כימות סלקטיביות תכונות חזותיות של רפלקס האופטוקינטי בעכברים

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי לכימות הרפלקס האופטוקינטי. הוא משלב גירוי תוף וירטואלי ווידאו-אוקולוגרפיה, ובכך מאפשר הערכה מדויקת של סלקטיביות התכונה של ההתנהגות והפלסטיות האדפטיבית שלה.

Abstract

הרפלקס האופטוקינטי (OKR) הוא תנועת עיניים מולדת חיונית המופעלת על ידי התנועה הגלובלית של הסביבה החזותית ומשמשת לייצוב תמונות רשתית. בשל חשיבותו וחוסנו, ה-OKR שימש לחקר למידה חזותית-מוטורית ולהערכת תפקודי הראייה של עכברים בעלי רקע גנטי שונה, גילאים שונים וטיפולים תרופתיים. כאן, אנו מציגים הליך להערכת תגובות OKR של עכברים קבועים ראש עם דיוק גבוה. קיבוע ראש יכול לשלול את תרומת הגירוי הווסטיבולרי על תנועות העיניים, מה שמאפשר למדוד תנועות עיניים המופעלות רק על ידי תנועה חזותית. ה-OKR מופעל על ידי מערכת תופים וירטואלית, שבה סורג אנכי המוצג על שלושה צגי מחשב נסחף אופקית באופן תנודתי או חד-כיווני במהירות קבועה. באמצעות מערכת מציאות מדומה זו, אנו יכולים לשנות באופן שיטתי פרמטרים חזותיים כמו תדר מרחבי, תדר טמפורלי/תנודה, ניגודיות, בהיקות וכיוון הגרגים, ולכמת עקומות כוונון של סלקטיביות תכונות חזותיות. וידאו-אוקוקולוגרפיה אינפרא אדום במהירות גבוהה מבטיחה מדידה מדויקת של מסלול תנועות העיניים. עיניהם של עכברים בודדים מכוילים כדי לספק הזדמנויות להשוות את ה-OKR בין בעלי חיים בגילאים, מינים שונים ומרקעים גנטיים שונים. כוחה הכמותי של טכניקה זו מאפשר לה לזהות שינויים ב- OKR כאשר התנהגות זו מסתגלת באופן פלסטי עקב הזדקנות, חוויה חושית או למידה מוטורית; לפיכך, היא הופכת טכניקה זו לתוספת רבת ערך לרפרטואר הכלים המשמשים לחקר הפלסטיות של התנהגויות עיניות.

Introduction

בתגובה לגירויים חזותיים בסביבה, העיניים שלנו נעות כדי להסיט את מבטנו, לייצב תמונות רשתית, לעקוב אחר מטרות נעות, או ליישר את הגומות של שתי עיניים עם מטרות הממוקמות במרחקים שונים מהצופה, שהן חיוניות לראייה תקינה ^1,2. התנהגויות אוקולומוטוריות שימשו באופן נרחב כמודלים אטרקטיביים של אינטגרציה סנסומוטורית להבנת המעגלים העצביים בבריאות ובחולי, לפחות חלקית בגלל הפשטות של המערכת האוקולומוטורית³. נשלטת על ידי שלושה זוגות של שרירים חוץ-עיניים, העין מסתובבת בשקע בעיקר סביב שלושה צירים תואמים: הגבהה ודיכאון לאורך הציר הרוחבי, חטיפה וחטיפה לאורך הציר האנכי, וחדירה ושחול לאורך הציר הקדמי ^1,2. מערכת פשוטה כזו מאפשרת לחוקרים להעריך את ההתנהגויות האוקולומוטוריות של עכברים בקלות ובדייקנות בסביבת מעבדה.

