinja ~0,8 a 1,0 (~12-14 h).
   4. Transfira a cultura para um frasco de centrífuga pré-resfriado de 400 mL e incube no gelo por 60-90 min. Em seguida, peletize as células a 4 ^oC por 15 min a 4.000 × g.
   5. Lavar as células duas vezes (cada lavagem com 150 mL, a 4.000 × g, 4 ^oC e 15 min) com glicerol 10% gelado, estéril (autoclavado).
      OBS: A cada lavagem, o pellet fica solto. Tenha cuidado ao descartar todo o sobrenadante (após cada lavagem). Caso contrário, a maioria das células será perdida no sobrenadante descartado.
   6. Lavar novamente as células com 75 mL de glicerol 10% estéril e gelado, contendo 0,005% de Tween-80.
   7. Ressuspender o pellet celular em 7,5 mL de glicerol a 10% com Tween-80 a 0,005% e alíquota em alíquotas de 400 μL.
      NOTA: Embora as células eletrocompetentes de Msm sejam competentes por pelo menos 4 meses, as células eletrocompetentes recém-preparadas dão os melhores resultados. Ao usar células velhas e competentes, algumas colônias não rosas (brancas) aparecem como falsos transformadores. Quanto mais velhas as células competentes, mais as colônias brancas.
10. Transformação do Msm
    1. Descongele a alíquota das células competentes do MSM no gelo.
       NOTA: Descongelar em RT e transformar essas células produz menos eficiência.
    2. Adicione 1-2 μL de DNA plasmidial (~200 ng total) às células competentes frias, misture suavemente com uma ponta de pipeta estéril de 1 mL e transfira para uma cubeta de eletroporação estéril pré-refrigerada de 2 mm.
    3. Transfira a cubeta fechada com células competentes de Msm + mistura de DNA plasmidial para o camundongo do elctroporator, feche a tampa suavemente e aplique um pulso (tipo decaimento exponencial) a 2,5 kV (tensão), 25 μF (capacitância) e 1000 Ω (resistência).
    4. Adicione imediatamente 1 mL de meio rico estéril pré-aquecido (7H9 + ADC + Tween-80) à cubeta, misture delicadamente com uma ponta de pipeta estéril de 1 mL e transfira todo o conteúdo para um tubo estéril de 10 mL.
    5. Incubar o conteúdo durante 3 h num agitador de incubadora regulado para 37 ^oC e 200 rpm. Gire o conteúdo em um tubo de microcentrífuga (4.000 × g, RT e 10 min), descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de meio rico pré-aquecido estéril e espalhe a suspensão em placas de ágar 7H11 recém-derramadas contendo ADC, Tween-80 e os antibióticos necessários em concentrações apropriadas.
       NOTA: Para Msm, quando necessário, use higromicina, canamicina e apramicina nas concentrações finais de 50 μg/mL, 25 μg/mL e 50 μg/mL, respectivamente. O HSH per se NÃO é resistente a esses antibióticos. Utilizar estes antibióticos apenas quando utilizar plasmídeos com genes resistentes apropriados para a seleção/crescimento de transformantes/colónias de Msm recombinantes.
    6. Incube as placas de Petri em uma incubadora de placas predefinida para 37 ^oC. Normalmente, os transformantes aparecem entre 3-5 dias.
       NOTA: Se uma proteína de interesse é tóxica para Msm, os transformantes podem surgir mais tarde ou não emergir. Nesses casos, clone versões truncadas do comprimento completo.
    7. Fazer estoques de glicerol das colônias emergentes de Msm após verificação de clones positivos (igual ao passo 3.7)
11. Para enriquecer R-mEVs contendo proteínas mCherry ou EsxA, primeiro cultive R-Msm expressando mCherry ou exsA ou esxA::3X FLAG seguindo as etapas 1.2.1 a 1.2.3 e, em seguida, siga as etapas 2.1 a 2.6. para enriquecer R-mEVs. Os R-mEVs eluem na 4ª-7ª fração pós-gradiente de densidade spin (etapa 2.5). O pellet R-mEVs após a primeira etapa de ultracentrifugação (2.3.1). Depois de executar idêntico ao passo 2.3.1, confirme se os R-mEVs são visíveis como um pellet roxo escuro a magenta de 5-7 mm de diâmetro no centro inferior da ultracentrífuga.
12. Realizar análises ocidentais⁴⁷ (não detalhadas aqui) para detectar proteína(s) de interesse dentro dos R-mEVs enriquecidos.

Resultados

Usamos M. smegmatis (Msm) como micobactéria modelo para demonstrar o enriquecimento de mEVs nativos e recombinantes (R-mEVs). Este protocolo de enriquecimento de mEVs esquematicamente resumido (Figura 1) também funciona para o enriquecimento de R-mEVs de Msm e EVs nativos de Mtb (com pequenas modificações como nas notas de protocolo de 1.2). A visualização dos mEVs enriquecidos requer coloração negativa em microscópio eletrônico de transmissão³⁶ (<...

Discussão

Uma vez que o desenvolvimento de uma nova vacina contra TB que seja superior e possa substituir a BCG continua sendo um desafio formidável, como alternativa, vários grupos estão buscando a descoberta de diferentes vacinas contra TB de subunidades que possam aumentar a potência da BCG e estender sua duração protetora^48,49. Dada a crescente atenção aos EVs bacterianos (bEVs) como subunidades potenciais e como adjuvantes naturais^50,51...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155