استخدام صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا على ركائز صلبة أو مرنة لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ إلى النباتات

Summary

نصف هنا طرق التصنيع الدقيق للألياف النانوية الكربونية المحاذية رأسيا (VACNFs) ، ونقل VACNFs إلى ركائز مرنة ، وتطبيق VACNFs على كل من الركائز الصلبة والمرنة على النباتات لتوصيل الجزيئات الحيوية والصبغة.

Abstract

يمثل توصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ غير المنفذة للنباتات السليمة تحديا كبيرا. المواد النانوية هي أدوات صاعدة لتوصيل الحمض النووي إلى النباتات. على الرغم من إثارة هذه الأدوات الجديدة ، إلا أنها لم يتم تطبيقها على نطاق واسع بعد. من الصعب بشكل خاص تطبيق المواد النانوية المصنعة على ركيزة صلبة (دعامة) بنجاح على هياكل النباتات المنحنية. تصف هذه الدراسة عملية التصنيع الدقيق لمصفوفات ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا ونقلها من ركيزة صلبة إلى ركيزة مرنة. نحن نوضح بالتفصيل ونوضح كيف يمكن استخدام هذه الألياف (على ركائز صلبة أو مرنة) للتحويل العابر أو الصبغة (على سبيل المثال ، الفلوريسين) إلى النباتات. نوضح كيف يمكن نقل VACNFs من ركيزة السيليكون الصلبة إلى ركيزة مرنة من الإيبوكسي SU-8 لتشكيل صفائف VACNF مرنة. للتغلب على الطبيعة الكارهة للماء ل SU-8 ، تم طلاء الألياف الموجودة في الفيلم المرن بطبقة رقيقة من أكسيد السيليكون (2-3 نانومتر). لاستخدام هذه الألياف لتسليمها إلى أعضاء النبات المنحنية ، نقوم بإيداع قطرة 1 ميكرولتر من الصبغة أو محلول الحمض النووي على جانب الألياف من أفلام VACNF ، وننتظر 10 دقائق ، ونضع الأفلام على العضو النباتي ونستخدم مسحة بحركة متدحرجة لدفع الألياف إلى الخلايا النباتية. باستخدام هذه الطريقة ، حققنا توصيل الصبغة والحمض النووي في أعضاء النبات ذات الأسطح المنحنية.

Introduction

لم يصبح التحول النباتي (العابر والمستقر) قابلا للتحقيق على نطاق واسع في جميع الأنسجة والأنواع النباتية. التحول العابر للنباتات هو عملية يتم من خلالها إدخال الجينات المشفرة في البلازميدات مؤقتا في النباتات ولكن لا يتم دمجها بشكل ثابت في الجينوم. الطرق التقليدية التي تستخدم قصف الجسيمات أو البكتيريا الزراعية أو التثقيب الكهربائي أو معالجة البولي إيثيلين جلايكول للبروتوبلاستيدات بطيئة أو يمكن أن تكون مرهقة. علاوة على ذلك ، فهي لا تنطبق على كل أنواع النباتات¹،²،^3،4. يعد استخدام المواد النانوية لتوصيل الحمض النووي مجالا مزدهرا لا يزال في مهده⁵. كما تم استخدام المواد النانوية ، وتحديدا ألياف الكربون النانوية بنجاح لتوصيل البروتينات والديكسترانس والأصباغ إلى أوراق النبات دون التسبب في استجابة الجرح⁶. الهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول مفصل لاستخدام نوع واحد من المواد النانوية ، ألياف الكربون النانوية ، لتوصيل الجزيئات الحيوية أو الأصباغ إلى النباتات. نركز هنا على الحمض النووي باعتباره الجزيء الحيوي المفضل، والذي يسمح بالتحول العابر للخلايا في مختلف أعضاء النبات.

في السابق ، أظهر Morgan et ^al.7 استخدام ألياف الكربون النانوية الملصقة على ركيزة السيليكون الصلبة لتحويل أوراق الخس ، N. benthamiana ، والحور ، وأوراق وجذور Arabidopsis. على الرغم من أن التحولات كانت ناجحة على مجموعة متنوعة من الأعضاء ، إلا أن الألياف كانت أكثر صعوبة في تطبيقها على الأنسجة النباتية ذات الأسطح المنحنية ، مثل الجذور أو الفاكهة. لقد فكرنا في أن الدعم المرن للألياف النانوية قد يحسن كفاءة توصيلها من خلال التوافق بشكل أفضل مع شكل العضو.

