Обогащение нативных и рекомбинантных внеклеточных везикул микобактерий

Резюме

В этом протоколе подробно описывается обогащение нативных микобактериальных внеклеточных везикул (mEV) из аксенических культур Mycobacterium smegmatis (Msm) и то, как можно спроектировать и обогатить mCherry (красный флуоресцентный репортер), содержащие рекомбинантные MsmEV. Наконец, он подтверждает новый подход с обогащением MsmEV, содержащих белок EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Аннотация

Большинство бактерий, включая микобактерии, продуцируют внеклеточные везикулы (ВВ). Поскольку бактериальные ВВ (бВВ) содержат подмножество клеточных компонентов, включая метаболиты, липиды, белки и нуклеиновые кислоты, несколько групп оценили либо нативные, либо рекомбинантные версии ВВ на предмет их защитной активности в качестве субъединичных вакцин-кандидатов. В отличие от нативных ВВ, рекомбинантные ВВ имеют молекулярную инженерию, содержащую один или несколько интересующих иммуногенов. За последнее десятилетие различные группы исследовали различные подходы к созданию рекомбинантных электромобилей. Однако здесь мы сообщаем о разработке, конструировании и обогащении рекомбинантных микобактериальных ВВ (мВВ) в микобактериях. Для этого в качестве модельной системы мы используем Mycobacterium smegmatis (Msm), авирулентную почвенную микобактерию. Сначала мы опишем генерацию и обогащение нативных электромобилей Msm. Затем мы описываем дизайн и конструкцию рекомбинантных mEV, которые содержат либо mCherry, красный флуоресцентный репортерный белок, либо EsxA (Esat-6), известный иммуноген Mycobacterium tuberculosis. Мы достигаем этого путем раздельного слияния mCherry и EsxA N-концов с С-концом небольшого белка Msm Cfp-29. Cfp-29 является одним из немногих белков, присутствующих в изобилии в MsmEV. Протокол генерации и обогащения рекомбинантных mEV из Msm остается идентичным протоколу генерации и обогащения нативных EV Msm.

Введение

Несмотря на разработку и применение широкого спектра вакцин против инфекционных болезней, даже по сей день ~30% всех случаев смерти людей по-прежнему происходит от инфекционных^{болезней1}. До появления вакцины против туберкулеза (ТБ) - Bacillus Calmette Guerin (БЦЖ) - туберкулез был убийцей номер один (от ~10 000 до 15 000 на 100 000 населения)². Благодаря введению БЦЖ и легкому доступу к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии к 2022 г. смертность, связанная с туберкулезом, резко снизилась до ~1 млн/год к 2022 г. (т.е. ~15-20 на 100 000^{населения1}). Тем не менее, в эндемичных по туберкулезу популяциях мира смертность, связанная с туберкулезом, по-прежнему составляет ~100-550 на 100 000^{населения1}. В то время как эксперты признают несколько причин, приводящих к таким искаженным цифрам, опосредованная БЦЖ защита, не сохраняющаяся даже в течение первого десятилетия жизни, по-видимому, является основной причиной 3,4,5,6,7. Таким образом, с учетом обновленных «Целей в области устойчивого развития» ООН и «Стратегии ВОЗ по ликвидации туберкулеза» предпринимаются согласованные глобальные усилия по разработке гораздо более совершенной альтернативы БЦЖ, которая, возможно, обеспечит пожизненную защиту от туберкулеза.

Для достижения этой цели несколько групп в настоящее время оценивают модифицированные/рекомбинантные штаммы БЦЖ, непатогенные и аттенуированные виды микобактерий, отличные от БЦЖ, и субъединичные кандидаты 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Как правило, субъединичные вакцины представляют собой липосомы, селективно нагруженные небольшим количеством очищенных (~1-6) полноразмерных или укороченных иммуногенных белков патогена. Тем не менее, из-за их ложного сворачивания в ненативные конформации и/или случайных нефункциональных взаимодействий между загруженными белками, субъединицы часто не имеют нативных и германных эпитопов и, следовательно, не могут в достаточной степени подготовить иммунную систему^14,19,20.

Следовательно, внеклеточные везикулы (ВВ) бактерий набрали обороты в качестве многообещающей альтернативы 21,22,23,24,25,26. Как правило, бактериальные ВВ (бВВ) содержат подмножество своих клеточных компонентов, включая некоторые части нуклеиновых кислот, липидов и сотни метаболитов и белков^27,28. В отличие от липосом, в которых несколько очищенных белков искусственно загружены, бэв содержат сотни естественно загруженных, нативно свернутых белков с большей склонностью к подготовке иммунной системы, особенно без усиления/помощи адъювантов и агонистов толл-подобных рецепторов (TLR)^27,28,29. Именно в рамках этого направления исследований мы и другие изучили полезность микобактериальных EV в качестве потенциальных субъединичных бустеров BCG³⁰. Несмотря на опасения по поводу того, что у бэв отсутствует однородная антигенная нагрузка, ВВ аттенуированной Neisseria meningitidis успешно защищают людей от менингококка серогруппы В^31,32.

