שימוש במערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית על מצעים קשיחים או גמישים להעברת ביומולקולות וצבעים לצמחים

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטות לייצור מיקרו-ייצור של ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית (VACNFs), העברת VACNFs למצעים גמישים, ויישום VACNFs על מצעים קשיחים וגמישים לצמחים לצורך העברת ביומולקולות וצבעים.

Abstract

אספקת ביומולקולות וצבעים בלתי חדירים לצמחים שלמים היא אתגר גדול. ננו-חומרים הם כלים מתקדמים להעברת דנ"א לצמחים. עד כמה שהכלים החדשים האלה מרגשים, הם עדיין לא יושמו באופן נרחב. ננו-חומרים המיוצרים על מצע קשיח (גב) קשים במיוחד ליישום מוצלח על מבני צמחים מעוקלים. מחקר זה מתאר את התהליך לייצור מיקרו-ייצור של מערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית והעברתם ממצע קשיח למצע גמיש. אנו מפרטים ומדגימים כיצד סיבים אלה (על מצעים קשיחים או גמישים) יכולים לשמש לטרנספורמציה חולפת או להעברת צבע (למשל, פלואורסצאין) לצמחים. אנו מראים כיצד ניתן להעביר VACNF ממצע סיליקון קשיח למצע אפוקסי SU-8 גמיש ליצירת מערכי VACNF גמישים. כדי להתגבר על האופי ההידרופובי של SU-8, סיבים בסרט הגמיש היו מצופים בשכבת תחמוצת סיליקון דקה (2-3 ננומטר). כדי להשתמש בסיבים אלה להעברה לאיברי צמח מעוקלים, אנו מפקידים טיפת 1 μL של צבע או תמיסת DNA בצד הסיבים של יריעות VACNF, ממתינים 10 דקות, מניחים את היריעות על איבר הצמח ומשתמשים במטוש בתנועה מתגלגלת כדי להניע סיבים לתוך תאי הצמח. בשיטה זו השגנו העברת צבע ודנ"א באיברי צמחים בעלי משטחים מעוקלים.

Introduction

טרנספורמציה של צמחים (הן חולפת והן יציבה) עדיין לא הפכה להשגה נרחבת בכל רקמות הצמחים והמינים. הטרנספורמציה הארעית של צמחים היא תהליך שבו גנים המקודדים בפלסמידים מוחדרים באופן זמני לצמחים, אך אינם משולבים באופן יציב בגנום. שיטות מסורתיות המשתמשות בהפצצת חלקיקים, אגרובקטריה, אלקטרופורציה או פוליאתילן גליקול הטיפול בפרוטופלסטים הוא איטי או יכול להיות מסורבל. יתר על כן, הם אינם חלים על כל מיני צמחים 1,2,3,4. השימוש בננו-חומרים להעברת דנ"א הוא תחום מתפתח שנמצא עדיין בחיתוליו⁵. ננו-חומרים, במיוחד ננו-סיבי פחמן, שימשו בהצלחה גם להעברת חלבונים, דקסטרנים וצבעים לעלי הצמח מבלי לגרום לתגובת פצע⁶. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול מפורט לשימוש בסוג אחד של ננו-חומר, ננו-סיבי פחמן, להעברת ביומולקולות או צבעים לצמחים. כאן אנו מתמקדים בדנ"א כביומולקולה המועדפת, המאפשרת טרנספורמציה חולפת של תאים באיברי צמחים שונים.

בעבר, Morgan et ^al.7 הדגימו את השימוש בננו-סיבי פחמן המודבקים על מצע סיליקון קשיח כדי לשנות באופן זמני עלים של חסה, N. benthamiana , צפצפה, וגם עלים ושורשים של Arabidopsis. למרות שהטרנספורמציות היו מוצלחות על מגוון איברים, סיבים היו קשים יותר ליישום על רקמות צמחים עם משטחים מעוקלים, כגון שורשים או פירות. הנחנו כי גב גמיש לננו-סיבים עשוי לשפר את יעילות ההעברה שלהם על ידי התאמה טובה יותר לצורת האיבר.

במאמר זה, אנו מפרטים שיטות המשמשות לייצור ועיצוב ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית, העברת VACNFs למצעים גמישים, ויישום VACNFs על מצעים קשיחים וגמישים לצמחים כדי לספק ביומולקולות וצבעים. ננו-סיבי פחמן יוצרו באמצעות שקיעת אדים כימית משופרת פלזמה בזרם ישר (dc C-PECVD) עם זרז Ni. המיקום, הקוטר והגובה של נקודות זרז Ni נשלטו באמצעות שילוב של ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים, אידוי מתכת ותהליכי הרמה כפי שתוארו על ידי Melechko et ^al.8,9. באמצעות התנגדות קרן אלקטרונית דו-שכבתית, ניתן להניח זרז Ni עבה יותר על המצע כדי לתת סיבים ארוכים יותר¹⁰. העברת סיבים ממצע קשיח לגמיש מבוססת על שינוי של שיטות המתוארות בפלטשר ואחרים ¹¹, כאשר השיטות הנוכחיות מוותרות על שימוש בשכבת פחמן אמורפית או שכבת פוטו-התנגדות להקרבה. הרמת SU-8 עם העברת סיבים מושגת על ידי ניצול לחץ המתיחה הפנימי הנובע מתת-אפייה ותת-חשיפה של SU-8^12,13,14. SU-8, פולימר מורכב, הוא הידרופובי באופן טבעי, מה שהופך את השימוש בו להקל על העברת DNA קשה. כדי לנטרל את האופי ההידרופובי של SU-8, אנו מיישמים שכבה דקה של תחמוצת סיליקון באמצעות שקיעת שכבה אטומית¹⁵ לאחר שסיבים מוטמעים ב- SU-8. יישום סיבים על מצע קשיח להעברת ביומולקולה/צבע מנצל את כוח ההשפעה של הקשה בפינצטה המתוארת ב- Davern et ^al.6 ובשיטות על הצמח ועל השבב המתוארות ב- Morgan et ^al.7. יריעות VACNF גמישות מיושמות על משטחי צמחים מעוקלים על ידי ייבוש למחצה של טיפות DNA או צבע על היריעה, כמו בשיטת On-Chip של Morgan et ^al.7ולאחר מכן גלגול היריעות על משטחי צמחים מעוקלים באמצעות אפליקטור איפור קטן^16,17. איור 1 מתאר גישות שונות ליישום סיבים במצעים קשיחים וגמישים על צמחים.

