Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi

Riepilogo

Qui viene descritto un approccio semplice e rapido per l'esecuzione di iniezioni intracerebroventricolari nei topi utilizzando un approccio a mano libera (cioè senza un dispositivo stereotassico).

Abstract

Lo studio dei sistemi neuroendocrini richiede spesso la somministrazione di farmaci, virus o altri agenti sperimentali direttamente nel cervello dei topi. Un'iniezione intracerebroventricolare (ICV) consente la somministrazione diffusa dell'agente sperimentale in tutto il cervello (in particolare nelle strutture vicino ai ventricoli). Qui vengono descritti i metodi per effettuare iniezioni ICV a mano libera in topi adulti. Utilizzando punti di riferimento visivi e tattili sulle teste dei topi, le iniezioni nei ventricoli laterali possono essere effettuate in modo rapido e affidabile. Le iniezioni vengono effettuate con una siringa di vetro tenuta in mano dallo sperimentatore e posta a distanze approssimative dai punti di riferimento. Pertanto, questa tecnica non richiede un frame stereotassico. Inoltre, questa tecnica richiede solo una breve anestesia con isoflurano, che consente la successiva valutazione del comportamento e/o della fisiologia del topo in topi svegli e che si comportano liberamente. L'iniezione ICV a mano libera è un potente strumento per la somministrazione efficiente di agenti sperimentali nel cervello di topi viventi e può essere combinata con altre tecniche come il prelievo frequente di sangue, la manipolazione dei circuiti neurali o la registrazione in vivo per studiare i processi neuroendocrini.

Introduzione

La somministrazione di agenti sperimentali, come i farmaci¹, i virus² o le cellule³, al cervello è spesso necessaria per la ricerca neuroendocrina. Se l'agente non attraversa facilmente la barriera emato-encefalica o l'obiettivo sperimentale è quello di testare in modo specifico gli effetti centrali dell'agente, è importante disporre di un metodo affidabile per somministrare iniezioni nel cervello. Inoltre, l'iniezione nello spazio intracerebroventricolare (ICV) offre l'opportunità di distribuire ampiamente l'agente nel cervello e fornisce un'ampia area bersaglio, aumentando così la probabilità di successo dell'iniezione².

Un metodo comune per effettuare iniezioni di ICV prevede il posizionamento di una cannula permanente a permanenza. In questo approccio, è necessario un telaio stereotassico per posizionare la cannula disponibile in commercio o su misura, poiché la cannula viene incollata o cementata in posizione. Spesso, al momento del recupero, viene somministrata una dose sovrafisiologica di angiotensina II attraverso la cannula e, se si osserva immediatamente il comportamento del bere, la cannula viene considerata posizionata correttamente⁴. Questo approccio presenta molti vantaggi, tra cui la possibilità di eseguire un'infusione a lungo termine e la possibilità di iniettare più volte lo stesso animale; inoltre, se viene impiegata l'angiotensina II, il corretto posizionamento può essere confermato prima della somministrazione di composti sperimentali. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni al posizionamento di una cannula permanente, tra cui la necessità di attrezzature costose (telaio stereotassico), la possibilità di danni alla cannula dopo il posizionamento (ad esempio, i topi possono masticare la cannula di un compagno di gabbia) e la possibilità di infezioni intorno alla cannula permanente. Le iniezioni singole di ICV possono essere effettuate con l'uso di un frame^{stereotassico 3}, che, sebbene efficace, richiede una sostanziale esposizione all'anestesia e, quindi, può oscurare alcuni effetti fisiologici e comportamentali acuti del trattamento. Inoltre, il posizionamento dei topi in un telaio stereotassico richiede una formazione sostanziale per ottenere un posizionamento stabile e prevenire la rottura dei condotti uditivi.

