שיטת גידול יד למרמוסטים לתינוקות

Summary

כאן אנו מתארים שיטת גידול ידנית לגידול מרמוסטים לתינוקות באינקובטור לבעלי חיים. שיטה זו מגדילה מאוד את שיעור ההישרדות של תינוקות מרמוסט, מה שמספק הזדמנות לחקור את התפתחותם של תינוקות מרמוסט עם רקע גנטי דומה שגדל בסביבות שונות לאחר הלידה.

Abstract

מרמוסט מצוי (שם מדעי: Callithrix jacchus) הוא קוף קטן וחברתי מאוד מהעולם החדש בעל שיעורי רבייה גבוהים, שהוכח כמודל משכנע של פרימטים לא-אנושיים למחקר ביו-רפואי ומדעי המוח. חלק מהנקבות יולדות שלישייה; עם זאת, ההורים אינם יכולים לגדל את כולם. כדי להציל תינוקות אלה, פיתחנו שיטה לגידול ידני לגידול מרמוסטים שזה עתה נולדו. בפרוטוקול זה אנו מתארים את נוסחת המזון, זמן ההאכלה, תצורת הטמפרטורה והלחות, וכן את התאמת התינוקות המגודלים ביד לסביבת המושבה. שיטת גידול ידיים זו מגדילה באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של תינוקות מרמוסט (ללא גידול ידיים: 45%; עם גידול ידיים: 86%) ומספקת הזדמנות לחקור את התפתחותם של תינוקות מרמוסט בעלי רקע גנטי דומה שגדלו בסביבות שונות לאחר הלידה. מכיוון שהשיטה מעשית וקלה לשימוש, אנו צופים שניתן יהיה ליישם אותה גם במעבדות אחרות העובדות עם מרמוסטים נפוצים.

Introduction

מרמוסט מצוי (שם מדעי: Callithrix jacchus) הוא קוף עולם חדש קטן וארבורי שמקורו בדרום ומרכז אמריקה. השימוש במרמוסטים במחקר ביו-רפואי גדל במהירות בעשורים האחרונים בשל מספר יתרונות מרכזיים של מרמוסטים בהשוואה לפרימטים לא אנושיים אחרים (NHPs), כולל גודל גופם הקטן יותר, טיפול ורבייה קלים יותר בשבי, זמן הריון קצר יותר, התבגרות מינית מוקדמת יותר וסיכונים זואונוטיים נמוכים יותר 1,2,3,4,5,6 . למרמוסט המצוי מבנה מוח ותפקוד מוחי דומים לבני אדם והוא מציג רפרטואר עשיר של קולות והתנהגות חברתית גבוהה עם רגשות עשירים. זהו מודל NHP משכנע עבור סוגים שונים של מחקרים במדעי המוח, כגון מחקרים על עיבוד חושי 7,8,9,10,11,12,13,14, תקשורת קולית 15,16,17,18,19^, מודלים של פגיעה בחוט השדרה ²⁰,^21,22,23, מחלת פרקינסון 24,25,26,27,28^, ומחלות תלויות גיל ²⁹. בהשוואה ל- NHPs אחרים, למרמוסט הנפוץ יש קצב רבייה גבוה יחסית, מה שעשוי להיות שימושי לשינוי מהונדס^30,31,32. פרימט זה נמצא בשימוש נרחב גם בפרמקולוגיה, אנגיוגרפיה ומחקרי פתוגן ומערכת החיסון 33,34,35,36,37,38,39. עם זאת, היצע המרמוסטים נותר מוגבל מאוד, במיוחד בסין, ואינו יכול לענות על הצרכים הגדלים במהירות של המחקר המדעי.

במושבות מרמוסטים מאכילים את בעלי החיים הבוגרים פעם או פעמיים ביום, וכמה מוסדות משנים את תזונתם של מרמוסטים צעירים⁴⁰. בדרך כלל, מרמוסטים לתינוקות בדרך כלל נאחזים בחוזקה בגוף האב או האחים הגדולים לטיפול יומיומי ונמסרים לאם מספר פעמים ביום לחלב. כמה מרמוסטים נקבות יולדות שלישייה, ובמקרה זה, תינוק אחד או שניים אינם יכולים לשרוד בגלל מחסור בחלב; יתר על כן, חלק מההורים אינם מטפלים בתינוקותיהם משום שהם חסרי ניסיון הנקתי או מסיבות לא ידועות אחרות. זהו הפסד גדול עבור מעבדות רבות. מספר מחקרים דיווחו על שיטות לניהול תזונה של מרמוסטים בוגרים בשבי 40,41,42 תוך שימוש במזונות ופורמולות עם הרכבי אבות מזון, ויטמינים ומינרלים שונים, כמו גם פרוטוקולי הזנה שונים להעשרה (מחית, ג'ל, מטוהר או משומר)^2,41. מחקר קודם דיווח על שיטת גידול שיתופית לשלישיית מרמוסט⁴³, שבה מטפלים לוקחים תינוק אחד ביום, מאכילים אותו ביד לאורך כל היום, ומחליפים אותו בשלישייה אחרת למחרת. למרות ששיטה זו מאפשרת לתינוקות לקבל טיפול הורי, היא דורשת מטפל מנוסה שיתפוס את התינוק מגופם של ההורים מדי יום והיא דורשת עבודה רבה. עד כה, אף מחקר לא דיווח על שיטה מפורטת, שלב אחר שלב, לגידול ידיים עבור מרמוסטים שזה עתה נולדו.