По крайней мере, теоретически, лучшими ВВ, которые могут хорошо повысить БЦЖ, являются ВВ, обогащенные патогенными бактериями. Однако обогащение электромобилей, генерируемых патогенными микобактериями, является дорогостоящим, трудоемким и рискованным процессом. Кроме того, электромобили, генерируемые патогенами, могут быть более вирулентными, чем защитными. Учитывая потенциальные риски, здесь мы сообщаем о хорошо протестированном протоколе обогащения электромобилей, генерируемых аксенически выращенной МСМ, авирулентной микобактерией.

Однако, несмотря на то, что авирулентные микобактерии кодируют несколько ортологов патогенных белков, им не хватает нескольких вакцинных антигенов/эпитопов патогенных белков, необходимых для того, чтобы в достаточной степени подготовить иммунную систему^{к защите}. Поэтому мы также исследовали создание и обогащение рекомбинантных ВВ МСМ с помощью молекулярной инженерии, таким образом, чтобы значительная часть любого патогенного белка, представляющего интерес, экспрессируемого и транслируемого в МСМ, должна достигать своих ВВ. Мы предположили, что один или несколько из 10 наиболее распространенных белков МСМ ВВ при слиянии с интересующим белком будут способствовать такой транслокации.

В 2011 году, когда мы начали стандартизировать обогащение микобактериальных ВВ (мВВ) в нашей лаборатории, Прадос-Росалес и др. впервые сообщили о визуализации и обогащении МЭВ in vitro³⁰. Позже, в 2014 году, та же группа опубликовала модифицированную версию своего метода³⁴ 2011 года. В 2015 году Lee et al. также сообщили о независимом стандартизированном методе обогащения mEV из аксенических культур микобактерий³⁵. Объединив оба протокола 34,35 и включив некоторые из наших модификаций после тщательной стандартизации^, мы описываем здесь протокол, который помогает регулярно обогащать mEV из аксенических культур микобактерий³⁶.

Здесь мы особенно подробно остановимся на обогащении ВВ, специфичных для МСМ, которое является расширением опубликованного протокола³⁶ для обогащения ВВ микобактерий в целом. Мы также подробно описываем, как конструировать рекомбинантные mEV (R-mEV), которые содержат белок mCherry (в виде красного флуоресцентного репортера) и EsxA (Esat-6)^37,38,39, преобладающий иммуноген и потенциальный субъединица вакциногена Mycobacterium tuberculosis. Протокол обогащения R-mEV остается идентичным тому, который мы описали для обогащения нативных электромобилей от Msm.

протокол

1. Условия произрастания Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli и их производных

