Injections intracérébrales intra-ventriculaires à main levée chez la souris

Résumé

Ici, une approche simple et rapide pour effectuer des injections intra-ventriculaires chez la souris en utilisant une approche à main levée (c’est-à-dire sans dispositif stéréotaxique) est décrite.

Résumé

L’étude des systèmes neuroendocriniens nécessite souvent l’administration de médicaments, de virus ou d’autres agents expérimentaux directement dans le cerveau des souris. Une injection intracérébroventriculaire (ICV) permet l’administration généralisée de l’agent expérimental dans tout le cerveau (en particulier dans les structures proches des ventricules). Ici, les méthodes d’injections d’ICV à main levée chez les souris adultes sont décrites. En utilisant des repères visuels et tactiles sur la tête des souris, les injections dans les ventricules latéraux peuvent être effectuées rapidement et de manière fiable. Les injections sont faites à l’aide d’une seringue en verre tenue dans la main de l’expérimentateur et placée à des distances approximatives des points de repère. Ainsi, cette technique ne nécessite pas de trame stéréotaxique. De plus, cette technique ne nécessite qu’une brève anesthésie à l’isoflurane, ce qui permet d’évaluer ultérieurement le comportement et/ou la physiologie de la souris chez des souris éveillées et au comportement libre. L’injection d’ICV à main levée est un outil puissant pour l’administration efficace d’agents expérimentaux dans le cerveau de souris vivantes et peut être combinée avec d’autres techniques telles que des prélèvements sanguins fréquents, la manipulation des circuits neuronaux ou l’enregistrement in vivo pour étudier les processus neuroendocriniens.

Introduction

L’administration d’agents expérimentaux, tels que les médicaments¹, les virus² ou les cellules³, au cerveau est souvent nécessaire pour la recherche neuroendocrinienne. Si l’agent ne traverse pas facilement la barrière hémato-encéphalique ou si l’objectif expérimental est de tester spécifiquement les effets centraux de l’agent, il est important de disposer d’une méthode fiable pour administrer les injections dans le cerveau. De plus, l’injection dans l’espace intra-cérébroventriculaire (ICV) offre la possibilité de distribuer largement l’agent dans le cerveau et fournit une grande zone cible, augmentant ainsi la probabilité de réussite de l’injection².

Une méthode courante pour faire des injections d’ICV implique la mise en place d’une canule à demeure permanente. Dans cette approche, un cadre stéréotaxique est nécessaire pour positionner la canule disponible dans le commerce ou sur mesure, car la canule est collée ou cimentée en place. Souvent, lors de la récupération, une dose supraphysiologique d’angiotensine II est administrée à travers la canule, et si un comportement de consommation d’alcool est immédiatement observé, la canule est considérée comme correctement placée⁴. Cette approche présente de nombreux avantages, notamment la possibilité d’effectuer une perfusion à long terme et la possibilité d’injecter plusieurs fois le même animal ; De plus, si l’angiotensine II est utilisée, la mise en place correcte peut être confirmée avant l’administration de composés expérimentaux. Cependant, il existe certaines limites à la mise en place d’une canule permanente, notamment l’exigence d’un équipement coûteux (cadre stéréotaxique), la possibilité d’endommager la canule après la mise en place (par exemple, les souris peuvent mâcher la canule d’un compagnon de cage) et la possibilité d’infections autour de la canule permanente. Des injections uniques d’ICV peuvent être réalisées à l’aide d’un cadre stéréotaxique³, qui, bien qu’efficace, nécessite une exposition importante à l’anesthésie et, par conséquent, peut masquer certains effets physiologiques et comportementaux aigus du traitement. De plus, le placement de souris dans un cadre stéréotaxique nécessite un entraînement substantiel pour obtenir un placement stable et éviter la rupture des conduits auditifs.

