Intrazerebroventrikuläre Freihandinjektionen bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier wird ein einfacher und schneller Ansatz zur Durchführung von intrazerebroventrikulären Injektionen bei Mäusen unter Verwendung eines Freihandansatzes (d.h. ohne stereotaktische Vorrichtung) beschrieben.

Zusammenfassung

Die Untersuchung neuroendokriner Systeme erfordert oft die Verabreichung von Medikamenten, Viren oder anderen experimentellen Wirkstoffen direkt in das Gehirn von Mäusen. Eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion ermöglicht die großflächige Verabreichung des experimentellen Wirkstoffs im gesamten Gehirn (insbesondere in den Strukturen in der Nähe der Ventrikel). Hier werden Methoden zur Freihand-ICV-Injektion bei erwachsenen Mäusen beschrieben. Durch visuelle und taktile Landmarken auf den Köpfen von Mäusen können Injektionen in die Seitenventrikel schnell und zuverlässig durchgeführt werden. Die Injektionen werden mit einer Glasspritze durchgeführt, die in der Hand des Versuchsleiters gehalten und in ungefährem Abstand zu den Landmarken platziert wird. Somit benötigt diese Technik keinen stereotaktischen Rahmen. Darüber hinaus erfordert diese Technik nur eine kurze Isofluran-Anästhesie, die eine anschließende Beurteilung des Verhaltens und/oder der Physiologie von Mäusen bei wachen, sich frei verhaltenden Mäusen ermöglicht. Die Freihand-ICV-Injektion ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die effiziente Verabreichung experimenteller Wirkstoffe in das Gehirn lebender Mäuse und kann mit anderen Techniken wie häufigen Blutentnahmen, neuronalen Schaltkreismanipulationen oder In-vivo-Aufzeichnungen kombiniert werden, um neuroendokrine Prozesse zu untersuchen.

Einleitung

Die Abgabe von experimentellen Wirkstoffen wie Medikamenten¹, Viren² oder Zellen³ an das Gehirn ist für die neuroendokrine Forschung oft notwendig. Wenn der Wirkstoff die Blut-Hirn-Schranke nicht ohne weiteres überwindet oder das experimentelle Ziel darin besteht, die zentralen Wirkungen des Wirkstoffs gezielt zu testen, ist es wichtig, eine zuverlässige Methode für die Verabreichung von Injektionen in das Gehirn zu haben. Darüber hinaus bietet die Injektion in den intrazerebroventrikulären Raum (ICV) die Möglichkeit, den Wirkstoff weit im Gehirn zu verteilen und bietet eine große Zielfläche, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Injektion erhöht^{wird 2}.

Eine gängige Methode zur Herstellung von ICV-Injektionen ist das Einsetzen einer permanenten Verweilkanüle. Bei diesem Ansatz ist ein stereotaktischer Rahmen notwendig, um die handelsübliche oder individuell angefertigte Kanüle zu positionieren, da die Kanüle geklebt oder zementiert wird. Oft wird nach der Genesung eine supraphysiologische Dosis Angiotensin II über die Kanüle verabreicht, und wenn das Trinkverhalten sofort beobachtet wird, gilt die Kanüle als korrekt platziert⁴. Dieser Ansatz hat viele Vorteile, darunter die Möglichkeit, eine Langzeitinfusion durchzuführen und dasselbe Tier mehrmals zu injizieren. Darüber hinaus kann bei Verwendung von Angiotensin II die korrekte Platzierung vor der Verabreichung von experimentellen Verbindungen bestätigt werden. Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei der Platzierung einer permanenten Kanüle, einschließlich der Notwendigkeit einer teuren Ausrüstung (stereotaktischer Rahmen), der Möglichkeit einer Beschädigung der Kanüle nach dem Einsetzen (z. B. können Mäuse auf der Kanüle eines Käfiggefährten kauen) und der Möglichkeit von Infektionen um die permanente Kanüle herum. Einzelne ICV-Injektionen können unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmens³ durchgeführt werden, der zwar wirksam ist, jedoch eine erhebliche Exposition gegenüber Anästhesie erfordert und daher einige akute physiologische und verhaltensbezogene Wirkungen der Behandlung verschleiern kann. Darüber hinaus erfordert die Platzierung von Mäusen in einem stereotaktischen Rahmen ein erhebliches Training, um eine stabile Platzierung zu erreichen und das Reißen der Gehörgänge zu verhindern.