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק שיטת גידול ידיים למתעניינים בפיתוח מרמוסט אך עם משאבים מוגבלים. בניגוד לשיטת הגידול השיתופי הקודמת⁴³, השיטה הנוכחית היא חלופה הגורמת פחות הפרעה למשפחת התינוק וקלה ללמידה. בהתבסס על כללי ההנקה הבסיסיים ועל 5 שנות עשייה, מאמר זה מתאר שיטת גידול ידנית לגידול מרמוסטים לתינוקות הכוללת את הכנת המזון, לוח זמנים להאכלה, תצורת הטמפרטורה והלחות של אינקובטור בעלי החיים, וכן התאמת חיות התינוקות לסביבת המושבה.

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ג'יאנג ועקבו אחר הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH).

1. דיור וגידול⁴⁴

1. הגדר את חדר המושבה עם מחזור יום / לילה של 12 שעות: 12, הטמפרטורה על 26-28 מעלות צלזיוס, והלחות היחסית על 45%-55%.
2. זוג מרמוסטים זכרים ונקבות בגיל 2-6 שנים, והחזיקו אותם בכלובים (850 מ"מ x 800 מ"מ x 800 מ"מ) עם מספיק מקום ואוויר צח עם מערכת אוורור 24 שעות.
3. ספקו קרשי מנוחה, נדנדות, מוטות וערסלים בכלובים.
4. האכילו את זוג המרמוסטים במים מתוקים וב-30-40 גרם מזון פעמיים ביום, כולל דגני בוקר, ביצים, בטטות, דבש, פירות, ירקות ותולעי ארוחה.
   הערה: וטרינרים ונסיינים חייבים לבדוק את מתקן בעלי החיים לפחות פעם ביום כדי להבטיח שכל אדם חולה מאובחן ומטופל באופן מיידי.

2. הכנה לפני לידת תינוקות המרמוסט

1. טיפול במרמוסטים בהריון
   הערה: זמן ההתעברות אובחן על ידי מישוש (בדרך כלל 10-20 יום לאחר תחילת התקופה העוברית), והתייחסנו גם להיסטוריה הרבייה של הנבדקים בעלי החיים.
   1. לספק מרחב גדול יותר והפרעה אנושית מינימלית לזוגות הרבייה.
   2. האכילו את זוגות הרבייה במזון נוסף כגון תולעי ארוחה, ביצים, יוגורט ופירות יבשים כדי להבטיח תזונה לנקבות.
   3. טפלו ובדקו לעתים קרובות את המרמוסטים ההרות כדי להתכונן ללידה שלהם.
      הערה: תקופת ההיריון של המרמוסט מוערכת ב 148 ימים ± 4.3 ימים⁴⁵.
2. הכינו את הפריטים הבאים: אינקובטור לבעלי חיים (855 מ"מ [רוחב] x 470 מ"מ [L] x 440 מ"מ [H]), רפידות החתלה חד פעמיות (גדלים M/L), מגבונים לתינוקות, צעצועי קטיפה (איור 1A), גלילי צעצוע (איור 1B), מסגרות טיפוס (איור 1B), שמיכות (10 ס"מ х 10 ס"מ, איור 1C) ומשקל אלקטרוני (דיוק של 0.2 גרם, איור 1F).
   הערה: כדי למנוע תלייה של בעלי חיים, צעצועי הקטיפה לא צריכים להיות בעלי מבני לולאה.
3. הכנת מזון ומכשירי האכלה
   1. הכינו את הפריטים הבאים: פורמולה לתינוקות (מתאימה לגיל 0-12 חודשים), משחת אורז לתינוקות (מתאימה לגיל 0-6 חודשים), קומקום חשמלי, (100 מ"ל), כרית חימום, צלחת שקילה מפלסטיק (80 מ"מ x 80 מ"מ x 22 מ"מ, איור 1D), צינורות צנטריפוגות סטריליות (50 מ"ל), מזרקים סטריליים חד פעמיים (1-5 מ"ל), מזרקים תוך ורידיים (לפטמות הזנה בהתאמה אישית) (איור 1E), ומטושים (80-100 ס"מ).
      הערה: כדי ליצור פטמה להאכלה, חתך נעשה 1 ס"מ מקצה מזרק תוך ורידי המחובר למזרק (איור 1E).
4. הכנת טופס הקלטה
   1. הכינו טופס, בדרך כלל באורך מספר עמודים, עבור כל מרמוסט לרישום מידע בסיסי כגון שם, תאריך לידה, משקל לידה, הורים, מידע בסיסי אחר שמעניין כגון היקף הראש ואורך הזנב, מידע רבייה כגון תאריך ושעת הרבייה, כמות (מ"ל) צריכת המזון, מצב עשיית הצרכים (כן/לא, קשה/רופף), ואת טמפרטורת האינקובטור ולחות.
      הערה: בדרך כלל, משקל הגוף נמדד ונרשם פעמיים ביום, פעם אחת לפני הארוחה הראשונה ופעם אחת לפני הארוחה האחרונה.

