Внутримозговые инъекции в свободную руку у мышей

Резюме

Здесь описан простой и быстрый подход к выполнению внутримозговых инъекций мышам с использованием свободного доступа (то есть без стереотаксического устройства).

Аннотация

Исследование нейроэндокринной системы часто требует доставки лекарств, вирусов или других экспериментальных агентов непосредственно в мозг мышей. Внутримозговая инъекция (ИЦВ) позволяет широко распространять экспериментальный агент по всему мозгу (особенно в структурах вблизи желудочков). В данной статье описаны методы проведения инъекций ICV в свободной руке у взрослых мышей. Используя визуальные и тактильные ориентиры на головах мышей, инъекции в боковые желудочки можно делать быстро и надежно. Инъекции делаются стеклянным шприцем, который экспериментатор держит в руке и размещает на приблизительном расстоянии от ориентиров. Таким образом, данная методика не требует стереотаксического кадра. Кроме того, этот метод требует только кратковременной анестезии изофлураном, что позволяет впоследствии оценить поведение и/или физиологию мышей у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей. Инъекция ICV в свободную руку является мощным инструментом для эффективной доставки экспериментальных агентов в мозг живых мышей и может сочетаться с другими методами, такими как частый забор крови, манипуляции с нейронными цепями или запись in vivo для исследования нейроэндокринных процессов.

Введение

Доставка экспериментальных агентов, таких как лекарства¹, вирусы² или клетки³, в мозг часто необходима для нейроэндокринных исследований. Если агент не может легко проникнуть через гематоэнцефалический барьер или цель эксперимента состоит в том, чтобы специально проверить центральные эффекты препарата, важно иметь надежный метод доставки инъекций в мозг. Кроме того, инъекция в внутримозговое (ВЦВ) пространство дает возможность широко распределить агент в головном мозге и обеспечивает большую целевую область, тем самым повышая вероятность успешной инъекции².

Распространенный метод проведения инъекций ICV включает в себя установку постоянной внутренней канюли. При таком подходе стереотаксическая рама необходима для позиционирования имеющейся в продаже или изготовленной на заказ канюли, так как канюля приклеена или зацементирована на месте. Часто при выздоровлении через канюлю вводят супрафизиологическую дозу ангиотензина II, и если сразу наблюдается питьевое поведение, то канюля считается правильно поставленной⁴. Такой подход имеет множество преимуществ, в том числе возможность проведения длительной инфузии и возможность многократного введения одному и тому же животному; Кроме того, если используется ангиотензин II, правильное размещение может быть подтверждено до введения экспериментальных соединений. Тем не менее, существуют некоторые ограничения для установки постоянной канюли, в том числе необходимость дорогостоящего оборудования (стереотаксическая рама), возможность повреждения канюли после установки (например, мыши могут жевать канюлю соседа по клетке) и возможность инфекций вокруг постоянной канюли. Однократные инъекции ICV могут быть сделаны с использованием стереотаксического фрейма³, который, хотя и эффективен, требует значительного воздействия анестезии и, таким образом, может скрывать некоторые острые физиологические и поведенческие эффекты лечения. Кроме того, помещение мышей в стереотаксическую рамку требует существенной подготовки для достижения стабильного положения и предотвращения разрыва слуховых проходов.

Здесь описан устоявшийся метод проведения инъекций свободной рукой у мышей. Этот метод основан на предыдущих отчетах ^5,6. Преимущества этой методики в том, что она проста, быстра и не требует специализированного оборудования, такого как стереотаксическая рамка. Как описано ниже, эта процедура включает в себя манипуляции со стеклянным шприцем относительно ориентиров на голове мыши для выполнения инъекций, которые могут быть сделаны быстро и, таким образом, требуют всего нескольких минут газовой анестезии в день эксперимента.

протокол

Все процедуры были одобрены Университетом штата Колорадо (#3960) и Комитетами по институциональному уходу за животными и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего, где были собраны репрезентативные данные (S13235, PI Kellie Breen Church). Данные пяти взрослых самок и двух взрослых самцов мышей C57/BL6 (в возрасте 9-16 недель) представлены в разделе репрезентативных данных. Самкам мышей проводили овариоэктомию за 3-4 недели до инъекции ICV и забора крови, как описано ранее⁷. До эксперимента эти мыши содержались с циклом 12 часов света и 12 часов темного света и имели свободный доступ к корму и воде в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. Выполнение трепанации черепа

ПРИМЕЧАНИЕ: Трепанация черепа может быть выполнена за один или несколько дней до фактической инъекции, что ускоряет процесс инъекции в день эксперимента.