1. Медиа
   1. Миддлбрук 7H9 жидкий бульон
      1. Приготовьте 20% исходный раствор Tween-80, предварительно нагрев необходимый объем воды двойной дистилляции (ddw) в стеклянном стакане до ~45-50 ^oC в микроволновой печи, добавьте необходимый объем Tween-80 с помощью соответствующего мерного цилиндра и непрерывно перемешивайте на небольшой магнитной мешалке, чтобы привести 20% Tween-80 в однородный раствор. Отфильтруйте 20% Tween-80 через фильтр для утилизации 0,22 мкм и храните бледно-желтый исходный раствор при температуре 4 ^°C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Все следы Tween-80 в измерительном цилиндре должны быть перенесены в стакан для точной конечной концентрации. Подготовленную заготовку Tween-80 не автоклавировать. Процедите (используйте 0,22 мкМ), стерилизуйте и храните при температуре 4 ^оС.
      2. Следуйте инструкциям производителя по приготовлению бульона 7Н9. Суспендировать 4,7 г порошка 7H9 в 900 мл ddw. Добавьте 2 мл глицерина, перемешайте содержимое и автоклавируйте при температуре 121 ^°C, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте обогащение Middlebrook ADC (ADC) и Tween-80 перед автоклавированием.
      3. После того, как автоклавная среда остынет до комнатной температуры (RT, т.е. ~25 ^oC), в стандартный шкаф биобезопасности типа A2 асептически добавьте 10 запасов по 100 мл АЦП (окончательный 1 раз) и 2,5 мл (конечные 0,05%) 20% Tween-80. Отфильтруйте смесь через одноразовый фильтрующий блок 0,22 мкм и храните очень светлый желтовато-зеленый, прозрачный исходный раствор при температуре 4 ^°C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: pH среды должен быть от ~6,6 до 6,8 (если <6,4 или >7,0, выбросьте и приготовьте свежим). Хранить при температуре 4 ^оС (стабильно 3-4 недели). Настоятельно рекомендуется дважды отфильтровать фильтрующий материал 7H9 (после добавления АЦП и Tween-80) через два независимых одноразовых фильтрующих блока 0,22 мкм.
   2. Жидкий бульон Соутона (минимальная среда)
      1. Растворите L-аспарагин (0,4% масс.) и лимонную кислоту (0,2% масс.) в 950 мл ддв. Добавьте по 1 мл свежеприготовленных 1000 бульонов (в ддв) двухосновного фосфата калия (бесцветного; бульон 10 г/20 мл; конечный 1 x 0,5 г/л); гептагидрат сульфата магния (бесцветный; бульон 10 г/20 мл; конечный 1x 0,5 г/л); и цитрат аммония железа (очень светло-коричневый; запас 1,6 г/40 мл; конечный 1x 0,04 г/л) и хорошо перемешать на магнитной мешалке.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В лучшем случае акции 1,000x могут быть 2-недельной давности; если старше этого срока, приготовьте свежие бульоны; хранить их в RT в темноте (например, в шкафу/на полке). Если цитрат аммония темно-коричневый, выбросьте его и сделайте свежим. Лучше всего добавить три соли в порядке, указанном в шаге 1.1.2.1. Перемешивайте раствор каждый раз перед добавлением каждого солевого раствора.
      2. Измерьте и запишите рН с помощью рН-метра; Убедитесь, что он составляет от 3,1 до 3,2. Если рН больше 3,7, выбросьте бульоны и заготовьте свежие. Чтобы отрегулировать pH до 7,4, используйте столько капель гидроксида натрия 10 Н, сколько необходимо. Контролируйте конечный pH, непрерывно перемешивая раствор/среду на магнитной мешалке.
      3. Добавьте 4,76 мл глицерина, 0,25 мл 20% Tween-80 (конечные 0,005%, см. также примечание к шагу 2.2.1.3), и только после этого доведите объем до 1 л. Затем процедите-стерилизуйте дважды 1 л среды с помощью двух отдельных фильтров для утилизации 0,22 мкм. Хранить прозрачную бесцветную среду при температуре 4 ^°C (стабильную в течение 2 недель).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Только после того, как pH будет доведен до 7,4, добавьте глицерин. В противном случае носитель станет мутно-белым. Если он мутный, выбросьте его (не пытайтесь нагревать) и приготовьте свежий. Для всех приготовлений электромобилей используйте свежеприготовленный Sauton's.
   3. Миддлбрук 7Н11 агаровая основа
      1. Следуйте инструкциям производителя по приготовлению. Суспендировать 19 г порошка 7H11 в 900 мл ddw. Добавьте 5 мл глицерина, перемешайте на магнитной мешалке до получения однородной суспензии (бледно-зеленой; pH от 6,6 до 6,8; если >7,2, выбросьте и приготовьте свежие) и автоклавируйте при 121 ^oC, 15 фунтов на квадратный дюйм и в течение 20 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте АЦП и 0,05% Tween-80 перед автоклавированием.
      2. Когда среда остынет до ~50 ^°C, асептически в шкафу биобезопасности типа A2 добавьте 100 мл ADC (доведенный до RT) и 2,5 мл 20% (конечный 0,05%) Tween-80 (доведенный до RT). Сразу же дозировать асептически в чашки Петри.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины стабильны при температуре 4 ^°C в течение не менее 4-6 недель. Убедитесь, что пластины находятся на RT в течение ночи, прежде чем заворачивать пластины для хранения при температуре 4 ^°C. В противном случае влага будет задерживаться в пластинах во время инкубации при 37 ^оС.