איור 1: תמונות של הפריטים באינקובטור וכלי ההזנה והאביזרים. (א) צעצועי קטיפה; (ב) רולר צעצוע ומסגרות טיפוס; (ג) שמיכה; (ד) כלי שקילה מפלסטיק; (ה) מזרק ומזרק תוך ורידי עם פטמת הזנה בהתאמה אישית; (ו) סולם אלקטרוני; (ז) מטפל בעל ציוד מגן אישי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הליך גידול ידיים

1. נקו ועיקרו את החדר לפני תאריך היעד.
   1. רססו חומצה היפוכלורית או 75% אלכוהול אתילי על הרצפה והשולחן, השאירו למשך 30 שניות, ואז נגבו את השולחן ונגבו את הרצפה.
2. הגדר את הטמפרטורה של האינקובטור ב 35 °C (75 °F) ואת הלחות ב 40%. בדרך כלל, כדי לדמות את דרישת הטמפרטורה הבסיסית של מרמוסטים לתינוקות, כפי שמראה טבלה 1 , לפני היום שלאחר הלידה 14 (P14), שמור על טמפרטורת האינקובטור על 35 מעלות צלזיוס, ומ- P15 ואילך, הורד את הטמפרטורה ב- 0.5 מעלות צלזיוס כל 3 ימים. שמרו על לחות של 40%-45% בתוך האינקובטור, הקרוב ללחות המושבה ושומר על פרוות התינוקות יבשה.
3. אריח כרית החתלה חד פעמית לכיסוי השלדה של האינקובטור.
4. כדי למזער את הלחץ של התינוקות, הניחו כמה שמיכות וצעצועי קטיפה באינקובטור לפני הצגת המרמוסטים לתינוקות, אשר נוטים לחקות את המרמוסטים הבוגרים.
   הערה: השמיכות וצעצועי הקטיפה מוכנסים לכלוב הביתי של זוגות הרבייה למשך יום אחד לפני השימוש.
5. הכניסו את המרמוסטים לתינוקות באינקובטור והניחו אותם על צעצועי הקטיפה ברגע שהם מופרדים מהוריהם בכלוב הביתי.
   הערה: כדי למנוע בידוד חברתי ובהתאם לרווחת בעלי החיים, בדרך כלל, שני תינוקות נבחרים יחד לגידול ידיים.
   1. לבשו ציוד מגן אישי מעוקר (PPE, איור 1G) לפני ההאכלה.
   2. לחמם כמה שמיכות ל 35 °C (75 °F).
   3. החזיקו בעדינות את המרמוסט התינוק עם שמיכות חמות, וקבלו את משקל החיה כמשקל הלידה.
   4. מעבירים את המרמוסט התינוק לאינקובטור עם שמיכות חמות.
   5. קח רשומות, כפי שצוין בשלב 2.4.
6. ערבבו מרכיבי מזון והאכילו את התינוק במרמוסט.
   1. יש להמיס 5 גרם של פורמולה לתינוקות ב-30 מ"ל של מים רותחים בטמפרטורה של 50°C בצינור צנטריפוגה סטרילי במינון 50 מ"ל.
      הערה: מרמוסטים לתינוקות בגילאים שונים לאחר הלידה זקוקים למתכוני מזון שונים. טבלה 2 כוללת את המינונים השונים של פורמולה לתינוקות, ממרח אורז ומים בגילאים שלאחר הלידה מ-P1 עד P60. המינון הוא בדרך כלל מספיק ליום אחד. ערבבו את המרכיבים לפני הארוחה הראשונה, ואחסנו את שאר המזון במקרר בטמפרטורה של 4°C. מחממים את המזון ל 30-35 מעלות צלזיוס לכל ארוחה.