Qui viene descritto un metodo consolidato per effettuare iniezioni a mano libera nei topi. Questo metodo si basa sulle precedenti relazioni ^5,6. I vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, rapida e non richiede attrezzature specializzate come un telaio stereotassico. Come descritto di seguito, questa procedura prevede la manipolazione di una siringa di vetro rispetto ai punti di riferimento sulla testa del topo per effettuare le iniezioni, che possono essere eseguite rapidamente e, quindi, richiedono solo pochi minuti di anestesia gassosa il giorno dell'esperimento.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dalla Colorado State University (#3960) e dall'Università della California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees, dove sono stati raccolti i dati rappresentativi (S13235, PI Kellie Breen Church). I dati di cinque topi C57/BL6 femmine adulte e due maschi adulti (9-16 settimane) sono illustrati nella sezione dei dati rappresentativi. I topi femmina sono stati ovariectomizzati 3-4 settimane prima dell'iniezione di ICV e della raccolta del sangue come descritto in precedenza⁷. Prima della sperimentazione, questi topi sono stati alloggiati con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di luce scura e hanno avuto libero accesso al mangime e all'acqua in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Esecuzione della craniotomia

NOTA: La craniotomia può essere eseguita uno o più giorni prima dell'iniezione vera e propria, il che rende il processo di iniezione più rapido il giorno dell'esperimento.

1. Preparare i materiali per la craniotomia come descritto di seguito.
   1. Posizionare un tappetino da banco pulito o un telo sul piano di lavoro. Fissare con del nastro adesivo l'ogiva di un vaporizzatore all'isoflurano sulla superficie di lavoro (vicino allo sperimentatore, ma rivolto in direzione opposta; vedere la Figura 1A).
   2. Posizionare il tubo silattico all'estremità di un ago sterile affilato da 18 G in modo che sporga ~1 mm della punta dell'ago. Posizionare il tubo silastico all'estremità di un ago sterile smussato in modo che sporga ~1 mm della punta dell'ago.
      NOTA: Per ogni topo devono essere utilizzati aghi preconfezionati separati e sterili (affilati e smussati).
   3. Procurati un rasoio elettrico, uno scrub allo iodio, una garza sterile e dei tamponi imbevuti di alcol per preparare il sito di iniezione.
2. Esercitati a muovere un ago di 2 mm lateralmente e 1 mm caudale come descritto di seguito.
   1. Utilizzare un righello e una penna per segnare un foglio di carta con un punto di partenza (questo sarà bregma), un segno di 2 mm a sinistra o a destra e un altro segno di 1 mm sopra l'ultimo (questo sarà il sito di iniezione; vedere la Figura 1B).
   2. Esercitarsi a spostare l'ago dal punto di partenza al punto 1 al punto 2 (dal bregma al sito di iniezione) fino a quando non si è sicuri che il movimento sia ripetibile senza guide.
      NOTA: Le coordinate qui descritte sono efficaci nei topi adulti C57/BL6, ma altri ceppi o gruppi di età potrebbero richiedere un aggiustamento.
3. Preparare il topo per la craniotomia come descritto di seguito.
   1. Metti il topo in una camera di induzione e anestetizza il topo con isoflurano al 3%-4% in ossigeno di grado medico. Con la pratica e la familiarità con la procedura, ridurre la durata totale dell'esposizione all'isoflurano a meno di 10 minuti per la procedura di craniotomia.
      ATTENZIONE: L'esposizione all'isoflurano è pericolosa per la salute umana; Utilizzare un vaporizzatore per isoflurano approvato e ispezionato in un'area ben ventilata con mezzi di evacuazione dei gas di scarico.
   2. Una volta che il riflesso delle dita dei piedi è assente, radere la testa dell'animale. Applicare il lubrificante per gli occhi.
   3. Posizionare il mouse sul piano di lavoro con la testa nell'ogiva nasale per mantenere l'anestesia.
   4. Somministrare un agente analgesico, come la buprenorfina (0,6-0,8 mg/kg di peso corporeo del topo, per via sottocutanea), come indicato dal fornitore.
   5. Pulire il sito di iniezione strofinando la testina con una garza sterile imbevuta di una soluzione di iodio (eseguire tre scrub), quindi strofinare con un tampone scrub imbevuto di alcol (eseguire tre volte).
      NOTA: Rimuovere il pelo e pulire la pelle intorno al sito di iniezione e utilizzare strumenti e aghi sterili, come raccomandato dall'American Veterinary Medical Association per prevenire le infezioni.
4. Tenere saldamente la testa del mouse con la mano non dominante. Posizionare la testa il più possibile piatta sul piano di lavoro.
5. Individuare il sito dell'iniezione.
   1. Utilizzare l'ago affilato da 18 G preparato per identificare prima il bregma; Per questo, trascina l'ago sulla pelle della testa lungo la linea mediana, muovendoti sul piano rostrale-caudale. Immaginiamo un triangolo equilatero in cui i due vertici sono gli occhi e il terzo vertice è la posizione approssimativa di bregma (vedi Figura 1C).
   2. Da bregma, spostare l'ago di 2 mm lateralmente e 1 mm caudale nel sito di iniezione.
6. Tenendo l'ago in verticale, spingere con decisione l'ago attraverso la pelle e l'osso fino a quando il tubo non è a filo con la pelle.
7. Ritrarre l'ago, ruotare l'ago e premere nuovamente attraverso la pelle e l'osso. Ripeti il processo fino a creare un piccolo foro nell'osso.
8. Utilizzare l'ago smussato per verificare che sia stato prodotto un foro sufficiente nell'osso. Cerca di creare un'apertura nell'osso abbastanza grande da consentire il passaggio dell'ago smussato.
9. Rimuovere il topo dall'ogiva nasale, pulire il sangue dal sito di iniezione con una garza sterile e posizionare il topo in una gabbia su uno scaldagabbia fino al risveglio. Poiché l'apertura praticata dalla craniotomia è piccola (ago da 18 G), il sito non ha bisogno di essere chiuso con una sutura o clip per ferite.
   NOTA: L'apertura qui prodotta è piccola (18 G), quindi molte istituzioni considerano questa procedura un'iniezione piuttosto che un intervento chirurgico. Inoltre, sebbene venga praticata un'apertura attraverso la pelle e l'osso verso il cervello, tenere la pelle tesa fa sì che i fori non si allineino, il che probabilmente aiuta a prevenire il contatto della flora cutanea o della lettiera della gabbia con il cervello.