   4. Миллер Лурия Бертани (LB) бульон и агаровая основа
      1. Следуйте инструкциям производителя по приготовлению. Для приготовления отвара LB 25 г порошка суспендировать в 1 000 мл ddw и осторожно перемешать в течение 5 минут в стеклянном стакане на магнитной мешалке. После равномерной суспензии необходимо распределить необходимые объемы во флаконы со средой (например, 300 мл во флакон со средой объемом 500 мл) и автоклавировать. Для приготовления агара LB суспендируют 40 г порошка в 1 000 мл ddw и автоклаве (12 г порошка в 300 мл ddw во флаконе со стеклянной средой объемом 500 мл).
2. Условия произрастания
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы работы с бактериальным культивированием должны выполняться в шкафу биобезопасности (тип A2). Все культуры должны быть обработаны стерильными пробирками, колбами и наконечниками для пипеток.
   1. День 1
      1. Добавьте по 1 мл глицеринового бульона Msm (из морозильной камеры -80 ^°C) в 2 x 10 мл (в стерильных конических центрифугированных пробирках по 50 мл) свежеклавированных, охлажденных и предварительно подогретых (~37 ^oC) бульона 7H9, трижды перемешайте, закройте крышками и инкубируйте пробирки в течение ночи при 37 ^°C и 200-220 об/мин (шейкер инкубатора).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вырастить Mycobacterium tuberculosis (Mtb), выполните аналогичные шаги, но инкубируйте пробирки объемом 50 мл в течение 4-6 дней при 37 ^°C и 120-150 об/мин (встряхиватель инкубатора) в настройках BSL3. Соблюдайте ВСЕ международные рекомендации и методы биобезопасности в отношении патогенов BSL3 и группы риска 3 при обращении и утилизации Mtb и его культур. Используйте шкаф биобезопасности типа B2 для работы с Mtb и его культурами.
   2. День 2
      1. Когда OD 600 (A_{600 нм}; клеточный денситометр) достигает ~1,0, центрифугируют культуры МСМ в течение 10 мин при 3₂₀₀ × г и RT (настольная центрифуга). Выбросьте надосадочную жидкость с помощью стерильных наконечников для пипеток объемом 1 мл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный выше шаг остается таким же для культур MTB, за исключением того, что количество дней составляет 4-7. Следите за тем, чтобы не прикасаться к бактериальным гранулам наконечником пипетки.
      2. Промывка: К каждой грануле Msm добавьте 1 мл предварительно подогретой среды Sauton (при RT) (шаг 1.1.2) и осторожно ресуспендируйте наконечниками дозатора объемом 1 мл, чтобы получить однородную суспензию. Используя стерильные наконечники для пипеток, доведите объемы до 10 мл (в каждом) с той же средой. Центрифугируют суспензии в течение 10 мин при 3 200 × г и RT и выбрасывают надосадочную жидкость. Повторите этот шаг еще раз.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный выше шаг остается прежним для культур Mtb.
      3. Ресуспендируйте дважды промытые клетки Msm в 20 мл (каждая) предварительно подогретых клеток Sauton (предварительно подогретых в планшете или шейкер-инкубаторе) и измерьте оптическую плотность клеток при 600 нм. Посев необходимого объема культур МСМ в стерильные колбы Эрленмейера объемом 1 л, содержащие ~330 мл стерильного Саутона, так, чтобы окончательный OD₆₀₀ составил ~0,05.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендация всегда должна начинаться в небольшом объеме. Если конечный объем добавляется непосредственно в гранулу в один этап, ячейки останутся в виде диффузных гранул (индикатор плохой ресуспендии). Единственный способ решить эту проблему — раскрутить культуры и повторить суспендию в соответствии с рекомендациями. Описанный выше шаг остается прежним для культур Mtb.
   3. День 2/3
      1. Инкубируйте культуру объемом 330 мл в шейкере инкубатора при 200 об/мин и 37 ^°C до тех пор, пока культура OD₆₀₀ не достигнет ~0,3. Затем промойте ячейки один раз (аналогично шагу 1.2.2.2, но с тем же объемом), а затем повторно суспендируйте гранулы в том же объеме. Распределите по 50 мл ресуспендированных культур в шесть стерильных колб Эрленмейера по 1 л, каждая из которых содержит 280 мл стерильного предварительно подогретого Соутона с 1/10 нормально^{используемого (}0,05%) Tween-80, т.е. 0,005% (см. также примечание к шагу 2.2.1.3., чтобы понять, почему 1/10). Окончательный наружный диаметр₆₀₀ должен быть около 0,05.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для культур Mtb вместо колб Эрленмейера используйте роликовые бутылки (емкостью 1/2/4 л). Отрегулируйте объем культуры на флакон таким образом, чтобы при хранении на роликовом аппарате культура не достигала горлышка бутылки. Фактический объем в роликовой бутылке будет зависеть от вместимости роликовой бутылки.
      2. Инкубируйте каждую из культур объемом 330 мл в шейкере инкубатора при 200 об/мин и 37 ^°C до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигнет 2,0-2,5 (~15-18 ч).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для культур Mtb убедитесь, что окончательный OD₆₀₀ составляет ~1.0-1.2 (занимает ~5-8 дней).