התנהגות אוקולומוטורית עיקרית אחת היא רפלקס אופטוקינטי (OKR). תנועת עיניים לא רצונית זו מופעלת על ידי סחף איטי או החלקות של תמונות על הרשתית ומשמשת לייצוב תמונות הרשתית כאשר ראשו של בעל חיים או סביבתו נעים ^2,4. ה-OKR, כפרדיגמה התנהגותית, מעניינת את החוקרים מכמה סיבות. ראשית, ניתן לגרות אותו באופן אמין ולכמת אותו במדויק ^5,6. שנית, ההליכים לכימות התנהגות זו הם פשוטים יחסית וסטנדרטיים וניתן ליישם אותם כדי להעריך את הפונקציות החזותיות של קבוצה גדולה של בעלי חיים⁷. שלישית, התנהגות מולדת זו היא פלסטית מאוד ^5,8,9. המשרעת שלו יכולה להיות מוגברת כאשר החלקות רשתית חוזרות ונשנות מתרחשות במשך זמן רב ^5,8,9, או כאשר שותפו לעבודה רפלקס עיני שיווי משקל (VOR), מנגנון נוסף של ייצוב תמונות רשתית המופעלות על ידי קלט שיווי משקל^2, נפגע⁵. פרדיגמות ניסיוניות אלה של הגברה OKR מאפשרות לחוקרים לחשוף את הבסיס המעגלי העומד בבסיס הלמידה האוקולומוטורית.

שתי שיטות לא פולשניות שימשו בעיקר להערכת OKR במחקרים קודמים: (1) וידאו-אוקוקולוגרפיה בשילוב עם תוף פיזי 7,10,11,12,13 או (2) קביעה שרירותית של סיבובי ראש בשילוב עם תוף וירטואלי^6,14,15,16. למרות שהיישומים שלהם הניבו תגליות פוריות בהבנת המנגנונים המולקולריים והמעגליים של פלסטיות אוקולומוטורית, לכל שתי שיטות אלה יש כמה חסרונות המגבילים את כוחן בבחינה כמותית של תכונות ה-OKR. ראשית, תופים פיזיים, עם תבניות מודפסות של פסים או נקודות בשחור לבן, אינם מאפשרים שינויים קלים ומהירים של תבניות חזותיות, מה שמגביל במידה רבה את מדידת התלות של ה- OKR בתכונות חזותיות מסוימות, כגון תדירות מרחבית, כיוון וניגודיות של גרגרים נעים ^8,17. במקום זאת, בדיקות של הסלקטיביות של OKR לתכונות חזותיות אלה יכולות להפיק תועלת מגירוי חזותי ממוחשב, שבו ניתן לשנות בנוחות תכונות חזותיות מניסוי לניסוי. בדרך זו, חוקרים יכולים לבחון באופן שיטתי את התנהגות OKR במרחב הפרמטרים החזותיים הרב-ממדיים. יתר על כן, השיטה השנייה של בדיקת OKR מדווחת רק על ערכי הסף של פרמטרים חזותיים המפעילים OKR שניתן להבחין בהם, אך לא על המשרעת של תנועות עיניים או ראש 6,14,15,16. היעדר כוח כמותי מונע אפוא ניתוח צורת עקומות הכוונון ותכונות הראייה המועדפות, או איתור הבדלים עדינים בין עכברים בודדים בתנאים נורמליים ופתולוגיים. כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל, וידאו-אוקולוגרפיה וגירוי חזותי וירטואלי ממוחשב שולבו כדי להעריך את התנהגות OKR במחקרים אחרונים ^{5,17,18,19,20}. עם זאת, מחקרים אלה שפורסמו בעבר לא סיפקו מספיק פרטים טכניים או הוראות שלב אחר שלב, וכתוצאה מכך זה עדיין מאתגר עבור חוקרים להקים מבחן OKR כזה עבור המחקר שלהם.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות מדויק של סלקטיביות התכונות החזותיות של התנהגות OKR בתנאים פוטופיקליים או סקוטופיים עם שילוב של וידאו-אוקוקולוגרפיה וגירוי חזותי וירטואלי ממוחשב. עכברים מקובעים בראשם כדי למנוע את תנועת העיניים המתעוררת על ידי גירוי שיווי משקל. מצלמה במהירות גבוהה משמשת לתיעוד תנועות העין מעכברים הצופים בגרגרים נעים עם פרמטרים חזותיים משתנים. הגודל הפיזי של גלגלי העיניים של עכברים בודדים מכויל כדי להבטיח את הדיוק של גזירת זווית תנועות העיניים²¹. שיטה כמותית זו מאפשרת להשוות התנהגות OKR בין בעלי חיים בגילאים שונים או מרקעים גנטיים שונים, או לעקוב אחר השינוי שלה הנגרם על ידי טיפולים תרופתיים או למידה חזותית-מוטורית.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים של מדעי הביולוגיה, בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת טורונטו והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