1. Подготовьте материалы для трепанации черепа, как описано ниже.
   1. Положите на рабочую поверхность чистую накладку или драпировочный материал. Прикрепите носовой обтекатель испарителя изофлурана к рабочей поверхности (близко к экспериментатору, но в противоположную сторону; см. рисунок 1А).
   2. Наденьте силастическую трубку на конец стерильной острой иглы 18 G так, чтобы ~1 мм кончика иглы выступало. Поместите силастическую трубку на конец стерильной тупой иглы так, чтобы ~1 мм кончика иглы выступало.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши следует использовать отдельные стерильные предварительно упакованные иглы (острые и тупые).
   3. Подготовьте электробритву, йодный скраб, стерильную марлю и спиртовые салфетки для подготовки места инъекции.
2. Потренируйтесь перемещать иглу на 2 мм вбок и на 1 мм в хвост, как описано ниже.
   1. С помощью линейки и ручки отметьте на листе бумаги начальную точку (это будет брегма), отметку в 2 мм слева или справа и еще одну отметку на 1 мм выше последней (это будет место инъекции; см. рисунок 1Б).
   2. Потренируйтесь перемещать иглу от начальной точки к отметке 1 к отметке 2 (брегма к месту инъекции) до тех пор, пока не убедитесь, что движение повторяется без направляющих.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты, описанные здесь, эффективны для взрослых мышей C57/BL6, но другие штаммы или возрастные группы могут потребовать корректировки.
3. Подготовьте мышь к трепанации черепа, как описано ниже.
   1. Поместите мышь в индукционную камеру и обезболите мышь 3%-4% изофлураном в медицинском кислороде. С практикой и знакомством с процедурой сократите общую продолжительность воздействия изофлурана до менее чем 10 минут для процедуры трепанации черепа.
      ВНИМАНИЕ: Воздействие изофлурана опасно для здоровья человека; Используйте одобренный и проверенный испаритель изофлурана в хорошо проветриваемом помещении со средствами очистки отходящих газов.
   2. Как только рефлекс на пальцах ног отсутствует, побрейте голову животного. Нанесите смазку для глаз.
   3. Поместите мышь на рабочую поверхность головой в носовой конус для поддержания анестезии.
   4. Вводите обезболивающее средство, такое как бупренорфин (0,6-0,8 мг/кг массы тела мыши, подкожно), в соответствии с указаниями врача.
   5. Очистите место укола, протерев голову стерильной марлей, смоченной в растворе йода (выполните три скраба), а затем протрите спиртовой салфеткой (выполните трижды).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите шерсть и очистите кожу вокруг места инъекции и используйте стерильные инструменты и иглы, как рекомендовано Американской ветеринарной медицинской ассоциацией для предотвращения инфекций.
4. Крепко возьмитесь за голову мыши недоминантной рукой. Расположите головку как можно ровнее на рабочей поверхности.
5. Найдите место инъекции.
   1. С помощью подготовленной острой иглы 18 G сначала определите брегму; Для этого проведите иглой по коже головы по средней линии, двигаясь в рострально-каудальной плоскости. Представьте себе равносторонний треугольник, в котором две вершины являются глазами, а третья вершина — приблизительным расположением брегмы (см. рис. 1C).
   2. От брегмы переместите иглу на 2 мм латерально и на 1 мм каудально к месту инъекции.
6. Держа иглу вертикально, с силой протолкните иглу через кожу и кость, пока трубка не окажется на одном уровне с кожей.
7. Втяните иглу, поверните иглу и снова надавите на кожу и кость. Повторяйте процесс до тех пор, пока в кости не образуется небольшое отверстие.
8. Используйте тупую иглу, чтобы убедиться, что в кости образовалось достаточное отверстие. Постарайтесь сделать отверстие в кости, достаточно большое, чтобы тупая игла могла пройти через него.
9. Извлеките мышь из носового конуса, удалите кровь с места инъекции стерильной марлей и поместите мышь в клетку на обогреватель до пробуждения. Поскольку отверстие, сделанное при трепанации черепа, небольшое (игла 18 G), место не нужно закрывать швом или зажимами для раны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие здесь небольшое (18 G), поэтому многие учреждения считают эту процедуру инъекцией, а не хирургическим вмешательством. Более того, несмотря на то, что через кожу и кости делается отверстие в мозг, натягивание кожи приводит к тому, что отверстия не совпадают, что, вероятно, помогает предотвратить контакт кожной флоры или подстилки клетки с мозгом.