2. Обогащение мЭВ МСМ с помощью центрифугирования с градиентом плотности

1. День 4
   1. Центрифугируют ~2 л культур МСМ средней экспоненциальной стадии в 6 стерильных флаконах центрифуги по 400 мл при 4 ^°С в течение 20 мин при ~8 000 × г (напольная модель центрифуги). Соберите отработанную надосадочную жидкость в две предварительно охлажденные автоклавные колбы по Эрленмейеру объемом 1 л и храните аликвоту гранулы для любых аналитических процедур (таких как SDS-PAGE и вестерн-блоттинг - здесь не описано).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы должны выполняться при низкой температуре (~ 4 °C) для лучшего сохранения целостности электромобилей. Электромобили довольно стабильны при RT, но охлаждение является обязательным условием для долгосрочной стабильности (повторное замораживание и размораживание не рекомендуется). Во время аксенического роста культуры мЭВ диссоциируют с поверхности МСМ/МТБ и накапливаются в надосадочной жидкости/отработанной среде культуры.
   2. Отфильтруйте надосадочную жидкость культуры МСМ сначала через блок (блоки) фильтрации 0,45 мкм, а затем через блок (блоки) фильтрации для утилизации 0,22 мкм, чтобы удалить все следы бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прямая фильтрация через фильтры 0,22 мкм часто приводит к засорению фильтрующих блоков (так как бактериальные гранулы могут быть повреждены во время выполнения шага 2.1.1.). Для получения надосадочной жидкости для культуры МТБ необходимо провести три этапа фильтрации культур МТБ (т.е. первую ступень фильтрации с помощью одноразового фильтрующего блока 0,45 мкм; две последовательные ступени фильтрации с одноразовыми фильтрующими блоками 0,22 мкм) перед перемещением фильтратов культуры в настройки BSL-2.
2. День 4/5
   1. Используйте мембранные концентраторы 30 кДа для концентрирования фильтрата культуры МСМ (~2 л) до ~ 38 мл путем центрифугирования фильтрата культуры при 4 ^°C, 20 мин и 3 200 × г.
      1. Предварительно промойте концентраторы стерильным холодным ddw (~15 мл) (промыть при 4 ^°C, 5 мин и 3 200 × g).
      2. Промойте ~15 мл предварительно отфильтрованного холодного Sauton (те же условия, что и для воды (2.2.1.1.)), чтобы удалить все следы химикатов (используемых при производстве).
      3. Поскольку для концентрирования ~2 л культурального фильтрата технически требуется ~130 центриконов (при однократном использовании), при необходимости используйте центриконы повторно не менее 3-4 раз. Выполните следующие действия: концентрируйте от 15 мл до 0,5–1,0 мл (следуйте шагу 2.2.1), перелейте концентрат в чистую, автоклавированную и холодную ультрацентрифужную пробирку объемом 38 мл, а затем повторно перенесите оставшийся неконцентрированный фильтрат культуры в использованные центриконы для повторного концентрирования.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Использование концентраторов с давлением 24, 30 кДа для концентрирования 2 л фильтрата культуры займет до 6 часов. При концентрировании фильтрата культуры Tween-80 также концентрируется и может блокировать концентратор. Использование Tween-80 до 0,005% final (а не 0,05%) в носителях Sauton помогает предотвратить эту блокировку. Пониженная концентрация Tween-80 не влияет на равномерную суспензию МСМ в процессе роста и не вызывает слипания клеток МСМ. Однако, поскольку ячейки Mtb слипываются на 0,005% Tween-80, используйте 0,05% Tween-80 для EV, специфичных для Mtb.
   2. Концентрированный фильтрат культуры Msm (~38 мл) переносят в чистую, промытую (с ddw) и предварительно охлажденную полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 40-50 мл и подвергают ее двухступенчатому центрифугированию, сначала при 4 000 × г, а затем при 15 000 × г, обе стадии при 4 ^°C в течение 20 мин (для удаления всего мусора). Для этого используйте центрифугу напольного типа.
3. День 5/6
   1. Переносят надосадочную жидкость культуры в предварительно охлажденную полипропиленовую ультрацентрифужную пробирку объемом 38,5 мл и отжимают ее в ультрацентрифуге при 100 000 × г в течение 4 ч при 4 ^°С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поворотный ковш лучше всего работает на этой скорости. Убедитесь, что пробирка ультрацентрифуги заполнена до краев и имеет балансирную ультрацентрифужную пробирку эквивалентного веса. Если какая-либо из трубок прилипла к поворотному ведру после центрифугирования (что происходит из-за конденсации), с помощью щипцов осторожно извлеките ее из ротора. Вытирание конденсированной влаги, присутствующей на внешней поверхности ультрацентрифуги, перед ультрацентрифугированием предотвращает прилипание.