1. השתלת מוט ראש על גבי הגולגולת

הערה: כדי למנוע את התרומה של התנהגות VOR לתנועות העיניים, ראש העכבר משותק במהלך מבחן OKR. לכן, מוט ראש מושתל בניתוח על גבי הגולגולת.

1. מרדימים עכבר (נקבה בת 2-5 חודשים וזכר C57BL/6) על ידי תערובת של 4% איזופלורן (v/v) ו-O₂ בתא גזים. מעבירים את העכבר לפלטפורמת ניתוח מותאמת אישית ומפחיתים את ריכוז האיזופלורן ל-1.5%-2%. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי בדיקת תגובת צביטת הבוהן וקצב הנשימה לאורך כל הניתוח.
2. הניחו כרית חימום מתחת לגוף החיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה. יש למרוח שכבה של משחת עיניים סיכה על שתי העיניים כדי להגן עליהן מפני ייבוש. כסו את העיניים ברדיד אלומיניום כדי להגן עליהן מפני תאורת אור.
3. תת עורית להזריק carprofen במינון של 20 מ"ג / ק"ג כדי להפחית את הכאב. לאחר הרטבת הפרווה עם chlorhexidine gluconate העור ניקונה, לגלח את הפרווה על גבי הגולגולת. יש לחטא את הקרקפת החשופה עם 70% אלכוהול איזופרופיל וכלורהקסידין פעמיים.
4. יש להזריק bupivacaine (8 מ"ג/ק"ג) תת עורית במקום החתך, ולאחר מכן להסיר את הקרקפת (~ 1 ס"מ²) עם מספריים כדי לחשוף את פני השטח הגביים של הגולגולת, כולל העצם המצחית האחורית, העצם הקודקודית והעצם הבין-קודקודית.
5. יש למרוח מספר טיפות של 1% לידוקאין ו-1:100,000 אפינפרין על הגולגולת החשופה כדי להפחית כאב ודימום מקומיים. גרדו את הגולגולת עם קורט Meyhoefer כדי להסיר את הפאשיה ונקו אותה במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   הערה: שריר הטמפורליס מופרד מהגולגולת כדי להגדיל את שטח הפנים לחיבור מוט ראש.
6. יבש את הגולגולת על ידי נשיפה עדינה של אוויר דחוס לכיוון פני הגולגולת עד שהלחות נעלמת והעצם הופכת לבנבנה. יש למרוח שכבה דקה של דבק-על על פני השטח החשופים של הגולגולת, כולל קצה הקרקפת החתוכה, ולאחר מכן שכבה של שרף אקרילי.
   הערה: פני השטח של הגולגולת צריכים להיות נקיים מדם או מים לפני מריחת דבק-על.
7. הניחו מוט ראש מפלדת אל-חלד (ראו איור 1A) לאורך קו האמצע מעל הגולגולת. יש למרוח יותר שרף אקרילי, החל מקצה מוט הראש עד שבסיס מוט הראש מוטמע לחלוטין בשרף האקרילי. מרחו שרף אקרילי פעמיים או שלוש כדי לבנות את העובי.
8. ממתינים כרבע שעה עד שהשרף האקרילי מתקשה. תת עורית להזריק 1 מ"ל של פתרון רינגר הנקה. לאחר מכן, החזירו את העכבר לכלוב המונח על כרית חימום עד שהחיה ניידת לחלוטין.
9. לאפשר לעכבר להתאושש בכלוב הביתי לפחות 5 ימים לאחר הניתוח. ברגע שבעל החיים במצב טוב, קבע את ראשו עם מוט הראש במערך OKR למשך 15-30 דקות כדי להכיר את קיבוע הראש ואת סביבת הניסוי. חזור על ההיכרות פעם ביום במשך 3 ימים לפחות.