2. Effettuare l'iniezione

1. Preparare i materiali per l'iniezione come descritto di seguito.
   1. Posizionare un tappetino da banco pulito o un telo sul piano di lavoro. Fissare con del nastro adesivo l'ogiva di un vaporizzatore all'isoflurano sulla superficie di lavoro (vicino allo sperimentatore, ma rivolto in direzione opposta; vedere la Figura 1A).
   2. Applicare un ago da 27 G lungo 10 mm con uno smusso di 45° su una siringa di vetro da 5 μL. Posizionare il tubo silattico sull'ago in modo che sporgano 3,5 mm della punta dell'ago; utilizzare del nastro da laboratorio per fissare il tubo al corpo della siringa (vedere la Figura 1D).
   3. Preparare il mezzo di iniezione (farmaco, virus o altro liquido per l'iniezione) in un tubo. Per i risultati rappresentativi di questo studio, è stata iniettata soluzione salina isotonica sterile.
      NOTA: Selezionare una provetta che consenta l'accesso dalla siringa di vetro e dall'ago, ad esempio una provetta per microcentrifuga da 2 ml.
   4. Prelevare 3 μL di terreno di iniezione nella siringa di vetro. Innanzitutto, prelevare più del volume desiderato ed espellere fino a quando nella siringa rimangono 3 μL.
   5. Raccogli scrub allo iodio, garza sterile e tamponi imbevuti di alcol per preparare il sito di iniezione.
   6. Avviare un timer da laboratorio in modalità conto alla rovescia e posizionare il timer in modo che sia visibile allo sperimentatore durante le iniezioni.
   7. Esercitati a muovere un ago di 2 mm lateralmente e 1 mm caudale come eseguito il giorno precedente.
2. Preparare il topo per l'iniezione come descritto di seguito.
   1. Posizionare il topo nella camera di induzione e anestetizzare il topo con isoflurano. Una volta che il riflesso della punta è assente, applicare del lubrificante per gli occhi e posizionare il mouse sul piano di lavoro con la testa nell'ogiva del naso.
   2. Pulire il sito di iniezione con tre salviette di iodio e alcol ciascuna. Identificare il sito di iniezione con un ago da 18 G (o un ago smussato) come descritto al punto 1.8. Il foro creato durante la craniotomia dovrebbe essere rilevabile.
      NOTA: Se la craniotomia non è stata eseguita in anticipo, o se il foro nel cranio non è rilevabile, la craniotomia può essere eseguita qui.
3. Eseguire l'iniezione con una siringa di vetro come descritto di seguito.
   1. Tenere saldamente la testa del mouse con la mano non dominante. Posizionare la testa il più possibile piatta sul piano di lavoro.
   2. Inserire l'ago della siringa di vetro attraverso il foro del cranio fino a quando il tubo posto sopra l'ago preparato al punto 2.1.2 non poggia sulla pelle del topo.
   3. Tenere la siringa il più verticalmente possibile, prestando attenzione sia al piano coronale che a quello sagittale. Iniettare lentamente il terreno per un periodo di 1 minuto.
   4. Tenere la siringa e l'ago in posizione per un altro minuto dopo il completamento dell'iniezione per ridurre al minimo il riflusso. Ritrarre lentamente l'ago dalla testa del mouse.
   5. Rimuovere il topo dall'ogiva nasale, pulire il sangue dal sito di iniezione con una garza sterile (se presente) e posizionare il topo in una gabbia su uno scaldagabbia fino al risveglio.