   2. Храните надосадочную жидкость в предварительно охлажденной пробирке объемом 50 мл (см. примечание). Переверните пробирку ультрацентрифуги на свежую безворсовую впитывающую бумагу, чтобы удалить следы надосадочной жидкости. Ресуспендировать гранулу в 600 мкл буферного раствора HEPES (50 мМ HEPES и 150 мМ NaCl, рН 7,4; перед использованием процедить-стерилизовать).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте надосадочную жидкость только в качестве резервной копии. Нативная гранула mEV выглядит как желеобразное пятно диаметром 5-7 мм от тусклого серовато-желтого до полупрозрачного цвета. Если гранулы не видны, повторите шаг 2.3.1, повторно используя сохраненный надосадочную жидкость. Если после повторения шага 2.3.1 гранулы не появились, выбросьте и начните заново с шага 1.2. Для ресуспендирования гранулы требуется время. Рекомендуется добавить буфер HEPES и оставить его на ночь при температуре 4 ^°C для облегчения ресуспендирования. Ресуспендируйте осторожно, но с повторным пипетированием (используйте наконечники P200 для лучшей ресуспендации) до равномерного ресуспендирования.
4. День 6
   1. Подвергнуть ресуспендированную гранулу центрифугированию с градиентом плотности на основе йодиксанола.
      1. Выложите ресуспендированную гранулу на дно чистой, промытой (с ddw) и предварительно охлажденной сверхпрозрачной полипропиленовой ультрацентрифужной пробиркой объемом 13 мл и осторожно смешайте (используйте пипетку объемом 1 мл) с ~4 мл раствора йодиксанола с градиентом инертной плотности (коммерчески доступен в виде ~60% раствора по массе). После укладки ресуспендированной гранулы на дно пробирки (максимум до 5 мл), затем наложите по 1 мл (w/v) на каждый из 40%, 30%, 20% и 10% субстоков йодиксанола в соответствующем порядке (подготовьте суб-запасы (с буфером HEPES) из 60% запаса). Затем добавьте 4 мл 6%-ного суббульона (приготовленного из 60% бульона с буфером HEPES) сверху, чтобы заполнить пробирку.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте градиент непосредственно перед использованием; Никогда не храните и не используйте.
      2. Осторожно (не встряхивая) взвесьте трубку в стеклянном стакане, и аккуратно перенесите ее в ротор качающегося ковша.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Взвешивание необходимо проводить с помощью фиктивной трубки (также взвешенной).
      3. Подвергают ультрацентрифугированию при 141 000 × г в течение 16 ч при 4 ^°С.
5. День 7
   1. Осторожно извлеките пробирку (см. примечание к шагу 2.3.1) и соберите фракции по 1 мл в свежеавтоклавные пробирки для микроцентрифуг; обратите внимание на 4-ю и^6-ю фракции, которые обычно содержат MSM mEV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: МЭВ из этих фракций обычно фракционируются на три или четыре полосы мЭВ (одна из них является основной полосой) тускло-белого цвета. R-mEV, содержащие mCherry, фракционируются на 5-7-ю фракции и имеют цвет от^{темно-фиолетового} до пурпурного. Электромобили Mtb обычно разделяются на 5-7-ю фракции. Разделение мЭВ в градиенте зависит от используемой концентрации градиента и от того, насколько хорошо градиент слоистый. Если mEV разрываются частично, они могут расщепляться на более ранние фракции. В качестве альтернативы, если гранула, полученная после этапа 2.3.2, не была хорошо ресуспендирована, везикулы образуют плотные микрогранулы, которые расщепляются в виде более поздних фракций. Мы рекомендуем точный сбор фракций только в том случае, если пользователь хочет оценить, какая из фракций в 1 мл содержит mEV. Пользователи могут захотеть аликвотировать на более мелкие или более крупные фракции в зависимости от их удобства. Когда мы используем их для определенных применений, например, при тестировании их в качестве потенциального субъединичного бустера вакцины для БЦЖ, мы ограничиваем сбор мЭВ до менее чем 250 мкл фракций (где мЭВ фракционируются), чтобы мы могли специально собирать только полосы мЭВ и обрабатывать, как указано в 2.7.5. Это помогает более эффективно удалить все следы йодиксанола, которые могут помешать нашим последующим экспериментам.
6. День 8
   1. Фракции, содержащие mEVs, объединяют, разбавляют буфером HEPES до 38 мл и повторяют ультрацентрифугирование при 4 ^oC в течение 16 ч при 100 000 × г. Ресуспендируйте гранулу (как на шаге 2.3.2 с теми же предостережениями) либо в буфере HEPES, либо в любом буфере, который требуется для последующих экспериментов (здесь не описано), таких как оценка белка, анализ нанотрекинга, негативное окрашивание, просвечивающая электронная микроскопия, вестерн-блоттинг и мечение иммунным золотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей ресуспензии проведите ультразвуковую обработку трубки, содержащей mEV, в течение 10 минут с помощью ультразвукового ультразвукового ультразвукового соника на водяной бане. Ультразвуковая обработка в течение длительного времени может инициировать разрыв и потерю неповрежденных mEV. Если хорошо подвешен, ультразвуковая обработка не нужна. Все шаги от 2.1 до 2.6 идентичны при обогащении электромобилей, сгенерированных Mtb.