2. הגדרת התוף הווירטואלי ווידאו-אוקולוגרפיה

1. הרכיבו שלושה צגים באופן אורתוגונלי זה לזה כדי ליצור מארז מרובע שמכסה ~270° של האזימוט ו-63° של הגובה במרחב הראייה (איור 1B משמאל).
2. באמצעות כרטיס גרפי נפרד, מזג את שלושת הצגים לצג פשוט כדי להבטיח סנכרון בין כל הצגים.
3. כייל את הבהיקות של צגים כמתואר להלן.
   1. הפעל את המחשב שאליו מחוברים הצגים והמתן 15 דקות. החימום חיוני כדי לקבל בהיקות יציבה.
   2. שנה באופן שיטתי את הגדרת הבהירות בצג מ- 0 ל- 100 בשלבים של 25.
   3. עבור כל ערך בהירות, מדוד את בהיקות הצגים תחת ערכי פיקסלים שונים (0-255, שלבים של 15) באמצעות מד בהיקות.
   4. התאם את הקשר בין בהיקות ובהירות עבור ערך פיקסל 255 עם רגרסיה ליניארית והערך את ערך הבהירות המוליד 160 cd/m².
   5. עבור כל ערך פיקסל המשמש במדידת הזוהר (שלב 2.3.3), הערך את הזוהר עבור ערך הבהירות הנגזר בשלב 2.3.4 בהתבסס על רגרסיה ליניארית. השתמש ^{בפונקציית}ההספק lum = A * pixel γ כדי להתאים את הקשר בין קבוצת ערכי הזוהר החדשה (תחת ערך הבהירות הנגזר ב- 2.3.4) לבין ערכי הפיקסלים המתאימים להם כדי לגזור את גורם הגמא γ ואת מקדם A. אלה ישמשו ליצירת גרגרים סינוסואידים של ערכי הארה רצויים.
   6. הגדר את הבהירות של כל שלושת הצגים לערכים הנגזרים בשלב 2.3.4 כדי להבטיח שערכי הזוהר שלהם יהיו זהים עבור אותו ערך פיקסל.
4. צור תוף וירטואלי, המשמש לגירוי התנהגות OKR, עם ערכת הכלים לגירוי חזותי, כמתואר להלן.
   1. הציגו סורג סינוסואידלי אנכי על הצגים והתאימו את התקופה (מרווח בין פסים) לאורך האזימוט כדי להבטיח שההקרנה של הסורג על העין תהיה בעלת תדירות מרחבית קבועה (סורג תוף; איור 1B באמצע ומימין).
   2. ודא שראשו של בעל החיים קבוע במרכז המתחם כך שהוא רואה שלסורג יש תדר מרחבי קבוע על פני השטח של התוף הווירטואלי.
   3. שנה את הפרמטרים של הסורג הנע, כגון משרעת תנודה, תדירות מרחבית, תדירות טמפורלית/תנודה, כיוון, ניגודיות וכו ', בקודים לגירוי חזותי. השתמש בשני סוגים של תנועה חזותית: (1) הסורג נסחף בכיוון השעון או נגד כיוון השעון באופן תנודתי בעקבות פונקציה סינוסואידית:
      
      כאן, אמפר הוא המשרעת של מסלול התוף, f הוא תדירות התנודה, ו-t הוא הזמן (משרעת תנודה: 5°; תדר מרחב סורג: 0.04-0.45 cpd; תדירות תנודה: 0.1-0.8 הרץ, המתאימה למהירות שיא של הגירוי של 3.14-25.12 °/s [מהירות תוף = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); ניגודיות: 80%-100%; בהיקות ממוצעת: 35-45 cd/m²; (2) הסורג נסחף באופן חד-כיווני במהירות קבועה:
      
