זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

Summary

כאן מתוארת גישה פשוטה ומהירה לביצוע הזרקות תוך-מוחיות בעכברים בגישה של יד חופשית (כלומר, ללא מכשיר סטריאוטקסי).

Abstract

חקירת מערכות נוירואנדוקריניות דורשת לעתים קרובות העברה של תרופות, וירוסים או חומרים ניסיוניים אחרים ישירות למוחם של עכברים. הזרקה תוך-מוחית (ICV) מאפשרת העברה נרחבת של חומר הניסוי ברחבי המוח (במיוחד במבנים הסמוכים לחדרים). כאן מתוארות שיטות לביצוע זריקות ICV ביד חופשית בעכברים בוגרים. על ידי שימוש בציוני דרך חזותיים ומישושיים על ראשי עכברים, זריקות לחדרים הרוחביים יכולות להתבצע במהירות ובאמינות. ההזרקות נעשות באמצעות מזרק זכוכית המוחזק בידו של הנסיין ומונח במרחקים משוערים מציוני הדרך. לפיכך, טכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית. יתר על כן, טכניקה זו דורשת רק הרדמה איזופלורנית קצרה, המאפשרת הערכה עוקבת של התנהגות עכבר ו / או פיזיולוגיה בעכברים ערים המתנהגים בחופשיות. הזרקת ICV ביד חופשית היא כלי רב עוצמה להעברה יעילה של חומרים ניסיוניים למוחם של עכברים חיים, וניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות כגון דגימת דם תכופה, מניפולציה של מעגלים עצביים או הקלטה in vivo כדי לחקור תהליכים נוירואנדוקריניים.

Introduction

אספקת חומרים ניסיוניים, כגון תרופות¹, וירוסים² או תאים³, למוח נחוצה לעתים קרובות למחקר נוירואנדוקריני. אם הסוכן אינו חוצה בקלות את מחסום הדם-מוח או שמטרת הניסוי היא לבדוק באופן ספציפי את ההשפעות המרכזיות של הסוכן, חשוב שתהיה שיטה אמינה להעברת זריקות למוח. יתר על כן, הזרקה לחלל התוך-מוחי (ICV) מספקת הזדמנות להפיץ את החומר באופן נרחב במוח ומספקת אזור מטרה גדול, ובכך מגדילה את הסיכוי להזרקה מוצלחת².

שיטה נפוצה לביצוע זריקות ICV כוללת מיקום של צינורית מגורים קבועה. בגישה זו, יש צורך במסגרת סטריאוטקסית כדי למקם את הצינורית הזמינה מסחרית או בהתאמה אישית, שכן הצינורית מודבקת או מלטת במקומה. לעתים קרובות, עם ההתאוששות, מינון supraphysiological של אנגיוטנסין II מנוהל דרך הצינורית, ואם התנהגות השתייה נצפתה מיד, אז הצינורית נחשבת ממוקמת כראוי⁴. לגישה זו יתרונות רבים, ביניהם היכולת לבצע עירוי ארוך טווח והיכולת להזריק לאותו בעל חיים מספר פעמים; בנוסף, אם אנגיוטנסין II מועסק, מיקום נכון ניתן לאשר לפני הממשל של תרכובות ניסיוניות. עם זאת, ישנן כמה מגבלות להצבת צינורית קבועה, כולל הדרישה לציוד יקר (מסגרת סטריאוטקסית), האפשרות לנזק לצינורית לאחר הנחתה (למשל, עכברים יכולים ללעוס צינורית של חבר לכלוב), והאפשרות של זיהומים סביב הצינורית הקבועה. זריקות ICV בודדות יכולות להתבצע באמצעות מסגרת סטריאוטקסית³, אשר, למרות יעילותה, דורשת חשיפה משמעותית להרדמה, ולכן עשויה לטשטש כמה השפעות פיזיולוגיות והתנהגותיות חריפות של הטיפול. בנוסף, מיקום עכברים במסגרת סטריאוטקסית דורש אימון משמעותי להשגת מיקום יציב ומניעת קריעה של תעלות האוזן.