Hier wird eine etablierte Methode zur Herstellung von Freihandinjektionen bei Mäusen beschrieben. Diese Methode basiert auf früheren Berichten ^5,6. Die Vorteile dieser Technik sind, dass sie einfach und schnell ist und keine spezielle Ausrüstung wie einen stereotaktischen Rahmen erfordert. Wie unten beschrieben, beinhaltet dieses Verfahren die Manipulation einer Glasspritze in Bezug auf Landmarken auf dem Mauskopf, um die Injektionen durchzuführen, was schnell durchgeführt werden kann und daher nur wenige Minuten Gasanästhesie am Versuchstag erfordert.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Colorado State University (#3960) und der University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees genehmigt, wo die repräsentativen Daten erhoben wurden (S13235, PI Kellie Breen Church). Die Daten von fünf erwachsenen weiblichen und zwei erwachsenen männlichen C57/BL6-Mäusen (9-16 Wochen alt) sind im Abschnitt "Repräsentative Daten" dargestellt. Weibliche Mäuse wurden 3-4 Wochen vor der ICV-Injektion und der Blutentnahme ovariektomiert, wie zuvor beschrieben⁷. Vor den Experimenten wurden diese Mäuse mit einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkellichtzyklus gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren.

1. Durchführung einer Kraniotomie

HINWEIS: Die Kraniotomie kann einen oder mehrere Tage vor der eigentlichen Injektion durchgeführt werden, wodurch der Injektionsprozess am Tag des Experiments beschleunigt wird.

1. Bereiten Sie die Materialien für die Kraniotomie wie unten beschrieben vor.
   1. Legen Sie eine saubere Bankunterlage oder ein Abdeckmaterial auf die Arbeitsfläche. Klebe den Nasenkonus eines Isofluran-Vaporizers auf die Arbeitsfläche (in der Nähe des Experimentators, aber von ihm abgewandt; siehe Abbildung 1A).
   2. Legen Sie den Silastikschlauch auf das Ende einer sterilen, scharfen 18-G-Nadel, so dass ~1 mm der Nadelspitze herausragt. Legen Sie einen Silastikschlauch auf das Ende einer sterilen stumpfen Nadel, so dass ~1 mm der Nadelspitze herausragt.
      HINWEIS: Für jede Maus sollten separate und sterile, vorverpackte Nadeln (scharf und stumpf) verwendet werden.
   3. Besorge dir einen elektrischen Rasierer, ein Jodpeeling, sterile Gaze und Alkoholpads, um die Injektionsstelle vorzubereiten.
2. Üben Sie, eine Nadel 2 mm seitlich und 1 mm kaudal zu bewegen, wie unten beschrieben.
   1. Markieren Sie mit einem Lineal und einem Stift ein Blatt Papier mit einem Startpunkt (dies ist Bregma), einer Markierung 2 mm links oder rechts und einer weiteren Markierung 1 mm über der letzten Markierung (dies ist die Injektionsstelle; siehe Abbildung 1B).
   2. Üben Sie, die Nadel vom Startpunkt über den Markierungspunkt 1 bis zum Markierungspunkt 2 (Bregma bis zur Injektionsstelle) zu bewegen, bis Sie sicher sind, dass die Bewegung ohne Führungen wiederholbar ist.
      HINWEIS: Die hier beschriebenen Koordinaten sind bei erwachsenen C57/BL6-Mäusen wirksam, aber andere Stämme oder Altersgruppen müssen möglicherweise angepasst werden.
3. Bereiten Sie die Maus wie unten beschrieben auf die Kraniotomie vor.
   1. Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 3%-4% Isofluran in medizinischem Sauerstoff. Reduzieren Sie mit Übung und Vertrautheit mit dem Verfahren die Gesamtdauer der Isofluran-Exposition auf weniger als 10 Minuten für das Kraniotomieverfahren.
      VORSICHT: Die Exposition gegenüber Isofluran ist gefährlich für die menschliche Gesundheit; Verwenden Sie einen zugelassenen und geprüften Isofluran-Verdampfer in einem gut belüfteten Bereich mit Mitteln zum Absaugen von Abgasen.
   2. Sobald der Zehenreflex fehlt, rasieren Sie den Kopf des Tieres. Tragen Sie Gleitmittel für die Augen auf.
   3. Legen Sie die Maus mit dem Kopf im Nasenkonus auf die Arbeitsfläche, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
   4. Verabreichen Sie ein Analgetikum wie Buprenorphin (0,6-0,8 mg/kg Körpergewicht der Maus, subkutan), wie vom Lieferanten angegeben.
   5. Reinigen Sie die Injektionsstelle, indem Sie den Kopf mit steriler Gaze abwischen, die in eine Jodlösung getaucht ist (drei Peelings durchführen) und dann mit einem Alkohol-Peeling-Pad abwischen (dreimal durchführen).
      HINWEIS: Entfernen Sie das Fell und reinigen Sie die Haut um die Injektionsstelle herum und verwenden Sie sterile Instrumente und Nadeln, wie von der American Veterinary Medical Association empfohlen, um Infektionen zu vermeiden.
4. Halten Sie den Kopf der Maus mit der nicht dominanten Hand fest. Positionieren Sie den Kopf so flach wie möglich auf der Arbeitsfläche.
5. Lokalisieren Sie die Injektionsstelle.
   1. Verwenden Sie die vorbereitete scharfe 18-G-Nadel, um zunächst Bregma zu identifizieren; Ziehen Sie dazu die Nadel entlang der Mittellinie über die Haut des Kopfes und bewegen Sie sich dabei in der rostral-kaudalen Ebene. Stellen Sie sich ein gleichseitiges Dreieck vor, in dem die beiden Eckpunkte die Augen und der dritte Scheitelpunkt die ungefähre Position des Bregmas darstellt (siehe Abbildung 1C).
   2. Bewegen Sie die Nadel von Bregma aus 2 mm lateral und 1 mm kaudal zur Injektionsstelle.
6. Während Sie die Nadel senkrecht halten, stoßen Sie die Nadel fest durch Haut und Knochen, bis der Schlauch bündig mit der Haut abschließt.
7. Ziehen Sie die Nadel zurück, drehen Sie die Nadel und drücken Sie erneut durch Haut und Knochen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis ein kleines Loch im Knochen entsteht.
8. Prüfen Sie mit der stumpfen Nadel, ob ein ausreichendes Loch in den Knochen gebohrt wurde. Versuchen Sie, eine Öffnung in den Knochen zu machen, die groß genug ist, damit die stumpfe Nadel hindurchgehen kann.
9. Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel, entfernen Sie jegliches Blut von der Injektionsstelle mit steriler Gaze und legen Sie die Maus in einen Käfig auf einen Käfigwärmer, bis sie wach ist. Da die durch die Kraniotomie entstandene Öffnung klein ist (18-G-Nadel), muss die Stelle nicht mit einer Naht oder Wundclips verschlossen werden.
   HINWEIS: Die hier erzeugte Öffnung ist klein (18 G), so dass viele Institutionen dieses Verfahren als Injektion und nicht als Operation betrachten. Obwohl eine Öffnung durch Haut und Knochen zum Gehirn gemacht wird, führt das Anspannen der Haut dazu, dass die Löcher nicht ausgerichtet sind, was wahrscheinlich dazu beiträgt, dass die Hautflora oder die Käfigeinstreu nicht mit dem Gehirn in Kontakt kommt.