3. Конструирование и обогащение рекомбинантных мЭВ.

ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из 10 наиболее распространенных белков (идентифицированных с помощью масс-спектрометрии) МСМ EV является Cfp-29³⁰. Учитывая его небольшой размер (29 кДа), простую вторичную структуру⁴⁰, локализацию на мембране 41 и склонность к секреции в отработанной среде в аксенических культурах (например, в виде белка-фильтрата культуры; секретируемого как Msm, так и Mtb^42,43), в данном случае он был использован для доставки красного флуоресцентного репортера и интересующего белка (EsxA_Mtb) в mEV. Для этого необходимо

1. Используйте соответствующие прямые и обратные праймеры (табл. 1; совместимы с прямым клонированием в челночный вектор, такой как pMV261) для амплификации cfp-29 из Msm. Используя ~50 нг высокомолекулярной (~>20 kb) геномной ДНК Msm в качестве матрицы, ПЦР-амплифицируют фрагмент гена cfp-29 с помощью высокоточной корректурной ДНК-полимеразы (например, Phusion или Q5). Следуйте рекомендациям производителя по проведению ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спроектируйте необходимые места ограничения в праймеры для легкого клонирования в любой интересующий вас альтернативный вектор челнока. Условия и объем ПЦР будут варьироваться в зависимости от типа и марки используемой ДНК-полимеразы для корректуры. Объем реакционной смеси будет варьироваться в зависимости от количества матрицы ДНК и количества корректирующей ДНК-полимеразы. Следуйте рекомендациям производителя по условиям ПЦР, успешности амплификации и исключения неспецифического отжига праймеров.
2. ПЦР очищают элюированный ампликон с помощью любого имеющегося в продаже набора для очистки ПЦР и проверяют длину ампликона с помощью стандартного электрофореза в агарозном геле. Переварить очищенный ампликон.
   1. Оцените количество очищенного ампликона на спектрофотометре. Используйте не менее 2 мкг ампликона cfp-29 для пищеварения.
   2. Сначала дигестируют с BstB1 при 65 ^°С в течение 1 ч (тип и количество буфера и фермента - в соответствии с рекомендациями производителя), снижают температуру реакции до RT, а затем переваривают с HindIII в течение 1 ч при 37 ^°С (тип и количество буфера и фермента - в соответствии с рекомендациями производителя).
   3. ПЦР очищают и элюируют переваренный ампликон в 50 мкл автоклавного безнуклеазного ddw.
   4. Оценивают концентрацию и выход переваренного ампликона с помощью спектрофотометра. Хранить при температуре -20 ^°С до начала лигирования. ПРИМЕЧАНИЕ: После ПЦР проверьте длину ампликона (~798 + 50.н.) и выход путем электрофореза 10 мкл смеси ПЦР-реакции на 1% агарозном геле. Хотя двойное расщепление невозможно при такой комбинации ферментов, совместимый буфер предотвратит повторную ПЦР-очистку и последующую потерю переваренного ампликона. Концентрация расщепленного ампликона варьируется в зависимости от набора, используемого для ПЦР-очистки. Она также изменяется в зависимости от длины (в.н.) любых альтернативных векторов по выбору.
3. Используйте прямой и обратный праймеры (табл. 1), корректурную ДНК-полимеразу и ~50 нг геномной ДНК Mtb, амплификацию ПЦР esxA- или esxA-3X FLAG-специфичного ампликона. Используйте ~5 нг соответствующей плазмидной ДНК для ПЦР-амплификации mCherry. Сведения о плазмидах и последовательностях находятся в Дополнительном файле 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте линкер Glycine, Glycine, Glycine, Glycine, Serine ^44,45(^G4S) между cfp-29 и mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; Перед запуском mCherry линкер G4S помогает mCherry не подвергаться ложным нефункциональным складкам (в том числе вызванным Cfp-29). Обратитесь к последовательностям cfp-29, hsp60 promoter, mCherry и esxA в Дополнительном файле 1. Плазмиды, служащие шаблонами для mCherry, доступны в различных репозиториях/банках плазмид. Доступны различные версии (слегка измененные последовательности) mCherry, которые потребуют измененных прямых и обратных последовательностей праймеров. Праймеры (Таблица 1) помогают усилить mCherry, упомянутый в Дополнительном файле 1. Слияние N-конца mCherry/esxA/esxA::3XFLAG с С-концевым концом Cfp-29 работает хорошо.
4. Расщепляют 1 мкг ДНК ампликонов mCherry/esxA/esxA::3XFLAG и очищают переваренную ДНК.
   1. Дважды переваривайте каждый ампликон с HindIII и HpaI в течение 1 ч при 37 ^°C (или в соответствии с рекомендациями производителя).
   2. Используйте имеющийся в продаже набор для очистки ПЦР и рекомендации производителя по очистке переваренного ампликона. Элюируют переваренный ампликон в 50 мкл автоклавного безнуклеазного ddw.
   3. Оценивают концентрацию и выход переваренного ампликона с помощью спектрофотометра. Хранить при температуре -20 ^°С до начала лигирования.
5. Расщепляют 2 мкг pMV261-Kan^R (Дополнительный файл 1) или подходящий вектор клонирования с выбранным ферментом (ферментами).
   1. Сначала дигестируют с BstB1 при 65 ^°С в течение 1 ч (тип и количество буфера и фермента - в соответствии с рекомендациями производителя), снижают температуру реакции до RT, а затем переваривают с HindIII в течение 1 ч при 37 ^°С (тип и количество буфера и фермента - в соответствии с рекомендациями производителя).
   2. Гель очищают и элюируют в 50 мкл автоклавной безнуклеазной ddw.
   3. Оцените концентрацию и выход переваренного вектора с помощью спектрофотометра. Хранить при температуре -20 ^°С до начала лигирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одноэтапное двухфрагментное клонирование возможно с помощью вышеуказанных праймеров для pMV261. Любой альтернативный вектор челнока, который выживет в виде эписомы, будет работать. Интегративные плазмиды также будут работать, но выход рекомбинантного белка будет относительно меньше на клеточную основу.
6. Лигируют и превращаются в совместимый штамм кишечной палочки.
   1. Для лигирования используют 125 нг вектора. Используйте надлежащим образом переваренные ампликоны mCherry/esxA/esxA::3XFLAG в молярном соотношении 1:3. Лигирование проводят в течение ночи с использованием Т4 ДНК-лигазы (количество согласно рекомендациям производителя) при 16 °C на охлажденной циркулирующей водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие элементы управления, такие как вектор, только с ДНК-лигазой Т4 и без нее, для оценки эффективности пищеварения и прогнозирования эффективности успешного клонирования.
   2. Преобразование
      1. Разморозить аликвоты химически компетентных клеток NEB5α (~100 мкл на превращение) на льду в течение 15 мин. Аккуратно дважды перемешайте стерильным наконечником пипетки. Добавьте лиговую смесь (до 20 мкл) к холодным компетентным клеткам.
      2. Аккуратно смешайте клетки пипетки + лигированную ДНК. Выдерживайте смесь на льду еще 30 минут.