3. Conferma della posizione di iniezione

1. Anestetizzare in profondità e perfondere il topo con soluzione fisiologica e paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come descritto in precedenza⁸. Conservare il cervello in saccarosio al 30% in PBS a 4 °C fino a quando il cervello non affonda (in genere 2 giorni).
2. Tagliare sezioni coronali di 20-50 μm su un criostato come descritto in precedenza⁹. Durante il sezionamento, osservare il tratto di iniezione nel blocco di tessuto. Registrare se il tratto di iniezione interseca chiaramente il ventricolo laterale.

Risultati

Se eseguita con successo, questa tecnica consente la rapida somministrazione di un agente sperimentale nel sistema ventricolare. Un profilo di impulso dell'ormone luteinizzante (LH) da un topo ovariectomizzato che ha ricevuto un'iniezione ICV di 3 μL di soluzione salina isotonica sterile, il veicolo di molti composti farmacologici, è mostrato nella Figura 2A. Questo esempio dimostra che una breve esposizione all'anestesia gassosa e l'iniezione di 3 μL di liquido nel sistema ventricolare d...

Discussione

Qui viene descritto un mezzo semplice ed efficace per effettuare iniezioni di ICV nei topi. Poiché questa tecnica non richiede una struttura stereotassica, questo approccio per la somministrazione centralizzata di farmaci e agenti sperimentali è accessibile a un maggior numero di ricercatori. Inoltre, questo approccio ha una produttività relativamente elevata poiché la procedura di preparazione e iniezione può essere eseguita rapidamente.

Poiché questa procedura richiede la manipolazione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge blunt needles	SAI Infusion	B18-150
18-gauge needles	BD Medical	305195
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-363-750
Bench pad	Fisher Scientific	14-206-62AC22
Betadine solution	Fisher Scientific	NC1696484
Buprenorphine	Patterson Vet Supply	07-892-5235	Controlled substance
Eyelube	Fisher Scientific	50-218-8442
Glass syringe	Hamilton	7634-01
Injection needle	Hamilton	7803-01	27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane	Patterson Vet Supply	07-893-8441
Isoflurane vaporizer	Vet Equip	V-10
Laboratory Tape	VWR	89098-128
Medical grade oxygen	Airgas	OX USPEA
Paraformaldehyde	Millipore-Sigma	8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	J67802.K2
PulsaR Software	Open source, University of Otago		See ref 9
Ruler	Fisher Scientific	12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.)	DOW	508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.)	DOW	508-009
Sterile saline	VWR	101320-574
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500