Protocol

1. ייצור VACNFs (איור 2 ואיור 3)

1. ציפוי רקיק סיליקון עם פולימתיל מתקרילט (PMMA) 495 A4 עמיד ב 4000 סל"ד ואופים אותו ב 180 ° C במשך 5 דקות.
   הערה: תנו לרקיק להתקרר במשך 10 שניות לפני שתמשיכו לשלב הבא.
2. מצפים שכבת התנגדות שנייה (PMMA 950 A2) ואופים בחום של 180°C למשך 5 דקות.
3. השתמש בליתוגרפיה של קרן אלקטרונים כדי להגדיר את נקודות הזרז בקטרים של 300 ננומטר במרווח רוחבי מוגדר (גובה: 10 מיקרומטר, או 35 מיקרומטר) במערכים של 3 מ"מ x 3 מ"מ.
4. לפתח את ההתנגדות ב 30-40 מ"ל של 1: 3 methyl-isobutyl ketone: אלכוהול isopropyl (IPA) במשך 1.5 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו עם IPA ולייבש אותו עם N₂.
   הערה: בדוק את מערך הנקודות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מטרה של 20x).
5. נקו את רקיק ההתנגדות השיורית בחשיפה של 6 שניות בפלסמת חמצן (דסקום) בחריטה מסיליקון.
6. השתמש באידוי קרן אלקטרונים כדי להפקיד תחילה שכבת מתכת דבקה (Ti או Cr, 10 ננומטר) ולאחר מכן להפקיד שכבה שנייה, שהיא זרז Ni (130 ננומטר או 150 ננומטר). במהלך שקיעת מתכת Ti או Ni, שמור על הזרם מתחת ל- 0.2 A ב- 10 kV, על הלחץ מתחת ל- 5 x 10-6 Torr, ועל קצב השקיעה ב^- ~ 1 A/s עבור תצהיר קו ראייה.
7. השתמש בסוניקציית אמבטיה רציפה כדי להסיר את המתכת (Ni) ששקעה על שכבת ההתנגדות שמתחתיה, והשאיר את ה- Ni מונח ישירות על פרוסת הסיליקון. תהליך זה נקרא lift-off.
   1. לשם כך, להכין 3 מיכלים עם אצטון אמבטיה sonicate רקיק אצטון במשך 1 דקה; חזור על הפעולה 3 פעמים בטמפרטורת החדר (RT, 20°C) בתדר של 35 kHz. יש לשטוף עם IPA ולייבש עם N₂.
      הערה: לעולם אל תתנו לאצטון להתייבש על רקיק. לאחר סוניקציית האצטון האחרונה, יש לשטוף מיד עם IPA ולאחר מכן לייבש בגז N₂ . אם בשלב כלשהו הוופל מתייבש בטרם עת (לפני שטיפת IPA) קיימת אפשרות שלא כל עודפי המתכת וההתנגדות יוסרו והאצטון יכול להשאיר שאריות.
8. בדוק את הגיאומטריה של צורת הזרז באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). כדי לצלם תמונות SEM של שבבי VACNF, הטה את הבמה לזווית של 30° והשתמש במתח של 1-3 kV, עם זרם קרן של ~100 pA, ובמרחק עבודה ~ 5 מ"מ.
   הערה: הזרז צריך להיראות כמו פאק הוקי (גליל קומפקטי) (איור 4). גובה הגליל הקומפקטי צריך לשקף את עובי Ni שהופקד על פרוסת הסיליקון. אם הפרופיל של נקודת Ni גבוה ונראה קעור בחלקו העליון, בדומה להר געש (איור 4), אז סביר יותר שהזרז יירטב לטיפות Ni מרובות וכתוצאה מכך יסתעף ננו-סיבי פחמן⁹ (איור 4 ואיור 5). בעיות כאלה יכולות לנבוע מהתנגדות להתכה במהלך אידוי מתכת בגלל זמני שיקוע ארוכים או בעיות בתהליך ההמראה (איור 4 ואיור 5).
9. רבע את פרוסת הסיליקון ומקם אותה בתא שיקוע אדים כימי משופר פלזמה בזרם ישר (dc-PECVD) עם תערובת אצטילן/אמוניה. מטב את פרמטרי הגידול כדי לשלוט באורך ובחידוד של ננו-סיבים (קצוות <200 ננומטר).
   1. השתמש בזרם של 1-1.5 אמפר ובטווח מתח של 440-560 וולט. בעת גידול הסיבים, השתמש בשלב טרום טיפול עם זרימת אמוניה בזמן המכונה והמצע להתחמם עד 620 מעלות צלזיוס. הקפד להפעיל את מקור הפחמן (אצטילן) 10 שניות לפני הפעלת הפלזמה.
      הערה: רבע פרוסות משמשות למקרה שיהיה צורך למטב את פרמטרי ההפעלה של מכונת PECVD. כדי לייצר סיבים באורכים גדולים מ 40 מיקרומטר וקצוות פחות מ 200 ננומטר קוטר, הפרמטרים הבאים מוצעים: עם עובי זרז Ni של 130 ננומטר, להשתמש זרם של 1.75 A, זמן צמיחה של 70 דקות, ואצטילן : אמוניה יחס של 45 סמ"ק סטנדרטי לדקה (SCCM): 100 SCCM. עם עובי Ni של 150 ננומטר, להשתמש בזרם של 1.5 A, זמן צמיחה של 80 דקות, ויחס אצטילן : אמוניה של 48 sccm : 100 sccm. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לגדל VACNFs ללא קשר לעובי הזרז: טמפרטורת גדילה של 620 ° C, לחץ של 10 torr במהלך פלזמה, וגובה ראש מקלחת של 20 מ"מ (איור 6).
10. הערך את הגיאומטריה של הסיבים המתקבלים באמצעות SEM בהטיה של 30° עם פוטנציאל תאוצה של 1 kV.
    הערה: סיבים אופטימליים יהיו ישרים ולא מסתעפים. אי אפשר לשלוט בכיוון הגבישי של זרז Ni באמצעות מאייד קרן האלקטרונים. כתוצאה מכך, יהיו כמה סיבים שיסתעפו בגלל הרטבת זרז⁹. כמו כן, כיוון הגביש גורם ל- VACNFs לגדול לגבהים שונים, כך שקשה להגיע לגבהים אחידים בכל ה- VACNFs.
11. ציפוי שכבה של photoresist (SPR955) על הסיבים ב 1000 סל"ד במשך 45 שניות. לאחר מכן חתכו את פרוסת 1/4 למערכים בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ באמצעות מסור קוביות. אחסנו את הסיבים בשלב זה לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: אין לבצע את שלב 1.11 אם מתכננים להעביר סיבים למצע גמיש.