   2. קח 1 מ"ל של מזון עם מזרק 1 מ"ל, ומכסה את המזרק עם פטמת האכלה בהתאמה אישית.
      הערה: בחר מזרק בגודל הנכון, תוך הפניה לטבלה 2.
   3. שמור על טמפרטורת המזון על 30-35 מעלות צלזיוס עם כרית החימום.
   4. חממו את הידיים לפני ההאכלה, והחזיקו בעדינות את המרמוסט התינוק עם שמיכה חמה ביד אחת באינקובטור.
   5. הכניסו את פטמת ההאכלה לפיו של המרמוסט התינוק בזמן שראשו של המרמוסט התינוק מוחזק ברכות עם האגודל והאצבע המורה של היד האוחזת של המטפלת, ודחפו לאט לאט את האוכל מהמזרק במהירות קבועה.
      הערה: לעולם אל תדחפו את המזון מהר יותר מאשר המרמוסט התינוק בולע. דחיפה מהירה עלולה לגרום לחנק, כאשר מזון יוצא מהאף דרך הגרון. זה יכול לגרום למחלות כגון דלקת ריאות, אשר יכול אפילו להוביל למוות. אם המזון עולה על גדותיו, המרמוסט התינוק ייאבק. בכל פעם שזה קורה, הפסיקו להאכיל ונגבו את האוכל מעל פני החיה בזהירות. המשיכו להאכיל לאחר שהמרמוסט מתחיל להתנהג כרגיל.
7. לאחר מרמוסט התינוק צורכת כמות נאותה של מזון, לנגב את פי הטבעת שלה עם מטוש עם מים חמים, אשר גם מנקה את פי הטבעת ומקדם את הצרכים.
8. התבונן בחיה במשך כמה דקות, ולבדוק את התנועה ואת הצרכים של החיה.
9. רשום את זמן ההאכלה, כמות (מ"ל) של צריכת המזון, מצב עשיית הצרכים (כן/לא, קשה/רופף), ואת טמפרטורת האינקובטור והלחות.
   הערה: עטפו את המרמוסט של התינוק בשמיכות חמות במהלך השקילה כדי למנוע מהתינוק להתקרר או להיפצע.
10. שמרו על שלדת האינקובטור נקייה על ידי איסוף צואה מוצקה או החלפה לכרית החתלה חד פעמית חדשה.
11. לפני P50, יש להאכיל את התינוק במרמוסט לפי שלבים 3.3-3.7, ולהשתמש במינון של מרכיבי המזון ובזמן ההאכלה ובתדירות המוצגים בטבלה 2.
12. מ-P50 ואילך, המרמוסט התינוק מוכן בדרך כלל לאכילה מרצון.
    1. השתמשו בכלי שקילה מפלסטיק במקום מזרקים. להכין את האוכל על ידי ערבוב מרכיבי מזון ישירות בצלחת; עיין בטבלה 2 לקבלת הסכומים.
    2. מכניסים את צלחת המזון לאינקובטור, ומתקנים את התחתית למקרה שהיא תתהפך. התבוננו במשך מספר דקות כדי לוודא שהמרמוסטים לתינוקות אוכלים את האוכל. בפעמים הראשונות, הדריכו את בעל החיים לאכול מרצונו על ידי פיתוי בעל החיים לצלחת המזון והכוונת פיו לגעת במזון מספר פעמים.
       הערה: לעולם אל תתנו לאף של בעל החיים לגעת באוכל. בדרך כלל, החיה לומדת לאכול מרצון ביום אחד.

4. התאקלמות לפני חזרת המרמוסטים הפעוטים למושבה

הערה: בדרך כלל, גידול היד מסתיים כאשר המרמוסטים לתינוקות לומדים לאכול בעצמם. ישנם מספר הליכי הסתגלות שיש לבצע לפני החזרתם לכלוב הביתי במושבת המרמוסט.