Ici, une méthode établie pour faire des injections à main levée chez la souris est décrite. Cette méthode est basée sur les rapports précédents ^5,6. Les avantages de cette technique sont qu’elle est simple, rapide et ne nécessite pas d’équipement spécialisé tel qu’un cadre stéréotaxique. Comme décrit ci-dessous, cette procédure consiste à manipuler une seringue en verre par rapport à des points de repère sur la tête de la souris pour effectuer les injections, ce qui peut être fait rapidement et, par conséquent, ne nécessite que quelques minutes d’anesthésie gazeuse le jour de l’expérience.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Colorado (#3960) et de l’Université de Californie à San Diego, où les données représentatives ont été recueillies (S13235, PI Kellie Breen Church). Les données de cinq souris femelles adultes et de deux souris mâles adultes C57/BL6 (âgées de 9 à 16 semaines) sont présentées dans la section des données représentatives. Les souris femelles ont été ovariectomisées 3 à 4 semaines avant l’injection d’ICV et le prélèvement sanguin comme décrit précédemment⁷. Avant l’expérimentation, ces souris étaient logées avec un cycle de lumière de 12 h et de lumière sombre de 12 heures et avaient libre accès à de la nourriture et de l’eau conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Réalisation d’une craniotomie

REMARQUE : La craniotomie peut être effectuée un ou plusieurs jours avant l’injection proprement dite, ce qui rend le processus d’injection plus rapide le jour de l’expérience.

1. Préparez le matériel pour la craniotomie comme décrit ci-dessous.
   1. Placez un tampon d’établi propre ou un matériau de drapé sur la surface de travail. Collez le cône de nez d’un vaporisateur d’isoflurane sur la surface de travail (près de l’expérimentateur, mais face à lui ; voir Figure 1A).
   2. Placez le tube silastic à l’extrémité d’une aiguille pointue stérile de 18 G de manière à ce que ~1 mm de la pointe de l’aiguille dépasse. Placez la tubulure silastic à l’extrémité d’une aiguille émoussée stérile de manière à ce que ~1 mm de la pointe de l’aiguille dépasse.
      REMARQUE : Des aiguilles préemballées séparées et stériles (pointues et émoussées) doivent être utilisées pour chaque souris.
   3. Rassemblez un rasoir électrique, un gommage à l’iode, une gaze stérile et des tampons imbibés d’alcool pour préparer le site d’injection.
2. Entraînez-vous à déplacer une aiguille de 2 mm latéralement et de 1 mm caudale comme décrit ci-dessous.
   1. À l’aide d’une règle et d’un stylo, marquez une feuille de papier avec un point de départ (il s’agira d’un bregma), une marque de 2 mm à gauche ou à droite et une autre marque de 1 mm au-dessus de la dernière (il s’agira du site d’injection ; voir la figure 1B).
   2. Entraînez-vous à déplacer l’aiguille du point de départ au point de repère 1 au point de repère 2 (du bregma au site d’injection) jusqu’à ce que vous soyez sûr que le mouvement est répétable sans guides.
      REMARQUE : Les coordonnées décrites ici sont efficaces chez les souris adultes C57/BL6, mais d’autres souches ou groupes d’âge peuvent nécessiter un ajustement.
3. Préparez la souris à la craniotomie comme décrit ci-dessous.
   1. Placez la souris dans une chambre d’induction et anesthésiez-la avec 3 à 4 % d’isoflurane dans de l’oxygène de qualité médicale. Avec de la pratique et une familiarité avec la procédure, réduisez la durée totale de l’exposition à l’isoflurane à moins de 10 minutes pour la procédure de craniotomie.
      ATTENTION : L’exposition à l’isoflurane est dangereuse pour la santé humaine ; Utilisez un vaporisateur d’isoflurane approuvé et inspecté dans un endroit bien ventilé avec des moyens de piéger les gaz résiduaires.
   2. Une fois le réflexe des orteils absent, rasez la tête de l’animal. Appliquez un lubrifiant pour les yeux.
   3. Placez la souris sur le plan de travail avec la tête dans le cône de nez pour maintenir l’anesthésie.
   4. Administrer un agent analgésique, tel que la buprénorphine (0,6 à 0,8 mg/kg de poids corporel de souris, par voie sous-cutanée), selon les directives du fournisseur.
   5. Nettoyez le site d’injection en essuyant la tête avec de la gaze stérile trempée dans une solution d’iode (effectuez trois gommages), puis essuyez avec un tampon de gommage à l’alcool (effectuez trois fois).
      REMARQUE : Retirez la fourrure et nettoyez la peau autour du site d’injection et utilisez des instruments et des aiguilles stériles, comme recommandé par l’American Veterinary Medical Association pour prévenir les infections.
4. Tenez fermement la tête de la souris avec la main non dominante. Positionnez la tête aussi à plat que possible sur le plan de travail.
5. Localisez le site de l’injection.
   1. Utilisez l’aiguille pointue de 18 G préparée pour identifier d’abord le bregma ; Pour cela, faites glisser l’aiguille sur la peau de la tête le long de la ligne médiane, en vous déplaçant dans le plan rostral-caudal. Imaginez un triangle équilatéral dans lequel les deux sommets sont les yeux et le troisième sommet est l’emplacement approximatif du bregma (voir Figure 1C).
   2. À partir de bregma, déplacez l’aiguille latérale de 2 mm et caudale de 1 mm jusqu’au site d’injection.
6. Tout en tenant l’aiguille verticalement, poussez fermement l’aiguille à travers la peau et l’os jusqu’à ce que le tube affleure la peau.
7. Rétractez l’aiguille, faites tourner l’aiguille et appuyez à nouveau sur la peau et l’os. Répétez le processus jusqu’à ce qu’un petit trou soit créé dans l’os.
8. Utilisez l’aiguille émoussée pour vérifier qu’un trou suffisant a été produit dans l’os. Essayez de faire une ouverture dans l’os suffisamment grande pour que l’aiguille émoussée puisse passer à travers.
9. Retirez la souris du cône nasal, nettoyez tout sang du site d’injection avec de la gaze stérile et placez la souris dans une cage sur un chauffe-cage jusqu’à ce qu’elle soit réveillée. Étant donné que l’ouverture faite par la craniotomie est petite (aiguille de 18 G), le site n’a pas besoin d’être fermé avec une suture ou des clips de plaie.
   REMARQUE : L’ouverture produite ici est petite (18 G), de sorte que de nombreux établissements considèrent cette procédure comme une injection par opposition à une chirurgie. De plus, bien qu’une ouverture à travers la peau et les os vers le cerveau soit faite, le maintien de la peau tendue entraîne l’alignement des trous, ce qui aide probablement à empêcher la flore cutanée ou la litière de la cage d’entrer en contact avec le cerveau.