2. Tהעברת VACNFs למצע גמיש (איור 7 ואיור 8)

1. לאחר שהסיבים מסונתזים, מעיל הספינקוט SU-8 2015 photoresist על פרוסות או רבע פרוסות ב 4000 סל"ד במשך 45 שניות.
2. אפו את הוופל במשך 3 דקות בחום של 95°C.
3. באמצעות יישור מגע, חשוף את הפרוסות עם מסיכה בדוגמת מערך 3 מ"מ 3 מ"מ המתיישרת עם התבנית המוגדרת מליתוגרפיית קרן אלקטרונים ב- 95 mJ/cm².
   הערה: השתמש במצב מגע קרבה עם מרווח חשיפה הגדול ב- 20 מיקרומטר מהסיב הגבוה ביותר. קיימת אפשרות כי סיבים יכולים להיות מופלים במהלך שלב זה בתהליך.
4. אופים לאחר החשיפה במשך 6 דקות בחום של 95°C.
5. לפתח את רקיק מפתח SU-8 במשך 15 שניות, לשטוף אותו עם IPA, ולייבש את רקיק עם N₂, נע מלמעלה למטה.
   הערה: בעת פיתוח רקיק, ודא שהוא שקוע לחלוטין.
6. ופלים בדוגמת Spincoat עם שכבת מגן של photoresist דק (SPR 955 CM 0.7) ב 3000 סל"ד עבור 45 s ו softbake עבור 30 s ב 90 ° C.
7. הפקידו שכבה דקה של תחמוצת סיליקון על הפרוסות (2-3 ננומטר) על ידי הצבתה בשקיעת שכבה אטומית למשך 22 מחזורים ב -100 מעלות צלזיוס.
8. השתמש במסור קוביות כדי לחתוך את רקיק לריבועים בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ. יישרו את מסור הקוביות לתבנית הקיימת על רקיק.
9. הערך את הגיאומטריה של הסיבים המתקבלים באמצעות SEM בהטיה של 30° עם פוטנציאל תאוצה של 3 kV.
10. עצור כאן אם אחסון שבבים לשימוש לטווח ארוך (> שבוע). אחסנו שבבים בחושך.
11. כדי להפריד מצעים גמישים ממצעים קשיחים, הניחו שבבים בודדים באצטון למשך 30 דקות או עד שה-SU-8 מתחיל להתכרבל.
12. שטפו יריעות SU-8 (מחוברות או מנותקות ממצעים קשיחים) עם IPA למשך 5 דקות ולאחר מכן עם מים למשך 5 דקות. מניחים את השבבים בקופסה מסחרית עם פד דביק בעת הובלתם.
13. אופציונלי: הנח את הצד נטול הסיבים של סרט SU-8 על סרט מסיס במים או על גבי גומי סיליקון דק עם גב פוליאתילן טרפתאלט דק (PET) (בעובי 12.5 מיקרומטר).
    1. השתמש בזוג פינצטה כדי להעביר את סרט SU-8. לחץ על קצוות ריבוע SU-8 כדי לעזור לו להיצמד לסרט / גומי סיליקון - PET; זאת כדי להימנע משבירת סיבים. בשלב זה, סרטי VACNF מוכנים לשימוש מיידי.
    2. להכנת מחזיק גומי סיליקון/PET, בצעו את הפעולות הבאות: בעזרת ערכה בת 2 חלקים לגומי סיליקון, ערבבו את שני החלקים יחד (האלסטומר והקרוסלינקר). לאחר מכן, לחתוך ריבוע של PET ולהדביק אותו בצלחת פלסטיק שקופה. יוצקים שכבה דקה מאוד של גומי סיליקון על גבי ה-PET ומרפאים אותה בטמפרטורה של 80°C למשך 1-2 שעות.

3. שיטה על-צמחית (שבה טיפת תמיסה להעברה מונחת על משטח הצמח) באמצעות סיבים במצע קשיח (איור 1A)

1. יש להסיר את photoresist בשטיפות מצטברות של אצטון (100%, 5 דקות), IPA (100%, 5 דקות) ו-ddH₂O (5 דקות) לפני השימוש.
2. הניחו את רקמת הצמח על משטח קשיח לתמיכה.
3. הניחו טיפת 1 μL של צבע או DNA (200 ננוגרם) על פני השטח של רקמת הצמח.
4. מניחים שבב VACNF עם מצע קשיח בחלק העליון של הטיפה, כאשר הסיבים מכוונים כך שהם יבואו במגע עם הטיפה.
   הערה: הכיוון של השבבים יכול להיקבע על ידי "מבריק" של רקיק. בצד המבריק של השבב יש סיבים, ובצד האטום אין.
5. באמצעות הצד השטוח של זוג פינצטה, הקש על השבב. סמן את אזור הצמח שהשבב בא איתו במגע באמצעות טוש רך. הסר את שבבי VACNF לאחר המסירה.
   הערה: כמות הכוח המופעלת בעת הקשה תשתנה בהתאם לסוג רקמת הצמח שבה נעשה שימוש. מומלץ לתרגל הקשה על שבבים לפני ביצוע ההדבקה של סיבים. יש להימנע מנזק לרקמות הצמח. הנזק ניכר כאשר ניתן לראות את קווי המתאר של שבב VACNF ברקמת הצמח.
6. חזור על שלבים 3.1-3.5 לבקרות (+צבע/DNA, -סיבים; -צבע/DNA, +סיבים; ו-צבע/DNA, -סיבים). סיבים הם הצד נטול הסיבים של השבב.
7. יש לאחסן צמחים שלמים או איברי צמח שנכרתו בתאים לחים בתנאי יום ארוכים (16 שעות אור, 8 שעות כהות) במידת הצורך. עבור איברים שנכרתו, השתמשו בכלי פטרי מפלסטיק עם מגבות נייר רטובות.

4. שיטת On-chip (שבה טיפת תמיסה למסירה מונחת על שבב VACNF), מצע קשיח (איור 1B)

1. יש להסיר את photoresist בשטיפות מצטברות של אצטון (100%, 5 דקות), IPA (100%, 5 דקות) ו-ddH₂O (5 דקות) לפני השימוש.
2. יש להטיל טיפת 1 μL של DNA של צבע או פלסמיד (200 ננוגרם) על צד הסיבים של שבב VACNF עם מצע קשיח. הקפידו למקם את הטיפה במרכז השבב ולכסות מספר סיבים. תנו לטיפה להתייבש במשך 15 דקות.
   הערה: הכיוון של השבבים יכול להיקבע על ידי "מבריק" של רקיק. בצד המבריק של השבב יש סיבים, ובצד האטום אין.
3. כאשר עובדים עם עלים או איברים נכרתו אחרים, מניחים אותם על גבי משטח קשה. כאשר עובדים עם צמחים שלמים, מניחים משטח קשה מתחת לאיבר שאליו מוחלים VACNFs.
4. לאחר שלב הייבוש בן 15 הדקות, מקמו את שבב ה-VACNF כך שצד הסיב יבוא במגע עם רקמת הצמח. הקש על השבב עם הקצה האחורי של זוג פינצטה.
   הערה: כמות הכוח המופעלת בעת הקשה תשתנה בהתאם לסוג רקמת הצמח שבה נעשה שימוש. מומלץ לתרגל הקשה על שבבים.
5. חזור על שלבים 3.6-3.7 של השיטה על הצמח.

5. יישום VACNFs ביריעות SU-8 על רקמת צמח בשיטת on-chip (איור 1C)

1. הניחו טיפת 1 μL של צבע או DNA (200 ננוגרם) על צד הסיבים של סרט SU-8 והניחו לו להתייבש במשך 10 דקות. הקפד למקם את הטיפה במרכז השבב.
   הערה: ישנם זמני ייבוש שונים בהתאם למצע בו משתמשים.
2. בעזרת זוג פינצטות חדות, הניחו את סרט ה-VACNF על פני הצמח.
   הערה: ככל שסרטי SU-8 נשארים באוויר זמן רב יותר, כך הסרטים הופכים לשבירים יותר. כדי להגביל את הסיכון לאבד את יריעות SU-8, ודא שיש לך את כל הצמחים/דגימות והציוד ליד יריעות SU-8.
3. גלגלו בעדינות אפליקטור איפור קטן מעל סרט VACNF. סמן את האזורים שבהם ממוקמים המצעים הגמישים בטוש רך. הסר את המצע הגמיש משטח הצמח באמצעות סרט הדבקה.
   הערה: כמות הכוח המופעלת בעת גלגול המוליך תשתנה בין רקמות הצמח בהן נעשה שימוש. התמחו ביישום יריעות VACNF לפני ביצוע ביומולקולה או אספקת צבע. נזק נראה לעין לרקמות הצמח ניכר כאשר ניתן לראות את קווי המתאר של סרט VACNF ברקמת הצמח.
4. חזור על שלבים 5.1-5.3 עבור בקרות ואחסון צמחים כמתואר בשלב 3.7 של השיטה על הצמח.