      (תדר מרחבי: 0.04-0.64 cpd; תדר זמני: 0.25-1 הרץ; מהירות תוף = תדר זמני/תדר מרחבי).
5. הגדר את וידאו-oculography כמתואר להלן.
   1. כדי למנוע חסימה של שדה הראייה של החיה, מקמו מראה אינפרא אדום (IR) 60° מקו האמצע כדי ליצור תמונה של עין ימין.
   2. מקם מצלמת אינפרא-אדום בצד ימין מאחורי העכבר (איור 1C משמאל) כדי לצלם תמונה של עין ימין.
   3. הרכיבו את מצלמת האינפרא-אדום במהירות גבוהה על זרוע מצלמה המאפשרת למצלמה להסתובב ב-10° ± סביב התמונה של עין ימין (איור 1C מימין).
   4. השתמש בפוטודיודה המחוברת לאחד הצגים כדי לספק אות חשמלי לסנכרון התזמון של וידאו-אוקוקולוגרפיה וגירוי חזותי.
   5. מקם ארבע דיודות פולטות אור IR (LED) הנתמכות על ידי זרועות צוואר ברווז סביב עין ימין כדי לספק הארת IR של העין.
   6. מקם שתי נוריות IR על המצלמה כדי לספק הפניות להחזר הקרנית (CR): אחת קבועה מעל המצלמה (X-CR), ואילו השנייה נמצאת בצד שמאל של המצלמה (Y-CR; איור 1D).
   7. מדוד את ההגדלה האופטית של מערכת וידאו-אוקוקולוגרפיה באמצעות שקופית כיול.
      הערה: CRs הייחוס משמשים לביטול תנועות העיניים התרגומי כאשר זווית העין מחושבת בהתבסס על תנועות העיניים הסיבוביות.
6. קבע את ראשו של בעל החיים במרכז המתחם שנוצר על ידי הצגים, כמתואר להלן.
   1. קבע את ראשו של בעל החיים עם לוחית הראש למרכז האסדה והפוך אותו עם הפנים קדימה. התאימו את הטיית הראש כך שהעיניים השמאלית והימנית יהיו מפולסות, וזוויות האף והרקתי של העיניים מיושרות אופקית (איור 1E).
   2. הזיזו את ראש החיה אופקית על ידי כוונון גס המסופק על ידי מנגנון קיבוע הראש וכוונון עדין המסופק על ידי שלב תרגום דו-ממדי, ואנכית דרך מנגנון קיבוע הראש וזוג מחזיק פוסט/עמוד, עד שעינו הימנית של החיה תופיע בסרטון החי של המצלמה. לפני הכיול והמדידה של תנועות העיניים, שכבו את תמונת עין ימין של בעל החיים המשתקף על ידי המראה החמה עם נקודת הציר של זרוע המצלמה (ראו פרטים בשלב 3.4 להלן).
7. בנו מארז מותאם אישית סביב מתקן OKR כדי לחסום את תאורת החדר (איור 1F).

3. כיול תנועות העיניים

הערה: תנועות עיניים סיבוביות מחושבות על בסיס תנועות האישון ורדיוס מסלול תנועות האישונים (R_p, המרחק ממרכז האישון למרכז גלגל העין). עבור כל עכבר בודד, רדיוס זה נמדד באופן ניסיוני²¹.