כאן מתוארת שיטה מבוססת לביצוע זריקות ביד חופשית בעכברים. שיטה זו מבוססת על דוחות קודמים ^5,6. היתרונות של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, מהירה, ואינה דורשת ציוד מיוחד כגון מסגרת סטריאוטקסית. כפי שיתואר להלן, הליך זה כרוך מניפולציה מזרק זכוכית ביחס ציוני דרך על ראש העכבר כדי לבצע את הזריקות, אשר ניתן לעשות במהירות, ולכן, דורש רק כמה דקות של הרדמה גז ביום הניסוי.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת מדינת קולורדו (#3960) ואוניברסיטת קליפורניה סן דייגו מוסדיים טיפול ושימוש בבעלי חיים, שם נאספו הנתונים המייצגים (S13235, PI Kellie Breen Church). נתונים מחמש נקבות בוגרות ושני עכברים זכרים בוגרים C57/BL6 (בני 9-16 שבועות) מתוארים בסעיף הנתונים המייצגים. נקבות עכברות עברו כריתת שחלות 3-4 שבועות לפני הזרקת ICV ואיסוף דם כמתואר לעיל⁷. לפני הניסויים, עכברים אלה שוכנו עם מחזור אור כהה של 12 שעות / 12 שעות והייתה להם גישה חופשית להאכלה ומים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. ביצוע craniotomy

הערה: קרניוטומיה יכולה להתבצע יום אחד או יותר לפני ההזרקה בפועל, מה שהופך את תהליך ההזרקה למהיר יותר ביום הניסוי.

1. הכינו את החומרים לקרניוטומיה כמתואר להלן.
   1. הניחו משטח ספסל נקי או חומר וילונות על משטח העבודה. הדביקו את חרוט האף של מאדה איזופלורן למשטח העבודה (קרוב לנסיין, אך פונה אליו; ראו איור 1A).
   2. מניחים צינור סילסטי על קצה מחט סטרילית חדה 18 גרם כך ~ 1 מ"מ של קצה המחט בולט. מניחים צינור סילסטי על קצה מחט קהה סטרילית כך ~ 1 מ"מ של קצה המחט בולט.
      הערה: יש להשתמש במחטים ארוזות מראש נפרדות וסטריליות (חדות וקהות) עבור כל עכבר.
   3. אספו מכונת גילוח חשמלית, פילינג יוד, גזה סטרילית ופדים אלכוהוליים להכנת אתר ההזרקה.
2. תרגול הזזת מחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ קאודלי כמתואר להלן.
   1. השתמשו בסרגל ובעט כדי לסמן דף נייר עם נקודת התחלה (זו תהיה ברגמה), סימן 2 מ"מ משמאל או מימין, וסימן נוסף 1 מ"מ מעל האחרון (זה יהיה אתר ההזרקה; ראו איור 1B).
   2. תרגלו הזזת המחט מנקודת ההתחלה לנקודה 1 לסימון נקודה 2 (ברגמה לאתר ההזרקה) עד שתהיו בטוחים שניתן לחזור על התנועה ללא קווי עזר.
      הערה: הקואורדינטות המתוארות כאן יעילות בעכברי C57/BL6 בוגרים, אך זנים אחרים או קבוצות גיל אחרות עשויים לדרוש הסתגלות.
3. הכן את העכבר עבור craniotomy כמתואר להלן.
   1. הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה והרדימו את העכבר עם איזופלורן 3%-4% בחמצן ברמה רפואית. עם תרגול והיכרות עם ההליך, להפחית את משך החשיפה הכולל isoflurane פחות מ 10 דקות עבור הליך craniotomy.
      אזהרה: חשיפה לאיזופלורן מסוכנת לבריאות האדם; יש להשתמש במכשיר אידוי איזופלורן מאושר ונבדק באזור מאוורר היטב עם אמצעים לסילוק גזי פסולת.
   2. ברגע שרפלקס הבוהן נעדר, יש לגלח את ראש החיה. יש למרוח חומר סיכה לעיניים.
   3. הניחו את העכבר על משטח העבודה כשהראש בתוך חרוט האף כדי לשמור על הרדמה.
   4. לנהל סוכן משכך כאבים, כגון buprenorphine (0.6-0.8 מ"ג / ק"ג משקל גוף עכבר, תת עורית), על פי הוראות הספק.
   5. נקו את מקום ההזרקה על ידי ניגוב הראש בגזה סטרילית טבולה בתמיסת יוד (בצעו שלושה קרצוף), ולאחר מכן נגבו עם כרית קרצוף אלכוהול (בצעו שלוש פעמים).
      הערה: יש להסיר את הפרווה ולנקות את העור סביב אתר ההזרקה ולהשתמש במכשירים ומחטים סטריליים, בהתאם להמלצת האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית למניעת זיהומים.
4. החזק בחוזקה את ראש העכבר ביד הלא דומיננטית. מקמו את הראש שטוח ככל האפשר על משטח העבודה.
5. אתר את מקום ההזרקה.
   1. השתמש מחט חדה מוכן 18 G כדי לזהות תחילה bregma; לשם כך, גרור את המחט על פני העור של הראש לאורך קו האמצע, נע במישור rostral-caudal. דמיינו משולש שווה צלעות שבו שני הקודקודים הם העיניים והקודקוד השלישי הוא המיקום המשוער של ברגמה (ראו איור 1C).
   2. מ bregma, להעביר את המחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ caudal לאתר ההזרקה.
6. תוך כדי החזקת המחט אנכית, דוחפים בחוזקה את המחט דרך העור והעצם עד שהצינור סומק עם העור.
7. משכו את המחט, סובבו את המחט ולחצו שוב דרך העור והעצם. חזור על התהליך עד שנוצר חור קטן בעצם.
8. השתמש במחט הקהה כדי לבדוק שנוצר חור מספיק בעצם. המטרה היא ליצור פתח בעצם גדול מספיק כדי שהמחט הקהה תעבור דרכו.
9. הסר את העכבר מחרוט האף, נקה כל דם מאתר ההזרקה עם גזה סטרילית, והנח את העכבר בכלוב על כלוב חם יותר עד ער. מכיוון שהפתח שנעשה על ידי הקרניוטומיה הוא קטן (מחט 18 גרם), אין צורך לסגור את האתר בתפר או קליפסים לפצע.
   הערה: הפתח המיוצר כאן הוא קטן (18 גרם), ולכן מוסדות רבים רואים הליך זה זריקה בניגוד לניתוח. יתר על כן, למרות שנוצר פתח דרך העור והעצם למוח, החזקת העור מתוח גורמת לכך שהחורים אינם מיושרים, מה שככל הנראה מסייע במניעת מגע של המוח עם פלורת העור או מצעי הכלוב.