6. מיקרוסקופיה וניתוח תמונה לכל שיטות המסירה

1. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות אורכי גל פליטה ועירור המתאימים לגשושית/כתב הפלואורסצנטי הנמסר.
   הערה: הזמן הדרוש לטרנספורמציה הארעית משתנה בהתאם למיני הצמחים ולסמן הנמסר. לדוגמה, ביטוי של סמנים פלואורסצנטיים זוהה לאחר 48 שעות בארבידופסיס לעומת 96 שעות בעלי חסה⁷.
2. בעת ההדמיה, נסו להתמקד באזור עם סיבים מנותקים. סיבים יהיו כיוונים שונים. הצלחת המשלוח אינה תלויה במראה של סיבים שבורים.
   הערה: סיבים יהיו פלואורסצנטיים עם הגדרות העירור/פליטה הנפוצות ביותר עקב היווצרות שכבת סיליקון ניטריד כתוצאה מהיווצרות סיבים ב-PECVD¹⁸.
3. צלם לפחות 5 תמונות עבור כל דגימה. האות המתקבל ישתנה.
4. מדוד את ערכי הפלואורסצנטיות כפלואורסצנטיות כוללת (צפיפות משולבת) באזורי תמונה קונפוקליים⁷ בגודל 20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר באמצעות ImageJ¹⁹.

תוצאות

היתרון המובהק של שבבי VACNF על מצעים קשיחים או גמישים הוא היכולת להעביר ביומולקולות או צבעים למיקומים ספציפיים בצמח (איור 1). כאן, השתמשנו בקריאות פלואורסצנטיות כדי להעריך את המסירה. באמצעות צמחים, מצעים ושיטות אספקה שונות (על שבב או על הצמח), יכולים להיות הבדלים בעיתוי המראה של צבע פלואורסצאין. כדי לקבוע אם שבבים/יריעות VACNF עובדים למשלוח, גישה מהירה היא להשתמש בסיבים להעברת צבע (איור 9). תמונות המסומנות בזמנים שונים באיור 9 הן שדות ראייה שונים מאותן דגימות. בעת שימוש בשיטה על הצמח, צבע פלואורסצאין ניתן לראות מיד לאחר הלידה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נוסף על כך, אם אותו שדה ראייה מצולם לאורך זמן לאחר העברת צבע פלואורסצאין לצמח, עוצמת האות נעשית פחות בהירה עם הזמן (איור 10). הצבע הפלואורסצאין עשוי לנוע משדה הראייה לאזורים אחרים של העלה דרך פלסמודסמאטה^20,21. בהשוואה לשיטה על הצמח, בשיטה על שבב עם סיבים על המצע הקשיח, הצבע נע לאט יותר בכל האזור המשופד (איור 9). זה יכול להיות תוצאה של צבע להתנתק מן הסיבים/rehydrating בתאים ולכן לוקח יותר זמן לזוז.

סיבים במצע הגמיש התאימו להעברת צבע למשטחים מעוקלים כמו תותים ותפוחים (איור 11 ואיור 12). באמצעות מצע גמיש עם תותים, אות פלואורסצאין חזק נצפה מיד (איור 11), בעוד שלקח שעתיים לראות אות פלואורסצאין חזק בתפוחים (איור 12B,D). ניתן לקבוע את ההעברה המוצלחת של פלסמידים המקודדים סמנים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי למצוא את האות המתקבל (איור 12F, איור 13 ואיור 14). יש צורך בבקרות כדי לקבוע אם לצמח המועדף אין אוטופלואורסצנטיות בדומה לסמן הפלואורסצנטי שאנו רוצים לספק על ידי סיבים. שימוש בסיבים בלבד עוזר לקבוע אם כוח ההשפעה המופעל בפינצטה גורם נזק לרקמת הצמח, או אם הפלואורסצנטיות שנצפתה בדגימה נובעת מה-VACNFs, שהם פלואורסצנטיים מטבעם בגלל שכבת הסיליקון ניטריד¹⁸ שלהם (איור 13C-D). סיבים המשופדים ברקמת הצמח אינם גורמים לתגובת פצע כפי שהוערך על ידי ייצור H 2 O₂⁶. לבסוף, באמצעות הבקרה של +דנ"א, -סיבים נחוצים כדי לאשר שהדנ"א אינו נכנס לצמח באמצעות הקשה בלבד, ומאשר שהסיבים נחוצים להעברה לתאי צמח (איור 13E-F). לא אמור להיות הבדל מובהק בעת שימוש בשיטות האספקה על המפעל או על השבב באמצעות VACNFs על מצע קשיח, כפי שמעיד היעדר הבדל משמעותי בערכי הפלואורסצנטיות (איור 13I). שימוש ביריעות VACNF גמישות עם העברת דנ"א על שבב הביא לשינוי חולף מוצלח של תאי אפידרמיס בתפוחים ובבצל שנקנו בחנות (איור 12F ואיור 14).

ניסויים שנכשלו עשויים לגרום לסיבים להישבר בשדות ראייה שונים, אך לא יהיה אות פלואורסצנטי כתוצאה מהניסיון לספק דנ"א פלסמיד או צבע. אם מופעל לחץ רב מדי על הצמח, נראה שייגרם נזק לרקמות (איור 15). נזק מכני זה עשוי להיראות כמו חורים קטנים או אזורים שקופים בצמח כאילו הוסרה שכבת תאים כאשר מסתכלים על הצמח תחת מיקרוסקופ. לפעמים טביעות של השבב יהיה גלוי. ניסוי שבו ביטוי חלבון פלואורסצנטי אינו מזוהה לאחר מסירת DNA עשוי להיות גם בשל שימוש ב- DNA באיכות נמוכה, ולכן זה עשוי להיות שימושי להכין DNA טרי.