      3. Обеспечьте тепловой шок при температуре 42 °C (на водяной бане) в течение 60 с и немедленно перенесите обратно на лед еще на 15 минут.
      4. Восстановите трансформированные клетки, добавив 1 мл бульона SOC (2% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ MgSO₄ и 20 мМ глюкозы) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч при 200 об/мин.
      5. Отжим восстановленные бактерии в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл (3000 × г, RT и 10 мин), выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл стерильной, предварительно подогретой, свежеприготовленной среды LB и распределите суспензию на свежевылитых пластинах с агаром LB Miller, содержащих необходимые антибиотики в соответствующих концентрациях.
      6. Инкубируйте чашки Петри в пластинчатом инкубаторе, предварительно настроенном на 37 ^оС.
7. Скрининг (здесь не описано) на наличие потенциальных клонов, верификация (с помощью ПЦР/ферментов рестрикции колонии)⁴⁶ и секвенирование (секвенирование по Сэнгеру) для подтверждения слияния.
8. Экстрагируют плазмидную ДНК (~200 нг/1-2 мкл; любой коммерчески доступный набор) подтвержденного клона (фон E. coli ) и трансформируют ее в свежеполученные электрокомпетентные клетки МСМ.
9. Подготовка электрокомпетентных ячеек МСМ
   1. Свежевыращенный Msm (как в шагах 1.2.1 и 1.2.2). Промойте свежевыращенный Msm, как в шагах 1.3.3 и 1.3.4 (за исключением того, что используйте 7H9 + ADC + Tween-80 (насыщенный) вместо Sauton's).
   2. Добавьте аликвоту промытых клеток Msm к конечному OD₆₀₀ ~0,05 в стерильную колбу Эрленмейера объемом 500 мл, содержащую 150 мл насыщенной среды.
   3. Инкубируют в шейкере инкубатора при 200 об/мин и 37 ^°С до тех пор, пока культура OD₆₀₀ не достигнет ~0,8-1,0 (~12-14 ч).
   4. Переложите культуру в предварительно охлажденную бутылку с центрифугой объемом 400 мл и инкубируйте на льду в течение 60-90 мин. Затем гранулируйте клетки при температуре 4 ^°С в течение 15 минут при концентрации 4 000 × г.
   5. Промойте клетки дважды (каждая промывка 150 мл, при 4000 × г, 4 ^°C и 15 мин) ледяным, стерильным (в автоклавированном) 10% глицерине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При каждой стирке гранулы становятся рыхлыми. Соблюдайте осторожность при сливе всей надосадочной жидкости (после каждой стирки). В противном случае большая часть клеток будет потеряна в выброшенном надосадочной жидкости.
   6. Еще раз промойте клетки 75 мл ледяного стерильного 10% глицерина, содержащего 0,005% Tween-80.
   7. Ресуспендант клеточной гранулы в 7,5 мл 10% глицерина с 0,005% Tween-80 и аликвоту в 400 мкл аликвот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что электрокомпетентные ячейки MSM пригодны для работы не менее 4 месяцев, свежеприготовленные электрокомпетентные элементы дают наилучшие результаты. При использовании старых компетентных клеток несколько нерозовых колоний (белых) выглядят как ложные трансформеры. Чем старше компетентные клетки, тем больше белых колоний.
10. Трансформация МСМ
    1. Размораживают МСМ компетентные клетки аликвотами на льду.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Размораживание на RT и трансформация таких ячеек дает меньшую эффективность.
    2. Добавляют 1-2 мкл плазмидной ДНК (~200 нг всего) к холодным компетентным клеткам, осторожно перемешивают стерильным наконечником пипетки объемом 1 мл и переносят в предварительно охлажденную стерильную 2-миллиметровую электропорационную кювету.
    3. Перенесите закрытую кювету со смесью Msm-компетентных клеток + плазмидной ДНК в мышь электропортора, осторожно закройте крышку и подайте импульс (тип экспоненциального затухания) на 2,5 кВ (напряжение), 25 мкФ (емкость) и 1000 Ω (сопротивление).
    4. Немедленно добавьте в кювету 1 мл предварительно подогретой стерильной насыщенной (7H9 + ADC + Tween-80) среды, аккуратно перемешайте стерильным наконечником пипетки объемом 1 мл и перелейте все содержимое в стерильную пробирку объемом 10 мл.
    5. Инкубируйте содержимое в течение 3 ч в инкубаторе-шейкере, установленном на 37 ^оС и 200 об/мин. Открутите содержимое в микроцентрифужной пробирке (4 000 × г, RT и 10 мин), выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл стерильной предварительно нагретой богатой среды и распределите суспензию по свежевылитым агаровым пластинам 7H11, содержащим ADC, Tween-80 и необходимые антибиотики в соответствующих концентрациях.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для МСМ, когда это необходимо, используйте Гигромицин, Канамицин и Апрамицин в конечных концентрациях 50 мкг/мл, 25 мкг/мл и 50 мкг/мл соответственно. МСМ сам по себе НЕ устойчив к этим антибиотикам. Применяют эти антибиотики только при использовании плазмид с соответствующими резистентными генами для селекции/роста трансформентов/рекомбинантных колоний МСМ.
    6. Инкубируйте чашки Петри в пластинчатом инкубаторе, настроенном на 37 ^°C. Обычно трансформанты появляются через 3-5 дней.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если интересующий нас белок токсичен для МСМ, трансформанты могут появиться позже или не появиться. В таких случаях клонируйте усеченные версии на всю длину.
    7. Сделайте запасы глицерина в возникающих колониях МСМ после проверки на наличие положительных клонов (то же, что и на шаге 3.7)
11. Чтобы обогатить R-mEV, содержащие белки mCherry или EsxA, сначала вырастите R-Msm, экспрессирующий либо mCherry, либо exsA, либо esxA::3X FLAG, выполнив шаги 1.2.1–1.2.3, а затем выполните шаги 2.1–2.6. для обогащения R-mEV. R-mEV элюируют в^4-7-ю фракции пост-градиентного спина плотности (шаг 2.5). Гранулы R-mEVs после первой стадии ультрацентрифугирования (2.3.1). Выполнив действия, идентичные шагу 2.3.1, убедитесь, что R-mEV видны в виде гранул диаметром 5–7 мм от темно-фиолетового до пурпурного цвета в нижней части центра ультрацентрифуги.
12. Проведите западный анализ⁴⁷ (здесь не описано) для обнаружения интересующего белка (белков) в обогащенных R-mEV.

Результаты

Мы используем M. smegmatis (Msm) в качестве модельной микобактерии, чтобы продемонстрировать обогащение как нативных, так и рекомбинантных mEV (R-mEV). Этот схематически обобщенный протокол обогащения mEVs (рис. 1) также работает для обогащения R-mEV Msm и собственных EV Mtb (с незначительными изменени?...

Обсуждение

Поскольку разработка новой противотуберкулезной вакцины, превосходящей БЦЖ и способной заменить ее, остается серьезной проблемой в качестве альтернативы, несколько групп работают над открытием различных субъединичных противотуберкулезных вакцин, которые могут повысить эффективно?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155