2. ביצוע הזריקה

1. הכינו את החומרים להזרקה כמתואר להלן.
   1. הניחו משטח ספסל נקי או חומר וילונות על משטח העבודה. הדביקו את חרוט האף של מאדה איזופלורן למשטח העבודה (קרוב לנסיין, אך פונה אליו; ראו איור 1A).
   2. חבר מחט 27 G באורך 10 מ"מ עם שיפוע 45° למזרק זכוכית 5 μL. מניחים צינור סילסטי על המחט כך 3.5 מ"מ של קצה המחט בולט; השתמשו בסרט מעבדה כדי להצמיד את הצינורית לגוף המזרק (ראו איור 1D).
   3. הכינו את אמצעי ההזרקה (תרופה, וירוס או נוזל אחר להזרקה) בצינור. לקבלת התוצאות המייצגות במחקר זה, הוזרק מי מלח איזוטוניים סטריליים.
      הערה: בחר צינור המאפשר גישה באמצעות מזרק הזכוכית ומחט, כגון צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל.
   4. ציירו 3 מיקרוליטר של אמצעי הזרקה לתוך מזרק הזכוכית. ראשית, לצייר יותר מהנפח הרצוי, ולהוציא עד 3 μL נשאר מזרק.
   5. אספו פילינג יוד, גזה סטרילית ורפידות אלכוהול להכנת אתר ההזרקה.
   6. הפעל טיימר מעבדה במצב ספירה לאחור ומקם את הטיימר כך שיהיה גלוי לנסיין בעת ביצוע הזרקות.
   7. תרגול הזזת מחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ קאודלי כפי שבוצע ביום הקודם.
2. הכן את העכבר להזרקה כמתואר להלן.
   1. מניחים את העכבר בתא האינדוקציה ומרדים את העכבר עם איזופלורן. ברגע שרפלקס הבוהן נעדר, מרחו חומר סיכה לעיניים, והניחו את העכבר על משטח העבודה כשהראש בקונוס האף.
   2. נקו את מקום ההזרקה עם שלושה מגבונים של יוד ואלכוהול כל אחד. זהה את אתר ההזרקה באמצעות מחט 18 גרם (או מחט קהה) כמתואר בשלב 1.8. החור שנוצר במהלך craniotomy צריך להיות לזיהוי.
      הערה: אם הקרניוטומיה לא בוצעה מראש, או אם החור בגולגולת אינו ניתן לזיהוי, ניתן לבצע את הקרניוטומיה כאן.
3. בצע את ההזרקה עם מזרק זכוכית כמתואר להלן.
   1. החזק בחוזקה את ראש העכבר ביד הלא דומיננטית. מקמו את הראש שטוח ככל האפשר על משטח העבודה.
   2. מניחים את המחט של מזרק הזכוכית דרך החור בגולגולת עד שהצינור המונח מעל המחט שהוכן בשלב 2.1.2 מונח על עור העכבר.
   3. החזק את המזרק אנכית ככל האפשר, תוך שימת לב הן למישור העטרה והן למישור הסגיטלי. הזריקו באיטיות את המדיה במשך דקה.
   4. החזיקו את המזרק והמחט במקומם למשך דקה נוספת לאחר סיום ההזרקה כדי למזער את הזרימה חזרה. לאט לאט למשוך את המחט מראשו של העכבר.
   5. הסר את העכבר מחרוט האף, נקה כל דם מאתר ההזרקה עם גזה סטרילית (אם יש קיים), והנח את העכבר בכלוב על כלוב חם יותר עד ער.