איור 1: סכמטיות של העברת צבע/דנ"א לרקמת הצמח באמצעות סיבים על מצעים קשיחים וגמישים . (A) אספקת צבע/דנ"א בתיווך סיבים צמחיים. טיפת 1μL של תמיסת צבע/DNA מונחת על פני השטח של עלה ושבב VACNF מונח על גבי הטיפה. באמצעות זוג פינצטה, השבב הוא טפח בעדינות לתוך הרקמה. המצע הקשיח מוסר ומשאיר ננו-סיבים בתוך הרקמה. (B) אספקת DNA בתיווך סיבים על שבב. טיפת 1 μL של צבע או תמיסת DNA מוטלת על שבב VACNF ומיובשת במשך 15 דקות. השבב עם DNA מיובש למחצה מונח על גבי פני השטח של העלה ומודבק לתוך הרקמה כמו בלוח A. (C) משלוח DNA של סרט SU-8 על שבב. סיבים מועברים ממצע הסיליקון הקשיח לגיבוי SU-8 גמיש. טיפת 1 μL של תמיסת צבע/DNA מוטלת על סרט VACNF ומיובשת למשך 10 דקות. לאחר מכן מגלגלים את סרט ה-VACNF עם הצבע/דנ"א המיובש למחצה על משטח צמח מעוקל באמצעות מוליך איפור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זרימת עבודה ליצירת מערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית. כדי לייצר VACNFs, שכבה כפולה של פולימתיל מתקרילט (PMMA 495 A4 ואחריו PMMA 950 A2) מצופה בספין על פרוסת סיליקון. ליתוגרפיית קרן אלקטרונים משמשת להגדרת מערך של נקודות בקוטר 300 ננומטר. לאחר מכן ההתנגדות מפותחת במתיל איזובוטיל קטון/איזופרופנול (MIBK/IPA), ביחס של 1:3 למשך דקה וחצי. באמצעות מאייד מתכת, שכבת דבק של Ti (10 ננומטר) מוחל על רקיק, ואחריו שכבה של Ni (130 ננומטר או 150 ננומטר). ההתנגדות הנותרת מוסרת לאחר מכן באמצעות הרמה (סוניקציה של אמבטיה באצטון). הגיאומטריה של נקודות זרז נבדקת באמצעות SEM. אם הזרזים דומים לפאקים של הוקי והם שטוחים, הם ממוקמים במכונת תצהיר אדים כימית משופרת פלזמה (PECVD) ומגדלים סיבים. לאחר מכן נבדקו הסיבים באמצעות SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות SEM של ננו-סיבי פחמן אידיאליים מיושרים אנכית . (A) מיקרוגרף אלקטרונים של VACNFs עם פסיעה ~ 35 מיקרומטר וגובה של 10-15 מיקרומטר, שצולם בזווית של 30°. תמונה זו משוכפלת באיור 7C. (B) מיקרוגרף אלקטרונים של VANCFs עם גובה ~20 מיקרומטר וגובה 20-30 מיקרומטר, וצולם בזווית של 30°. (C) מיקרוגרף אלקטרונים של VANCFs עם גובה ~35 מיקרומטר, גובה 50-60 מיקרומטר, וצולם בזווית של 30°. (D) מיקרוגרף אלקטרונים של קצה VACNF בקוטר <200 ננומטר. קיימת שונות בקוטר קצה הסיבים (150-300 ננומטר). מכיוון שהסיבים צולמו בזווית של 30°, הגבהים נראים קטנים מהגובה בפועל בפקטור של sin(30°)=1/2. לוחות A ו-B הודפסו מחדש באישור Morgan et ^al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תמונות SEM של גיאומטריית זרז לפני גידול VACNFs. (A) תמונת SEM של הזרז לאחר ההמראה. שימו לב כי photoresist קיים סביב שפת הזרז, וכתוצאה מכך צורת הר געש. (ב,ג) תמונות SEM מציגות את צורות הר הגעש של הזרז לאחר שימוש בהתנגדות PMMA חד-שכבתית. (D) צורת זרז פאק הוקי רצויה העשויה משכבות כפולות של PMMA. מכיוון שהסיבים צולמו בזווית של 30° בלוחות A, B ו-D, נראה שהגבהים קטנים מהגובה בפועל בפקטור של sin(30°) = 1/2. פסי קנה מידה מייצגים 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: השפעת גודל נקודות הזרז על גדילת סיבים: כדי לקבוע את הקוטר האופטימלי של חומר הזרז גידלו סיבים מגדלים נקודתיים שנעו בין 200 ל-600 ננומטר. גודלי נקודות שנעו בין 400-600 ננומטר הובילו להרטבת הזרז ולצמיחה של סיבים מרובים. גיאומטריית הסיבים הטובה ביותר הופקה בקוטר 300 ננומטר. נקודות קטנות יותר הובילו לגובה סיבים לא מספיק. בשל העובדה שהסיבים צולמו בזווית של 30°, הגבהים נראים קטנים מהגובה בפועל בפקטור של sin(30°) = 1/2. התמונות צולמו באמצעות מיקרוגרף אלקטרונים סורק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: המחשה סכמטית של מערכת שקיעת אדים כימית משופרת בפלזמה (dc-PECVD) המשמשת במעבדה הלאומית אוק רידג' (ORNL). למערכת המותאמת אישית בבז"ן ראש מקלחת גדול המשמש כור לגזי הזנה ופלט לפלזמה. ראש המקלחת נשמר בפוטנציאל DC של 300 וולט ביחס לשלב המחומם של המצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: זרימת עבודה להעברת סיבים ממצע קשיח למצע גמיש. לאחר סינתזת ננופייבר ובדיקה, כל רקיק מצופה בספין SU-8 2015 ב-4000 סל"ד למשך 45 שניות. לאחר מכן מכינים את הוופל באפייה רכה במשך 3 דקות בחום של 95°C. לאחר מכן הפרוסת נחשפת לאור UV ומעוצבת ביישור מסכה ב 95 mJ / cm². לאחר אפייה במשך 6 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, רקיק מפותח מפתח SU-8 במשך 15 s, שטף עם IPA, מיובש עם גז N₂ . שכבת התנגדות מגנה של SPR 955 CM 0.7 מצופה בספין על הפרוסת ב-3000 סל"ד ואופה ב-90°C למשך 30 שניות. שכבת תחמוצת סיליקון (2-3 ננומטר) מתווספת לרקיק באמצעות שקיעת שכבה אטומית (ALD) (22 מחזורים ב-100°C) כדי להפוך את המצע הגמיש להידרופילי¹⁵. לאחר מכן חותכים את הפרוסת לריבועים בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ בעזרת מסור קוביות. בזמן השימוש, שבבים בודדים ממוקמים אצטון עד SU-8 מתחיל להסתלסל והופך קעור (>30 דקות). בשלב זה, ניתן לתפוס את שכבת SU-8 על רוב השבבים בקצה עם פינצטה חדה ולקלף ממצע הסיליקון שמתחתיו כסרט מרובע שלם של 3 מ"מ. לאחר מכן הסרט נשטף ברצף ב-IPA ובמים למשך 5 דקות כל אחד ונעשה בו שימוש מיידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: תמונות SEM של מעבר סיבים ממצע קשיח למצע גמיש. התמונות המוצגות מייצגות אך מגיעות מדגימות שונות. (A) סיבים ארוכים אחרי גדילת PECVD (אותה תמונה כמו באיור 2C). (ב,ג) סיבים לאחר יישום SU-8. האפוקסי מתפשט סביב בסיס הסיבים. אורך הסיבים שנחשפו נע בין 5 מיקרומטר ל-30 מיקרומטר. (D) סיבים המשובצים ב-Su-8 לאחר ההמראה שמרו על הגיאומטריה שלהם. בשל העובדה שהסיבים צולמו בזווית של 30°, הגבהים נראים קטנים מהגובה בפועל בפקטור של sin(30°)=1/2. לוח A הודפס מחדש באישור Morgan et ^al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: העברת צבע לעלי Arabidopsis בשיטות על שבב ועל הצמח עם סיבים על מצעים קשיחים. (א-פ) התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטת On-chip (A-H): 1 μL של 10 μM צבע פלואורסצאין יובש במשך 15 דקות על שבבי VACNF, ולאחר מכן השבבים נקשרו לצד האבקסיאלי של עלי Arabidopsis עם פינצטה. (א-ד) משאיר תמונה תוך 5-15 דקות לאחר המסירה. (ה-ה) משאיר תמונה 1 שעה לאחר הלידה. (A,E) +צבע, +סיבים. בקרות: (B,F) -צבע, -סיבים; (C,G) -צבע, +סיבים; (D,H) +צבע, -סיבים. (ט-פ) שיטה על הצמח: 1 μL של 10 מיקרומטר צבע פלואורסצאין הונח על פני הצמח, שבבים הונחו כך שהם באו במגע עם הטיפה, ופינצטה שימשו כדי להקיש את השבב לתוך הצד abaxial של עלי Arabidopsis. (I-L) שצולם תוך 5-15 דקות לאחר המסירה ו-(M-P) צולם שעה לאחר המסירה. (I,M) +צבע, +סיבים. בקרות: (J,N) -צבע, -סיבים; (K,O) -צבע, +סיבים; (L,P) + צבע, -סיבים. לוחות A-P הם תמונות מישוריות בודדות מערימות z. פסי קנה מידה הם 20 מיקרומטר. סיבים יש 35 מיקרומטר המגרש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: מהלך הזמן של העברת צבע בארבידופסיס בשיטה על הצמח עם מצע קשיח. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בשיטה על הצמח, טיפת 1 μL של תמיסת צבע פלואורסצאין (10 מיקרומטר) הונחה על פני העלה, ושבב VACNF הונח על גבי הטיפה. באמצעות זוג פינצטה, השבב הודבק בעדינות לתוך הרקמה. +צבע, +תמונות סיבים של אותו אזור נרכשו כל 5 דקות. פסי קנה מידה הם 20 מיקרומטר. סיבים יש 35 מיקרומטר המגרש. חלוניות הן תמונות מישוריות בודדות מערימות z. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: העברת צבע לפרי תות שדה באמצעות יריעות VACNF. (A-H) התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בשיטת On-Chip יובשו טיפות צבע על יריעות VACNF, שגולגלו לאחר מכן על משטחי פרי באמצעות מוליך איפור. צבע פלואורסצאין (10 מיקרומטר) הועבר לתאי תות שדה וצולם לאחר (A) 10 דקות ו-(B) 1 שעות. (C,D) ללא בקרות טיפול (-צבע, -סיבים). (E,F) -צבע, +סיבים שולט לאחר 10 דקות ו 1 שעה, בהתאמה. (G,H) +צבע, -סיבים שולט לאחר 10 דקות ו 1 שעה, בהתאמה. פסי קנה המידה הם 40 מיקרומטר. לוחות A-H הם הקרנות מקסימליות של 188 מיקרומטר z-stacks. סיבים יש 35 מיקרומטר המגרש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: העברת צבע וטרנספורמציה חולפת של תפוחים באמצעות יריעות VACNF. (A-F) התמונות נוצרו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בשיטת On-Chip, טיפות 1 μL של צבע פלואורסצאין (10 μM, B ו-D) או 1 μL של קידוד פלסמיד pUBQ₁₀:YFP (DNA−YFP) (200 ננוגרם) יובשו על יריעות VACNF, אשר גולגלו לאחר מכן על משטחי פרי באמצעות מוליך איפור. צבע פלואורסצאין הועבר לאפידרמיס התפוח וצולם לאחר (B) 10 דקות ו-(D) שעתיים. (D) לקח לצבע זמן מה להתפזר לתוך התאים לאחר הלידה. העברה וביטוי DNA-YFP באמצעות יריעות VACNF לאחר (F) 48 שעות (A,C,E) ללא בקרות טיפול (-צבע/DNA-YFP, -סיבים). פסי קנה המידה הם 40 מיקרומטר. לוחות A-D הם תמונות מישוריות בודדות מערימות z. לוחות E ו- F הם ההיטל המרבי של ערימות z של 53 מיקרומטר. גובה הסיבים הוא 35 מיקרומטר. חצים מציינים אותות פלואורסצאין או YFP. * מציין סיבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13: טרנספורמציה חולפת של עלי ארבידופסיס באמצעות שיטות VACNF על צמחים או על שבבים. (א-H) התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי 48 שעות לאחר מסירת DNA. (א,ג,ה,ז) שיטה על הצמח: 1 μL של קידוד פלסמיד pUBQ₁₀:YFP (DNA−YFP) (200 ng) הונח בצד abaxial של עלי Arabidopsis. השבבים מוקמו כך שבאו במגע עם הטיפה, ופינצטה שימשה להקשה על השבב ברקמת העלה. (ב,ד,ו,ח) שיטה על שבב: 1 μL של DNA−YFP (200 ng) יובשו במשך 15 דקות על שבבי VACNF ולאחר מכן כלי השבבים נקשרו לצד האבקסיאלי של עלי Arabidopsis עם פינצטה. +DNA-YFP, +סיבים עבור (A) על הצמח ו-(B) על שבב. בקרות: (C,D) -DNA-YFP, + סיבים; (E,F) +DNA-YFP, -סיבים; ו-(G,H) -DNA, −סיבים. (I) גרף של עוצמת אות פלואורסצנטי ממוצעת יחסית של 25, 20 × 20 מיקרומטר מתמונות של 5 עותקים ביולוגיים משולבים מ-2-3 ניסויים באמצעות פלואורסצנטיות מערוץ YFP. אזורים המכילים פיוניות (*) לא נכללו עקב אוטופלואורסצנציה. עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת ממצב -DNA-YFP, -סיבים הופחתה מכל ממוצע. 2-way ANOVA (ומבחן Tukey) שימשו לבדיקת מובהקות, וקווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. אותיות שונות מראות הבדלים משמעותיים בין הטיפולים (P < 0.0001). כל התמונות המוצגות הן הקרנות מרביות של 40 מיקרומטר z−ערימות. פסי קנה מידה הם 20 מיקרומטר. חיצים לבנים מציינים סיבים בתמונות. גובה הסיבים הוא 35 מיקרומטר. נתון זה הודפס מחדש באישור Morgan et ^al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 14: טרנספורמציה חולפת של בצל באמצעות יריעות VACNF. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי 48 שעות לאחר מסירת DNA. בשיטת On-Chip, טיפות 1 μL פלסמיד המקודדות pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ננוגרם) יובשו על יריעות VACNF במשך₁₀ דקות, ולאחר מכן גולגלו על משטחי איברי הצמח. (A) DNA-YFP נמסר לאפידרמיס הבצל, ו-YFP בא לידי ביטוי באפידרמיס הבצל. (ב) היעדר בקרת טיפול; (C) בקרה (+DNA-YFP, -סיבים) ו-(D) בקרה (-DNA-YFP, +סיבים). פסי קנה המידה הם 40 מיקרומטר. סיבים יש 35 מיקרומטר המגרש. התמונות הן הקרנות מרביות של ערימות z של 115 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 15: נזק לרקמות בחסה מיישום סרט VACNF . (A-D) התמונות נוצרו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. (A) שיטת השבב שימשה להעברת דנ"א לעלי חסה באמצעות יריעות VACNF. pUBQ 10:YFP טיפות DNA (200 ננוגרם) יובשו במשך₁₀ דקות על יריעות VACNF, אשר התגלגלו לאחר מכן על הצד האבקסיאלי של עלי חסה מנותקים ואוחסנו בתא לחות במשך 4 ימים. (B) בקרה (-DNA-YFP, +סיבים). (C) בקרה (+DNA-YFP, -סיבים), ו-(D) ללא טיפול (-DNA-YFP, -סיבים). פסי קנה מידה הם 40 מיקרומטר. ל- VACNF יש פסיעה של 35 מיקרומטר. החיצים מצביעים על נזק לצמח כתוצאה מגלגול המצע הגמיש בכוח רב מדי. שימו לב שהעברת DNA מוצלחת בתיווך VACNF בחסה הושגה בניסויים אחרים⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 16: זרימת עבודה של אספקה בתיווך VACNF בצמחים. בשלב I, בדוק את הגיאומטריה של הסיבים באמצעות SEM. לאספקה נכונה, סיבים צריכים קצה בקוטר <200 ננומטר. אם משתמשים בסיבים על מצע גמיש, השלב הבא יהיה לוודא שהסיבים מועברים ל- SU-8 ולבדוק את גובה הסיבים החשופים באמצעות SEM. בשלב II בדקנו את התועלת של הסיבים על-ידי ניסיון להעביר צבע לצמח/איבר לפי בחירתו באמצעות מצע קשיח או גמיש. השתמש 1 μL טיפה, או להניח אותו על פני השטח של הצמח או לייבש אותו לזמן קצר על השבב / סרט. עם שלב זה וכל השלבים האחרים, זה הכרחי להשתמש בבקרות המתאימות (-צבע,-סיבים; -צבע, +סיבים; ו +צבע,-סיבים) כדי להיות בטוחים כי האות מגיע משלוח צבע בתום לב . בשלב III, לאשר כי הגן של עניין נמצא פלסמיד, לקבוע את ריכוז ה- DNA לספק, ולבדוק את משך הזמן האופטימלי לאחר הלידה כדי לבדוק ביטוי. בשלב IV, התוצאה הוערכה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבדוק את הביטוי של הסמן הנמסר. נתון זה שונה באישור Morgan et ^al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