2. Durchführung der Injektion

1. Bereiten Sie die Materialien für die Injektion wie unten beschrieben vor.
   1. Legen Sie eine saubere Bankunterlage oder ein Abdeckmaterial auf die Arbeitsfläche. Klebe den Nasenkonus eines Isofluran-Vaporizers auf die Arbeitsfläche (in der Nähe des Experimentators, aber von ihm abgewandt; siehe Abbildung 1A).
   2. Befestigen Sie eine 10 mm lange 27-G-Nadel mit einer 45°-Abschrägung auf einer 5-μl-Glasspritze. Legen Sie den Silastikschlauch so auf die Nadel, dass 3,5 mm der Nadelspitze herausragen; Verwenden Sie Laborklebeband, um den Schlauch am Spritzenkörper zu befestigen (siehe Abbildung 1D).
   3. Bereiten Sie das Injektionsmedium (Medikament, Virus oder andere Injektionsflüssigkeit) in einem Röhrchen vor. Für die repräsentativen Ergebnisse in dieser Studie wurde sterile isotonische Kochsalzlösung injiziert.
      HINWEIS: Wählen Sie ein Röhrchen, das den Zugang durch die Glasspritze und die Nadel ermöglicht, z. B. ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   4. Ziehen Sie 3 μl Injektionsmedium in die Glasspritze. Ziehen Sie zunächst mehr als das gewünschte Volumen und werfen Sie es aus, bis noch 3 μl in der Spritze verbleiben.
   5. Sammeln Sie Jodpeeling, sterile Gaze und Alkoholpads zur Vorbereitung der Injektionsstelle.
   6. Starten Sie einen Labor-Timer im Count-up-Modus und platzieren Sie den Timer so, dass er für den Versuchsleiter sichtbar ist, während er Injektionen vornimmt.
   7. Üben Sie, eine Nadel 2 mm seitlich und 1 mm kaudal zu bewegen, wie sie am Vortag durchgeführt wurde.
2. Bereiten Sie die Maus wie unten beschrieben auf die Injektion vor.
   1. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit Isofluran. Sobald der Zehenreflex fehlt, tragen Sie Augengleitmittel auf und legen Sie die Maus mit dem Kopf im Nasenkonus auf die Arbeitsfläche.
   2. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit je drei Tüchern Jod und Alkohol. Die Injektionsstelle ist mit einer 18-G-Nadel (oder einer stumpfen Nadel) zu identifizieren, wie in Schritt 1.8 beschrieben. Das Loch, das bei der Kraniotomie entsteht, sollte erkennbar sein.
      HINWEIS: Wenn die Kraniotomie nicht im Voraus durchgeführt wurde oder wenn das Loch im Schädel nicht nachweisbar ist, kann die Kraniotomie hier durchgeführt werden.
3. Führen Sie die Injektion mit einer Glasspritze wie unten beschrieben durch.
   1. Halten Sie den Kopf der Maus mit der nicht dominanten Hand fest. Positionieren Sie den Kopf so flach wie möglich auf der Arbeitsfläche.
   2. Die Nadel der Glasspritze wird durch das Loch im Schädel gestochen, bis der Schlauch, der über die in Schritt 2.1.2 vorbereitete Nadel gelegt wurde, auf der Haut der Maus aufliegt.
   3. Halten Sie die Spritze so senkrecht wie möglich und achten Sie dabei sowohl auf die koronale als auch auf die sagittale Ebene. Injizieren Sie das Medium langsam über einen Zeitraum von 1 Minute.
   4. Halten Sie die Spritze und die Nadel nach Abschluss der Injektion für eine weitere Minute an Ort und Stelle, um den Rückfluss zu minimieren. Ziehen Sie die Nadel langsam vom Kopf der Maus zurück.
   5. Entfernen Sie die Maus aus dem Nasenkegel, entfernen Sie jegliches Blut von der Injektionsstelle mit steriler Gaze (falls vorhanden) und legen Sie die Maus in einen Käfig auf einen Käfigwärmer, bis sie wach ist.