1. קבע את ראשו של בעל החיים במרכז המתחם שנוצר על ידי שלושת הצגים, כמתואר בשלב 2.6.1.
2. הפעל את המצלמה וכוונן את ארבע נוריות ה- LED המקיפות את עין ימין כדי להשיג תאורת IR אחידה.
3. תחת הנחיה חזותית, התאם את מיקום עין ימין עד שתופיע במרכז הסרטון, כמתואר בשלב 2.6.2.
4. ישר את התמונה הווירטואלית של עין ימין עם נקודת הציר של זרוע המצלמה, כמתואר להלן.
   1. סובב ידנית את זרוע המצלמה לקצה השמאלי הקיצוני ( -10°). הזיזו ידנית את מיקום העין הימנית של החיה במישור האופקי בניצב לציר האופטי עם התאמה עדינה של שלב התרגום הדו-ממדי (איור 1C, חץ ירוק), עד שה-X-CR יגיע למרכז האופקי של התמונה.
   2. סובב ידנית את זרוע המצלמה לקצה השני (+10°). אם ה-X-CR בורח ממרכז התמונה, הזיזו את עין ימין לאורך הציר האופטי בכוונון עדין עד שה-X-CR יגיע למרכז (איור 1C, חץ כחול).
   3. חזור על שלבים 3.4.1-3.4.2 מספר פעמים עד שה-X-CR נשאר במרכז כאשר זרוע המצלמה מתנדנדת שמאלה וימינה. אם עין ימין זזה באמצע חזרה אחת, הפעל מחדש את תהליך ההסתגלות.
5. מדוד את המרחק האנכי בין Y-CR ל-X-CR לאחר נעילת זרוע המצלמה במיקום המרכזי. הפעל את נורית ה- Y-CR LED והקלט את מיקומה בסרטון ולאחר מכן עבור ל- X-CR LED והקלט את מיקומה.
   הערה: המרחק האנכי בין ה-Y-CR ל-X-CR ישמש כדי לגזור את המיקום של ה-Y-CR במהלך מדידת תנועות עיניים שבהן רק נורית ה-X-CR LED מופעלת.
6. מדוד את רדיוס סיבוב האישון R_p, כמתואר להלן.
   1. סובב את זרוע המצלמה לקצה השמאלי ( -10°) והקלט את מיקומי האישון (P_p1) ו- X-CR (P_CR1) בסרטון.
   2. לאחר מכן, סובב את זרוע המצלמה לקצה הימני (+10°) והקלט את מיקומי האישון (P_p2) ו- X-CR (P_CR2) בסרטון. חזור על שלב זה מספר פעמים.
      הערה: עינו הימנית של בעל החיים צריכה להישאר נייחת במהלך כל חזרה, כך שכמות תנועות האישונים בסרט משקפת במדויק את מידת הנפת זרוע המצלמה.
   3. בהתבסס על הערכים שנרשמו לעיל, חשב את רדיוס סיבוב האישון R_p (איור 2A) באמצעות הנוסחה הבאה:
      
      הערה: המרחק בין השתקפות הקרנית למרכז האישון במרחב הפיזי מחושב על סמך המרחק שלהם בסרט:
      P_CR - P_p = מספר הפיקסלים בסרט x גודל פיקסלים של שבב מצלמה x הגדלה
7. לפתח את הקשר בין R_p וקוטר האישון, כמתואר להלן. R_p משתנה כאשר התלמיד מתרחב או מתכווץ; באופן קרוב, ערכו עומד ביחס הפוך לגודל האישון (איור 2B למעלה).
   1. שנה את הבהיקות של הצגים באופן שיטתי מ- 0 ל- 160 cd/m² כדי לווסת את גודל האישון.
   2. עבור כל ערך זוהר, חזור על שלב 3.6 8-10 פעמים ורשום את קוטר האישון.
   3. החילו רגרסיה ליניארית על הקשר בין R_p לקוטר האישון בהתבסס על הערכים שנמדדו לעיל כדי לגזור את השיפוע והיירוט (איור 2B למטה).
      הערה: החריגים הנגרמים על ידי תנועות עיניים מזדמנות מוסרים לפני ההתאמה הליניארית. עבור מדידות חוזרות במספר הפעלות, הכיול צריך להיעשות רק פעם אחת עבור חיה אחת, אלא אם כן העין שלה גדלה במהלך הניסוי.