במאמר זה הצגנו שיטות לבניית מערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית, העברת הסיבים למצע גמיש ויישום סיבים במצע קשיח או גמיש על צמחים לשימוש בהעברת ביומולקולות או צבעים לצמחים. תיארנו שתי גישות כלליות, שיטת ה-on-chip והשיטות on-plant, לשיקוע החומרים שהוכנסו והראינו תוצאות מוצלחות בסיבים על מצע קשיח וכן בשיטת on-chip באמצעות יריעות VACNF. היישום של סיבים אלה פשוט יותר בפרקטיקה ובתיאוריה מאשר שיטות טרנספורמציה מסורתיות של צמחים (הפצצת חלקיקים, טרנספורמציה של פרוטופלסט באמצעות PEG או אלקטרופורציה) וניתן להשתמש בהם עבור צמחים סרבנים להתמרה בתיווך אגרובקטריום. עם זאת, רק תאים מעטים עוברים טרנספורמציה.

ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית יוצרו במרכז המעבדה הלאומית אוק רידג' למדעי החומרים הננופאזיים באמצעות תוכנית המשתמש שלהם. משתמשים יכולים להגיש בקשה להשתמש במתקן זה לייצור VACNFs. לחלופין, ניתן לייצר שבבי VACNF בחדרים נקיים עם מכונות שקיעת אדים כימיים משופרות פלזמה בזרם ישר עם מקור פחמן^22,23. עם השיטות המתוארות, ישנם מספר שלבים קריטיים לייצור הסיבים, העברת סיבים ויישום שבבים/יריעות VACNF. כדי שיישום סיבים יעבוד, סיבים חייבים להיות ישרים ולהיות בעלי קוטר מתחדד של <200 ננומטר בקצה כדי שהאספקה בתאי הצמח תהיה מוצלחת ^6,7 (איור 3). כדי ליצור ננו-סיבי פחמן בגודל וגובה מסוימים, ישנם מגוון פרמטרים שניתן לשנות, כולל גודל הנקודה, המגרש הרוחבי וכמות הזרז שהושקע. כדי לבחור את גודל הנקודה האופטימלי שישמש לייצור ננו-סיבי פחמן, גידלו סיבים מגדלי נקודות שונים (כפי שמוצג באיור 5). מצאנו שקוטר של 300 ננומטר מייצר את הסיבים הטובים ביותר, ולכן גודל הנקודה הזה נבחר (איור 5). לאחר שמצאנו את הפרמטרים הנכונים, חיפשנו להשתמש בשבבים שיש להם >50% מהסיבים עם הגיאומטריה האידיאלית (ישר וקוטר קצה <200 ננומטר). כדי לבדוק את הגיאומטריה של הסיבים, השתמשנו במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצלם שדות ראייה אקראיים על דגימה של שבבים/יריעות VACNF.

בנוסף, הסיבים חייבים להיות באורך מינימלי מסוים כדי להשיג אספקה בתוך תאי הצמח. החשיבות של ייצור סיבים באורכים שונים היא שניתן להשתמש בסיבים ארוכים יותר כדי לחדור לשכבות רקמות עמוקות יותר. סיבים ארוכים יותר (>40 מיקרומטר אורך) חיוניים עבור יריעות גמישות כמו העברת סיבים עובד על ידי שבירת הסיבים מבסיסם דורש שכבות SU-8 על גבי הסיבים. עובי העבודה של שכבת SU-8 המשמשת לפרוטוקול זה הוא 20-35 מיקרומטר. הגובה המינימלי הדרוש כדי להשיג משלוח בתוך האפידרמיס של צמחים שונים (מעוקל או שטוח) הוא 10-15 מיקרומטר ^6,7. כתוצאה מכך, סיבים באורכים >40 מיקרומטר נחוצים עבור יריעות VACNF. ישנם מספר פרמטרים שונים שיש לקחת בחשבון בעת ייצור ננו-סיבי פחמן: חומר זרז, גיאומטריית זרז, עובי חומר זרז וכן תנאים בתוך תא PECVD (יחס גז, לחץ, טמפרטורה, זרם, גובה ראש מקלחת וזמן גידול)8,9,24,25. כדי לייצר ננו-סיבי פחמן ארוכים מ-25 מיקרומטר המשמשים את Morgan et ^al.7 ו-Davern et ^al.6, הגדלנו את כמות הזרז Ni, שינינו את יחס האצטילן: אמוניה, והגדלנו את הזרם ואת זמן הגידול. בנוסף, הקדשנו תשומת לב רבה יותר לגיאומטריה של חומר הזרז. כדי לייצר סיבים ישרים גבוהים, הזרז שהושקע היה צריך להיות בעל צורת פאק הוקי ולא צורה שמזכירה הר געש (איור 4). מבני הר געש נובעים משאריות של photoresist לאחר המראה. כדי למנוע היווצרות הרי געש, נעשה שימוש בשכבה כפולה של PMMA ליצירת חתך תחתון במהלך ליתוגרפיית קרן אלקטרונים²⁶. החתך התת-קרקעי מסייע בהתרוממות של זרז המתכת שהושקע (איור 2). השכבה העבה של הזרז חשובה לצמיחה של VACNF גבוהים. המורפולוגיה של VACNFs נבדקה על ידי Merkulova et ^al.24. היישור האנכי של VACNFs נובע הן מהצמיחה מסוג קצה זרז Ni והן מהיישור של פוטנציאל DC בניצב למצע (איור 6). ראש המקלחת מתאר את הגיאומטריה של כור PECVD (איור 6) ומשמש כמקור לפוטנציאל לשדה החשמלי²⁷.