3. Bestätigung der Injektionsstelle

1. Die Maus wird wie zuvor beschrieben mit Kochsalzlösung und 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gründlich betäubt und perfundiert⁸. Lagern Sie das Gehirn in 30%iger Saccharose in PBS bei 4 °C, bis das Gehirn absinkt (typischerweise 2 Tage).
2. Schneiden Sie 20-50 μm koronale Schnitte auf einem Kryostaten, wie zuvor beschrieben⁹. Beobachten Sie beim Schneiden den Injektionstrakt im Gewebeblock. Erfassen Sie, ob der Injektionstrakt den Seitenventrikel deutlich schneidet.

Ergebnisse

Wenn diese Technik erfolgreich durchgeführt wird, ermöglicht sie die schnelle Verabreichung eines experimentellen Wirkstoffs in das ventrikuläre System. Ein luteinisierendes Hormon (LH)-Pulsprofil einer ovariektomierten Maus, die eine ICV-Injektion von 3 μl steriler isotonischer Kochsalzlösung, dem Vehikel für viele pharmakologische Verbindungen, erhielt, ist in Abbildung 2A dargestellt. Dieses Beispiel zeigt, dass eine kurze Gasanästhesie und die Injektion von 3 μl Flüssigkeit in d...

Diskussion

Hier wird ein einfaches und effektives Mittel zur Herstellung von ICV-Injektionen bei Mäusen beschrieben. Da diese Technik keinen stereotaktischen Rahmen benötigt, ist dieser Ansatz für die zentrale Verabreichung von Medikamenten und experimentellen Wirkstoffen für mehr Forscher zugänglich. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz einen relativ hohen Durchsatz, da das Präparations- und Injektionsverfahren schnell durchgeführt werden kann.

Da dieses Verfahren die Handhabung von Nadeln und ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge blunt needles	SAI Infusion	B18-150
18-gauge needles	BD Medical	305195
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-363-750
Bench pad	Fisher Scientific	14-206-62AC22
Betadine solution	Fisher Scientific	NC1696484
Buprenorphine	Patterson Vet Supply	07-892-5235	Controlled substance
Eyelube	Fisher Scientific	50-218-8442
Glass syringe	Hamilton	7634-01
Injection needle	Hamilton	7803-01	27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane	Patterson Vet Supply	07-893-8441
Isoflurane vaporizer	Vet Equip	V-10
Laboratory Tape	VWR	89098-128
Medical grade oxygen	Airgas	OX USPEA
Paraformaldehyde	Millipore-Sigma	8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	J67802.K2
PulsaR Software	Open source, University of Otago		See ref 9
Ruler	Fisher Scientific	12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.)	DOW	508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.)	DOW	508-009
Sterile saline	VWR	101320-574
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500