4. הקלט תנועות עיניים של OKR

1. תקן ראש עכבר במחשב לפי שלבים 3.1-3.4. דלג על שלב זה אם ההקלטה מתרחשת מיד לאחר סיום הכיול. נעל את זרוע המצלמה במיקום המרכזי.
2. הגדר את הצגים ואת בעל החיים עבור OKR סקוטופי כמתואר להלן. דלג על שלב זה עבור OKR תמונה.
   1. כסה את המסך של כל צג במסנן מותאם אישית, המורכב מחמש שכבות של סרט בעל צפיפות נייטרלית (ND) של 1.2. ודא שאף נורית לא דולפת החוצה דרך הרווח בין המסנן לצג.
   2. כבו את האור בחדר. השלבים הבאים נעשים בעזרת משקפת IR.
   3. יש למרוח טיפה אחת של תמיסת פילוקרפין (2% במי מלח) על עין ימין ולהמתין 15 דקות. ודא שהטיפה נשארת על העין ולא נמחקת על ידי העכבר. אם התמיסה נמחקת על ידי החיה, להחיל טיפה נוספת של פתרון pilocarpine. זה מכווץ את האישון לגודל מתאים למעקב עיניים במצב סקוטופי.
      הערה: במצב סקוטופי, האישון מתרחב באופן משמעותי כך שהקצה שלו מוסתר חלקית מאחורי העפעף. זה משפיע על הדיוק של הערכת מרכז התלמיד על ידי וידאו-oculography. כיווץ פרמקולוגי של אישון עין ימין מפחית את הקלט החזותי שלו, וכך הגירויים החזותיים מוצגים לעין שמאל.
   4. לשטוף את עין ימין עם מלוחים כדי לשטוף ביסודיות את הפתרון pilocarpine. משכו את הווילון כלפי מטה כדי לאטום לחלוטין את המארז, מה שמונע מאור תועה להפריע לראייה הסקוטופית.
   5. תן לבעל החיים 5 דקות להסתגל באופן מלא לסביבה הסקוטופית לפני תחילת בדיקת OKR.
3. הפעל את תוכנת הגירוי החזותי ואת תוכנת מעקב העיניים. למדידת OKR פוטופיקית, ודא שסורג התוף מתנודד אופקית עם מסלול סינוסואידלי; למדידת OKR סקוטופית, יש לוודא שסורג התוף נסחף במהירות קבועה משמאל לימין, שהוא כיוון הרקה-אף בהתייחס לעין שמאל.
   הערה: כאשר האישון של עין ימין, אך לא של עין שמאל, מכווץ על ידי פילוקרפין במצב סקוטופי, ה- OKR המתעורר על ידי גירוי תוף תנודתי הוא מאוד לא סימטרי. לכן, עבור מדידת OKR סקוטופית, עין שמאל מגורה בעוד התנועה של עין ימין מנוטרת.
4. תוכנת המעקב אחר העיניים מודדת באופן אוטומטי את גודל האישון, מיקום CR ומיקום האישון עבור כל פריים, ומחשבת את זווית מיקום העין בהתבסס על הנוסחה הבאה (איור 2C):
   
   כאן, P_CR הוא מיקום CR, P p הוא מיקום האישון, ו- R_p הוא רדיוס סיבוב האישון. המרחק בין השתקפות הקרנית למרכז האישון במרחב הפיזי מחושב על פי המרחק שלהם בסרט:
   P_CR - P_p = מספר הפיקסלים בסרט x גודל פיקסלים של שבב מצלמה x הגדלה
   R_p של גודל האישון המתאים נגזר בהתבסס על מודל הרגרסיה הליניארית בשלב 3.7.3 (איור 2B למטה).