2. Faire l’injection

1. Préparez les matériaux pour l’injection comme décrit ci-dessous.
   1. Placez un tampon d’établi propre ou un matériau de drapé sur la surface de travail. Collez le cône de nez d’un vaporisateur d’isoflurane sur la surface de travail (près de l’expérimentateur, mais face à lui ; voir Figure 1A).
   2. Fixez une aiguille de 27 G de 10 mm de long avec un biseau de 45° sur une seringue en verre de 5 μL. Placez le tube silastic sur l’aiguille de manière à ce que 3,5 mm de la pointe de l’aiguille dépassent ; utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour maintenir la tubulure sur le corps de la seringue (voir Figure 1D).
   3. Préparez le milieu d’injection (médicament, virus ou autre liquide pour injection) dans un tube. Pour obtenir les résultats représentatifs de cette étude, une solution saline isotonique stérile a été injectée.
      REMARQUE : Choisissez un tube qui permet l’accès par la seringue en verre et l’aiguille, comme un tube de microcentrifugation de 2 ml.
   4. Prélever 3 μL de milieu d’injection dans la seringue en verre. Tout d’abord, prélevez plus que le volume souhaité et éjectez jusqu’à ce qu’il reste 3 μL dans la seringue.
   5. Rassemblez un gommage à l’iode, une gaze stérile et des tampons imbibés d’alcool pour préparer le site d’injection.
   6. Démarrez une minuterie de laboratoire en mode compte à rebours et placez la minuterie de manière à ce qu’elle soit visible par l’expérimentateur pendant les injections.
   7. Entraînez-vous à déplacer une aiguille de 2 mm latéralement et de 1 mm caudale comme effectué la veille.
2. Préparez la souris pour l’injection comme décrit ci-dessous.
   1. Placez la souris dans la chambre d’induction et anesthésiez-la avec de l’isoflurane. Une fois que le réflexe des orteils est absent, appliquez un lubrifiant pour les yeux et placez la souris sur le plan de travail avec la tête dans le cône du nez.
   2. Nettoyez le site d’injection avec trois lingettes d’iode et d’alcool. Identifiez le site d’injection à l’aide d’une aiguille de 18 G (ou d’une aiguille émoussée) comme décrit à l’étape 1.8. Le trou créé lors de la craniotomie doit être détectable.
      REMARQUE : Si la craniotomie n’a pas été effectuée à l’avance, ou si le trou dans le crâne n’est pas détectable, la craniotomie peut être effectuée ici.
3. Effectuez l’injection à l’aide d’une seringue en verre comme décrit ci-dessous.
   1. Tenez fermement la tête de la souris avec la main non dominante. Positionnez la tête aussi à plat que possible sur le plan de travail.
   2. Placez l’aiguille de la seringue en verre dans le trou du crâne jusqu’à ce que le tube placé sur l’aiguille préparée à l’étape 2.1.2 repose sur la peau de la souris.
   3. Tenez la seringue aussi verticalement que possible, en faisant attention aux plans coronal et sagittal. Injectez lentement le média sur une période de 1 min.
   4. Maintenez la seringue et l’aiguille en place pendant une minute de plus après la fin de l’injection pour minimiser le reflux. Rétractez lentement l’aiguille de la tête de la souris.
   5. Retirez la souris du cône nasal, nettoyez tout sang du site d’injection avec de la gaze stérile (s’il y en a) et placez la souris dans une cage sur un chauffe-cage jusqu’à ce qu’elle soit réveillée.