כדי להגדיר את מערך נקודות הזרז עם ליתוגרפיית קרן אלקטרונים, יישמנו התנגדות לקרן אלקטרונים (פולימתיל מתקרילט), ולאחר מכן השתמשנו באלומת האלקטרונית כדי ליצור חורים קטנים בהתנגדות עם צורה מסוימת ובמיקומים ספציפיים על רקיק. חורים בקוטר הרצוי הונחו על רשת רגילה עם המרווח המוגדר (גובה) וקובץ המציין את התבנית הרצויה נטען בכלי הליתוגרפיה של קרן אלקטרונים לפני טעינת המצע למכונה. בנוסף לגובה הסיבים, פרמטר קריטי נוסף להעברת סיבים מוצלחת הוא משך הזמן המושקע באמבט אצטון. סרטי VACNF צריכים להישאר באמבט אצטון מספיק זמן כדי שהקצוות שלהם יתחילו להתעקל; אם הם נשארים באמבט אצטון מעט מדי זמן, קשה יותר להרים אותם מהשבבים והם עלולים להישבר. ככל שהצ'יפס ישן יותר, כך הם יצטרכו להישאר זמן רב יותר באמבט אצטון. לאחר אמבט האצטון, הסרטים / שבבים הוכנסו לאיזופרופנול ומים כדי להסיר אצטון גישה וכן כדי להסיר את הפוטו-התנגדות המגנה על הסיבים.

כדי לבצע ציפוי ספין, ופלים או חתיכות רקיק ממוקמים על צ'אק ואקום בקואטר הסחיטה, והמיקום המרכזי של הפרוסות מאומת באמצעות פונקציית הבדיקה של קואטר הסחרור. שלולית קטנה (~ 2.5 ס"מ קוטר) של התנגדות מוחלת על מרכז רקיק ומסובבת (3000 סל"ד במשך 45 שניות) תמונות של הסיבים לפני ואחרי ציפוי הסחרור כלולות באיור 8 המראות את שימור גיאומטריית הסיבים (גובה, כיוון וגובה). נוכחות הסיבים גורמת להתנגדות להצטברות בבסיס הסיבים והתוצאה היא שכבות עבות מהצפוי. ציפוי ספין לאחר צמיחת VACNF נבדק על ידי קבוצות אחרות^11,18.

צעד נוסף בתהליך שהוא בעל חשיבות מכרעת הוא לוודא שכמות הכוח הנכונה מופעלת על שבבים/יריעות VACNF. מנגנון ההולכה תלוי בסיבים היוצרים נקבים קטנים בדפנות התא באמצעות כוח הדחף של הפינצטה המקישים על מצעים קשיחים ^6,7 או מתגלגלים עם המוליך המיני איפור על מצעים גמישים. סיבים עשויים להישבר או לא להישבר ולהישאר טבועים בתאי הצמח^6,7 ללא השפעה על התוצאה^, אך תרגול בשילוב עם בדיקת ספיגת צבע ונזק לרקמות הוא הכרחי כדי לקבל את הלחץ הנכון. נוסף על כך, חשוב לבחור נקודות זמן מתאימות להדמיה לאחר מסירת דנ"א עם שבבים/יריעות VACNF מאחר שהזמן לביטוי ניתן לזיהוי משתנה בין מיני צמחים לבין סוגי הווקטורים המועברים⁷ (איור 16).

עד כמה ששיטה זו ישימה באופן רחב על צמחים, יש לה כמה מגבלות. לדוגמה, הוספת שכבה דקה של תחמוצת סיליקון ליריעות VACNF לא תמיד גורמת לכך שהיריעות יהיו הידרופיליות לחלוטין בגלל שכבת ההגנה של התנגדות האור שנוספה על גבי SU-8. אם בעיה זו תתממש, שכבות עבות יותר של תחמוצת סיליקון יכולות להיות מיושמות על VACNFs. כדי לבדוק אם הסרטים הם הידרופוביים או הידרופיליים, הם יכולים להיות ממוקמים במים. אם היריעות שוקעות, הן הידרופיליות, ואם הן צפות, הן הידרופוביות. בנוסף, יכולה להיות שונות בין אצוות של סיבים המיוצרים. ישנם מספר פרמטרים שניתן לשנות בעת גידול הסיבים במכונת dc -PECVD; מה שמתואר בפרוטוקול זה הוא קבוצה של פרמטרים עבור שתי כמויות שונות של זרז Ni. בנוסף, לא ניתן לשלוט בכיוון הגבישי של זרז Ni²⁸ והסתעפות מסוימת תגרום בהכרח לסיבים.

בעוד שהדגמנו העברה של צבע פלואורסצאין ודנ"א לתאי צמחים באמצעות מצעים קשיחים וגמישים עבור מאמר זה, השיטה צריכה להיות ישימה באופן נרחב עבור ביומולקולות אחרות וגישות שינוי גנטי, לדוגמה, השתקת RNAi עבור מערכות צמחים כמו תפוחים או פירות אחרים, שם ייקח שנים לייצר קווים טרנסגניים יציבים. יתר על כן, סיבים אלה יכולים לשמש גם להעברת חומרי עריכה גנטיים או לטרנספורמציות יציבות בצמחים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct	Fastenal	690535
2-Propanol (IPA)	Fischer Scientific	A451-4
4" Lid	Entegris	H22-401-0615	Wafer Carriers
4" tray	Entegris	H22-40-0615	Wafer Carriers
Accretech SS10 dicing saw	Accreteck	SS10
Acetone	Fischer Scientific	A18-4
Acetone used in the cleanroom at ORNL	JT Baker	9005-05
Apples	Grocery store	No product number
Arabidopsis thaliana	Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago	No product number
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine	Oak Ridge National Laboratory	Custom-built
Cobham Green lettuce	Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis	No product number	Butterhead lettuce
Fluorescein dye	Sigma Aldrich	F2456-2.5G
Gel-box	Gel-Pak	AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool	Heidelberg	DWL 66
ImageJ	National Institues of Health	No product number
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL	Doe and Ingalls	CMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system	JEOL	8100
Kimwipes	Kimtech	Kimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish	VWR	11019-554
Layout Editor	juspertor GmbH	No product number
LSM 710 confocal microscope	Zeiss	No product number
LSM 800 confocal microscope	Zeiss	No product number
Make-up applicator	Amazon	G2PLUS	500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS
Merlin field emission scanning electron microscope	Zeiss	Merlin
MIBK/IPA  (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)	Microchem	M089025
Onions	Grocery store	No product number
Oxford FlexAl atomic layer deposition	Oxford	FlexAl
PMMA 495 A4	Microchem	M130004
PMMA 950 A4	Microchem	M230004	Can dilute down to A2
Polyethylene terephthalate (PET)	Amazon	KS-6304-21-11	Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc
Precision tweezers	Aven Inc.	18032TT
pUBQ10:YFP-GW	Arabidopsis Biological Resource Center	CD3-1948
Silicon etcher (used for descum)	Oxford	Plasmalab
Silicon rubber kit	Smooth-On Inc	Ecoflex 00-20
Silicon wafers	Pure Wafer	4N0.001-.005SSP-INV
Spin coater	Brewer Sciences	Model 100CB
SPR 955cm 0.7	Megaposit	10018314
Strawberries	Grocery store	No product number
SU-8 2015	Microchem	SU-8 2000 Series	Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 developer	Microchem	SU-8 2000 Series	Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Suss MicroTec contact aligner	Suss MicroTec	MA6/BA6
Table top microscope	Phenom XL	used for checking Ni catalysts after metal deposition
Thermionics VE-240 e-beam evaporator	Thermionics	VE-240