2. Впрыск

1. Подготовьте материалы для инъекции, как описано ниже.
   1. Положите на рабочую поверхность чистую накладку или драпировочный материал. Прикрепите носовой обтекатель испарителя изофлурана к рабочей поверхности (близко к экспериментатору, но в противоположную сторону; см. рисунок 1А).
   2. Прикрепите иглу длиной 10 мм 27 G со скосом 45° к стеклянному шприцу объемом 5 мкл. Наденьте на иглу силастическую трубку так, чтобы выступало 3,5 мм кончика иглы; используйте лабораторную ленту, чтобы прикрепить трубку к корпусу шприца (см. рисунок 1D).
   3. Подготовьте среду для инъекций (лекарство, вирус или другую жидкость для инъекций) в пробирке. Для получения репрезентативных результатов в этом исследовании вводили стерильный изотонический физиологический раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите пробирку, к которой можно получить доступ с помощью стеклянного шприца и иглы, например, пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл.
   4. Наберите 3 мкл среды для инъекций в стеклянный шприц. Сначала наберите больше, чем нужно, и выталкивайте до тех пор, пока в шприце не останется 3 мкл.
   5. Соберите йодный скраб, стерильную марлю и спиртовые салфетки для подготовки места инъекции.
   6. Запустите лабораторный таймер в режиме обратного отсчета и разместите таймер так, чтобы он был виден экспериментатору во время выполнения инъекций.
   7. Потренируйтесь перемещать иглу на 2 мм в сторону и на 1 мм в хвост, как это делалось накануне.
2. Подготовьте мышь к инъекции, как описано ниже.
   1. Поместите мышь в индукционную камеру и обезболивайте мышь изофлураном. Как только рефлекс пальцев ног исчезнет, нанесите смазку для глаз и поместите мышь на рабочую поверхность головой в носовом конусе.
   2. Очистите место укола тремя салфетками от йода и спирта. Определите место инъекции иглой 18 G (или затупленной иглой), как описано в шаге 1.8. Отверстие, созданное во время трепанации черепа, должно быть обнаруживаемым.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если трепанация черепа не была выполнена заранее, или если отверстие в черепе не обнаруживается, трепанация черепа может быть выполнена здесь.
3. Выполните инъекцию стеклянным шприцем, как описано ниже.
   1. Крепко возьмитесь за голову мыши недоминантной рукой. Расположите головку как можно ровнее на рабочей поверхности.
   2. Поместите иглу стеклянного шприца в отверстие в черепе до тех пор, пока трубка, помещенная над иглой, подготовленной на шаге 2.1.2, не упрется в кожу мыши.
   3. Держите шприц как можно вертикальнее, обращая внимание как на корональную, так и на сагиттальную плоскости. Медленно вводите среду в течение 1 минуты.
   4. Подержите шприц и иглу на месте еще минуту после завершения инъекции, чтобы свести к минимуму обратный поток. Медленно отведите иглу от головки мыши.
   5. Извлеките мышь из носового конуса, удалите кровь из места инъекции стерильной марлей (если она присутствует) и поместите мышь в клетку на обогреватель клетки до тех пор, пока она не проснется.

3. Подтверждение места инъекции

1. Глубоко обезболивайте и перфузируйте мышь физиологическим раствором и 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS), как описано ранее⁸. Храните мозг в 30% сахарозе в PBS при температуре 4 °C до тех пор, пока мозг не опустится (обычно 2 дня).
2. Вырежьте корональные срезы 20-50 мкм на криостате, как описано ранее⁹. Во время секционирования наблюдайте за инъекционным трактом в тканевом блоке. Запишите, четко ли инжекционный тракт пересекает боковой желудочек.

Результаты

При успешном выполнении этот метод позволяет быстро доставить экспериментальный агент в желудочковую систему. На рисунке 2А показан профиль пульса лютеинизирующего гормона (ЛГ) у овариэктомированной мыши, получившей инъекцию ICV в виде 3 мкл стерильного изотонического ?...

Обсуждение

Здесь описано простое и эффективное средство для проведения инъекций ICV мышам. Поскольку этот метод не требует стереотаксической рамки, такой подход к централизованной доставке лекарств и экспериментальных агентов доступен большему количеству исследователей. Кроме того, этот подход ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge blunt needles	SAI Infusion	B18-150
18-gauge needles	BD Medical	305195
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-363-750
Bench pad	Fisher Scientific	14-206-62AC22
Betadine solution	Fisher Scientific	NC1696484
Buprenorphine	Patterson Vet Supply	07-892-5235	Controlled substance
Eyelube	Fisher Scientific	50-218-8442
Glass syringe	Hamilton	7634-01
Injection needle	Hamilton	7803-01	27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane	Patterson Vet Supply	07-893-8441
Isoflurane vaporizer	Vet Equip	V-10
Laboratory Tape	VWR	89098-128
Medical grade oxygen	Airgas	OX USPEA
Paraformaldehyde	Millipore-Sigma	8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	J67802.K2
PulsaR Software	Open source, University of Otago		See ref 9
Ruler	Fisher Scientific	12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.)	DOW	508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.)	DOW	508-009
Sterile saline	VWR	101320-574
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500