1. העבירו את המרמוסטים הפעוטים מאינקובטור בעלי החיים לכלובים קטנים (45 ס"מ x 45 ס"מ x 40 ס"מ), הדומים לכלוב ציפורים. תלו בקבוק מים (50 מ"ל) על כל כלוב קטן.
2. מעבירים את הכלובים הקטנים עם המרמוסטים לתינוקות למושבה, וממקמים אותם קרוב לכלוב המשפחתי.
3. להאכיל את המרמוסטים התינוק בנפרד עם צלחת שקילה פלסטיק במשך שבוע אחד, ערבוב המזון על פי המתכונים היומיים שהוכנו עבור המושבה כולה.
4. ערכו רישום של משקל הגוף ומצב עשיית הצרכים פעם ביום.

5. מרמוסטים תינוקות חוזרים לכלוב המשפחתי

הערה: לאחר שהייה בכלוב הקטן במשך 7-10 ימים, המרמוסטים הפעוטים בדרך כלל מסתגלים היטב לסביבת המושבה ואינם מפגינים יותר חרדה.

1. החזירו את המרמוסטים לתינוקות לכלוב המשפחתי בבוקר.
2. התבוננו בבעלי החיים במשך 15 דקות לפחות כדי לוודא שאין נשיכות, מריבות או מרדפים בין בני המשפחה לבין המצטרפים החדשים.
   הערה: אם מתרחשות נשיכות, ריבים או מרדפים, יש להפריד את התינוק מהאחרים בהקדם האפשרי; ולנסות להחזיר את התינוק למשפחתו פעם נוספת ביום אחר. אם הכשל מתרחש שוב, בחר משפחה אחרת כדי לטפח אותו. הקבוצות המשפחתיות בעלות ניסיון הורי עשיר הן הבחירה הראשונה לאומנה. שים צעצוע קטיפה בכלוב חדש כדי ללוות את הקוף התינוק אם אף משפחה לא מקבלת את זה.
3. הפסיקו להאכיל את התינוקות במרמוסטים בנפרד, והתחילו להאכיל אותם באמצעות התזונה למושבה.
4. שימו לב לפעילות המרמוסטים של התינוק במשך שבוע לאחר חזרתם לכלוב המשפחתי.
5. למדוד את משקל הגוף של מרמוסטים התינוק כל 2 ימים, ולעשות שיא. אם הם יורדים במשקל, האכילו אותם במזון מזין נוסף על ידי מזרק בכלוב המשפחתי.
6. לספק טיפול יומיומי למרמוסטים התינוקות, כמו למרמוסטים במושבה.

תוצאות

משקל הגוף הוא מדד מפתח להתפתחות הגוף של בעלי חיים והוא משמש כאינדיקטור למצב הבריאותי של המרמוסטים בפרוטוקול זה. בעבודה זו, משקלי הגוף של בעלי החיים שגודלו ביד עלו בהדרגה עם הגיל (איור 2A, n = 16), בדומה למשקלים של תינוקות שזה עתה נולדו במחקר קודם⁴⁶. כדי למזער את ההפרע...

Discussion

המרמוסט הנפוץ הוא מודל NHP שימושי מאוד למחקר ביו-רפואי ומדעי המוח. עם זאת, משאבי המרמוסט מוגבלים מכדי לענות על הצרכים הגדלים במהירות. בעבודה זו פיתחנו שיטת גידול ידיים שלא רק מגדילה את שיעור ההישרדות של תינוקות מרמוסט אלא גם מספקת הזדמנות לחקור את התפתחותם לאחר הלידה. שיטת גידול ידנית זו היא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
animal incubator	RCOM, Korea		MX - BL600N, 855 mm (W) x 470 mm (L) x 440 mm (H)
baby milk powder	Meadjohnson, America		suitable for 0-12 months of age, executive standard - GB25596
baby rice paste	HEINZ, China		suitable for 0-6 months of age, executive standard - GB10769
baby wipes	babycare, China		soft
beaker	ShuNiu, China		100 mL
blankets	Grace, China		10 cm × 10 cm, soft
climbing frame	WowWee, China		firm and no small circular structures
disposable diaper pads	Hi Health Pet, China		either M or L size
disposable sterile syringe	Cofoe, China		1 mL, 2.5 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL
electronic scale	YouSheng, China		measuring range from 0 to 6,000 g with precision of 0.2 g
intravenous injector	HD, China		0.55 mm x 20 mm needle
kettle	FGA, China		warm-keeping kettle 1,500 mL
lactulose	BELCOL, China		to solve constipation
plastic weighing dish	SKSLAB, China		80 mm x 80 mm x 22 mm, used as a bowl
plush toy	Lebiyou, China		soft
probiotic powder	G-Pet, China		to regulate gastrointestinal environment
sterile centrifuge tube	NEST, China		50 mL
swab	OYEAH, China		80 - 100 mm
toy roller	WowWee, China		firm and no small circular structures