5. ניתוח תנועות עיניים של OKR עם תוכנת ניתוח העיניים

1. עבד את עקבות העיניים באמצעות מסנן חציוני (חלון מסנן = 0.05 שניות) כדי להסיר רעש בתדר גבוה (איור 3A באמצע).
2. הסר את סקאדות או ניסטגמוס כמתואר להלן.
   1. הערך את מהירות העין על-ידי חישוב הנגזרת מסדר ראשון של תנועות עיניים (איור 3A למטה). זהו את הסקאדות או הניסטגמוס על-ידי החלת סף מהירות של 50°/s (איור 3A למטה).
   2. החליפו את הסקדות או הניסטגמוס על-ידי אקסטרפולציה של מיקומי העיניים במהלך תנועות העיניים המהירות האלה מהמקטע שלפני הסקדות או הניסטגמוס בהתבסס על רגרסיה ליניארית (איור 3B).
3. חשבו את המשרעת של תנועות עיניים OKR באמצעות התמרת פורייה מהירה (אלגוריתם גרצל) אם סורג התוף מתנודד (איור 3C), או חשבו את המהירות הממוצעת של תנועות העיניים במהלך הגירוי החזותי אם סורג התוף נע במהירות קבועה בכיוון אחד (איור 3B למטה).
   הערה: המשרעת של תנועות עיניים מתנודדות הנגזרות מהתמרת פורייה דומה למשרעת הנגזרת מהתאמת מסלול העין לפונקציה סינוסואידלית (איור 3D).
4. חשב את רווח OKR. עבור תנועת תוף תנודתי, רווח OKR מוגדר כיחס בין המשרעת של תנועות העיניים למשרעת של תנועות התוף (איור 3C מימין). עבור תנועת תוף חד-כיוונית, רווח OKR מוגדר כיחס בין מהירות העין למהירות גרידת התוף (איור 3B למטה).

תוצאות

עם ההליך המפורט לעיל, הערכנו את התלות של OKR במספר תכונות חזותיות. העקבות לדוגמה המוצגות כאן נגזרו באמצעות קודי הניתוח שסופקו בקובץ קידוד משלים 1, ואת קובץ העקבות הגולמי לדוגמה ניתן למצוא בקובץ קידוד משלים 2. כאשר סורג התוף נסחף במסלול סינוסואידלי (0.4 הרץ), עינו של בעל החיים ?...

Discussion

השיטה של הבדיקה ההתנהגותית OKR המוצגת כאן מספקת מספר יתרונות. ראשית, גירוי חזותי שנוצר על ידי מחשב פותר את הבעיות המהותיות של תופים פיזיים. בהתמודדות עם הבעיה שתופים פיזיים אינם תומכים בבחינה שיטתית של תדר, כיוון או כוונון ניגודיות מרחבית⁸, התוף הווירטואלי מאפשר לשנות פרמטרים ח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2D translational stage	Thorlabs	XYT1
Acrylic resin	Lang Dental	B1356	For fixing headplate on skull and protecting skull
Bupivacaine	STERIMAX	ST-BX223	Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia
Carprofen	RIMADYL	8507-14-1	Analgesia
Compressed air	Dust-Off
Eye ointment	Alcon	Systane	For maintaining moisture of eyes
Graphic card	NVIDIA	Geforce GTX 1650 or Quadro P620.	For generating single screen among three monitors
Heating pad	Kent Scientific	HTP-1500	For maintaining body temperature
High-speed infrared (IR) camera	Teledyne Dalsa	G3-GM12-M0640	For recording eye rotation
IR LED	Digikey	PDI-E803-ND	For CR reference and the illumination of the eye
IR mirror	Edmund optics	64-471	For reflecting image of eye
Isoflurane	FRESENIUS KABI	CP0406V2
Labview	National instruments	version 2014	eye tracking
Lactated ringer	BAXTER	JB2324	Water and energy supply
Lidocaine and epinephrine mix	Dentsply Sirona	82215-1	XYLOCAINE. Local anesthesia
Luminance Meter	Konica Minolta	LS-150	for calibration of monitors
Matlab	MathWorks	version xxx	analysis of eye movements
Meyhoefer Curette	World Precision Instruments	501773	For scraping skull and removing fascia
Microscope calibration slide	Amscope	MR095	to measure the magnification of video-oculography
Monitors	Acer	B247W	Visual stimulation
Neutral density filter	Lee filters	299	to generate scotopic visual stimulation
Nigh vision goggle	Alpha optics	AO-3277	for scotopic OKR
Photodiode	Digikey	TSL254-R-LF-ND	to synchronize visual stimulation and video-oculography
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Post	Thorlabs	TR1.5
Post holder	Thorlabs	PH1
PsychoPy	open source software	version xxx	visual stimulation toolkit
Scissor	RWD	S12003-09	For skin removal
Superglue	Krazy Glue		Type: All purpose. For adhering headplate on the skull