3. Confirmation de l’emplacement de l’injection

1. Anesthésier en profondeur et perfuser la souris avec une solution saline et du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme décrit précédemment⁸. Conservez le cerveau dans 30 % de saccharose dans du PBS à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau s’enfonce (généralement 2 jours).
2. Couper des coupes coronales de 20 à 50 μm sur un cryostat comme décrit précédemment⁹. Lors de la section, observez le tractus d’injection dans le bloc tissulaire. Notez si le tractus d’injection coupe clairement le ventricule latéral.

Résultats

Lorsqu’elle est exécutée avec succès, cette technique permet l’administration rapide d’un agent expérimental dans le système ventriculaire. La figure 2A montre un profil de pouls de l’hormone lutéinisante (LH) d’une souris ovariectomisée qui a reçu une injection ICV de 3 μL de solution saline isotonique stérile, le véhicule de nombreux composés pharmacologiques. Cet exemple démontre qu’une brève exposition à l’anesthésie gazeuse et l’injection de 3 μL de liqu...

Discussion

Nous décrivons ici un moyen simple et efficace de faire des injections d’ICV chez la souris. Étant donné que cette technique ne nécessite pas de cadre stéréotaxique, cette approche pour l’administration centralisée de médicaments et d’agents expérimentaux est accessible à un plus grand nombre de chercheurs. De plus, cette approche est relativement rapide puisque la procédure de préparation et d’injection peut être effectuée rapidement.

Étant donné que cette procédure n...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge blunt needles	SAI Infusion	B18-150
18-gauge needles	BD Medical	305195
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-363-750
Bench pad	Fisher Scientific	14-206-62AC22
Betadine solution	Fisher Scientific	NC1696484
Buprenorphine	Patterson Vet Supply	07-892-5235	Controlled substance
Eyelube	Fisher Scientific	50-218-8442
Glass syringe	Hamilton	7634-01
Injection needle	Hamilton	7803-01	27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane	Patterson Vet Supply	07-893-8441
Isoflurane vaporizer	Vet Equip	V-10
Laboratory Tape	VWR	89098-128
Medical grade oxygen	Airgas	OX USPEA
Paraformaldehyde	Millipore-Sigma	8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	J67802.K2
PulsaR Software	Open source, University of Otago		See ref 9
Ruler	Fisher Scientific	12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.)	DOW	508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.)	DOW	508-009
Sterile saline	VWR	101320-574
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500