3. אישור מיקום ההזרקה

1. מרדימים עמוק ומחוררים את העכבר במי מלח ו-4% פרפורמלדהיד במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כפי שתואר קודם לכן⁸. אחסנו את המוח ב-30% סוכרוז ב-PBS בטמפרטורה של 4°C עד שהמוח שוקע (בדרך כלל יומיים).
2. חתכו 20-50 מיקרומטר קטעי קורונל על קריוסטט כפי שתואר קודם⁹. בזמן החיתוך, התבוננו בדרכי ההזרקה בבלוק הרקמות. רשום אם מערכת ההזרקה חותכת בבירור את החדר הצידי.

תוצאות

כאשר מבוצעת בהצלחה, טכניקה זו מאפשרת משלוח מהיר של סוכן ניסיוני לתוך מערכת החדרים. פרופיל דופק של הורמון מחלמן (LH) מעכבר שעבר כריתת שחלות שקיבל זריקת ICV של 3 μL של מי מלח איזוטוניים סטריליים, הכלי לתרכובות פרמקולוגיות רבות, מוצג באיור 2A. דוגמה זו מדגימה כי חשיפה קצרה להרדמת גז?...

Discussion

כאן מתואר אמצעי פשוט ויעיל לביצוע זריקות ICV בעכברים. מכיוון שטכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית, גישה זו להעברה מרכזית של תרופות וסוכני ניסוי נגישה לחוקרים נוספים. בנוסף, גישה זו היא תפוקה גבוהה יחסית שכן הליך ההכנה וההזרקה יכול להתבצע במהירות.

מכיוון שהליך זה דורש מניפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge blunt needles	SAI Infusion	B18-150
18-gauge needles	BD Medical	305195
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-363-750
Bench pad	Fisher Scientific	14-206-62AC22
Betadine solution	Fisher Scientific	NC1696484
Buprenorphine	Patterson Vet Supply	07-892-5235	Controlled substance
Eyelube	Fisher Scientific	50-218-8442
Glass syringe	Hamilton	7634-01
Injection needle	Hamilton	7803-01	27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane	Patterson Vet Supply	07-893-8441
Isoflurane vaporizer	Vet Equip	V-10
Laboratory Tape	VWR	89098-128
Medical grade oxygen	Airgas	OX USPEA
Paraformaldehyde	Millipore-Sigma	8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	J67802.K2
PulsaR Software	Open source, University of Otago		See ref 9
Ruler	Fisher Scientific	12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.)	DOW	508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.)	DOW	508-009
Sterile saline	VWR	101320-574
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500