هنا ، نقوم بتفصيل الطرق المستخدمة لتصنيع وتصميم ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا ، ونقل VACNFs إلى ركائز مرنة ، وتطبيق VACNFs على كل من الركائز الصلبة والمرنة للنباتات لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ. تم إنتاج ألياف الكربون النانوية باستخدام ترسيب البخار الكيميائي المعزز بالبلازما التحفيزية بالتيار المباشر (dc C-PECVD) مع محفز Ni. تم التحكم في موضع وقطر وارتفاع نقاط محفز Ni باستخدام مزيج من الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون ، وتبخر المعادن ، وعمليات الرفع كما وصفها Melechko et ^al.8,9. باستخدام مقاومة شعاع إلكتروني مزدوج الطبقة ، يمكن ترسيب محفز Ni أكثر سمكا على الركيزة لإعطاء ألياف أطول¹⁰. يعتمد نقل الألياف من الركيزة الصلبة إلى الركيزة المرنة على تعديل الطرق الموضحة في Fletcher et ^al.11 ، مع الطرق الحالية التي تتخلى عن استخدام طبقة كربون غير متبلورة أو طبقة مقاومة للضوء قربانية. يتم تحقيق رفع SU-8 مع نقل الألياف من خلال الاستفادة من إجهاد الشد الجوهري الناتج عن نقص الخبز والتعرض السفلي ل SU-8¹²،^13،14. SU-8 ، بوليمر معقد ، كاره للماء بشكل طبيعي ، مما يجعل استخدامه لتسهيل توصيل الحمض النووي أمرا صعبا. لمواجهة الطبيعة الكارهة للماء ل SU-8 ، نقوم بتطبيق طبقة رقيقة من أكسيد السيليكون عن طريق ترسيب الطبقة الذرية¹⁵ بعد تضمين الألياف في SU-8. يستخدم تطبيق الألياف على ركيزة صلبة لتوصيل الجزيئات الحيوية / الصبغة قوة تأثير نقر الملقط الموصوف في Davern et ^al.6 والطرق على النبات وعلى الرقاقة الموصوفة في Morgan et ^al.7. يتم تطبيق أفلام VACNF المرنة على أسطح النباتات المنحنية عن طريق تجفيف الحمض النووي أو قطرات الصبغة على الفيلم كما هو الحال مع طريقة الرقاقة من Morgan et ^al.7ثم لف الأفلام على أسطح النباتات المنحنية باستخدام قضيب مكياج صغير^16,17. يوضح الشكل 1 طرقا مختلفة لتطبيق الألياف في ركائز صلبة ومرنة على النباتات.

Protocol

1. إنتاج VACNFs (الشكل 2 والشكل 3)

1. قم بطلاء رقاقة السيليكون مع بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) 495 A4 مقاومة عند 4000 دورة في الدقيقة واخبزها على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: اترك الرقاقة تبرد لمدة 10 ثوان قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
2. قم بطلاء طبقة ثانية من المقاومة (PMMA 950 A2) واخبزها على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. استخدم الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون لتحديد نقاط المحفز بأقطار 300 نانومتر عند تباعد جانبي محدد (الملعب: 10 ميكرومتر ، أو 35 ميكرومتر) في صفائف 3 مم × 3 مم.
4. تطوير المقاومة في 30-40 مل من 1: 3 ميثيل إيزوبوتيل كيتون: كحول الأيزوبروبيل (IPA) لمدة 1.5 دقيقة ، متبوعا بشطفه ب IPA وتجفيفه باستخدام N₂.
   ملاحظة: تحقق من مجموعة النقاط باستخدام مجهر برايت فيلد (هدف 20x).
5. نظف رقاقة المقاومة المتبقية بالتعرض لمدة 6 ثوان في بلازما الأكسجين (descum) في حفر السيليكون.
6. استخدم تبخر شعاع الإلكترون لإيداع طبقة لاصقة من المعدن أولا (Ti أو Cr ، 10 نانومتر) ثم إيداع طبقة ثانية ، وهي محفز Ni (130 نانومتر أو 150 نانومتر). أثناء ترسب معدن Ti أو Ni ، حافظ على التيار أقل من 0.2 A عند 10 كيلو فولت ، والضغط أقل من 5 × ^10-6 Torr ، ومعدل الترسيب عند ~ 1 A / s لترسيب خط البصر.
7. استخدم صوتنة الحمام المتسلسلة لإزالة المعدن (Ni) المترسب على طبقة المقاومة الأساسية ، تاركا Ni مودعا مباشرة على رقاقة السيليكون. وتسمى هذه العملية الإقلاع.
   1. لهذا ، تحضير 3 حاويات مع الأسيتون وحمام صوتنة الرقاقة في الأسيتون لمدة 1 دقيقة. كرر 3 مرات في درجة حرارة الغرفة (RT ، 20 درجة مئوية) بتردد 35 كيلو هرتز. شطف مع IPA وجفف مع N₂.
      ملاحظة: لا تدع الأسيتون يجف على الرقاقة. بعد صوتنة الأسيتون الأخيرة ، اشطفها على الفور باستخدام IPA ثم جففها بغاز N₂ . إذا أصبحت الرقاقة جافة في أي وقت قبل الأوان (قبل شطف IPA) ، فهناك احتمال ألا تتم إزالة كل المعدن الزائد والمقاومة ويمكن أن يترك الأسيتون بقايا.
8. تحقق من الشكل الهندسي لشكل المحفز باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). لالتقاط صور SEM لرقائق VACNF ، قم بإمالة المسرح إلى زاوية 30 درجة واستخدم جهدا من 1-3 كيلو فولت ، مع تيار شعاع ~ 100 pA ، ومسافة عمل ~ 5 مم.
   ملاحظة: يجب أن يبدو المحفز مثل قرص الهوكي (أسطوانة مدمجة) (الشكل 4). يجب أن يعكس ارتفاع الأسطوانة المدمجة سمك Ni المترسب على رقاقة السيليكون. إذا كان ملف تعريف نقطة Ni طويلا ويبدو أنه مقعر في الأعلى ، يشبه البركان (الشكل 4) ، فمن المرجح أن يتبلل المحفز إلى قطرات Ni متعددة مما يؤدي إلى تفرع الألياف النانوية الكربونية⁹ (الشكل 4 والشكل 5). يمكن أن تنجم هذه المشاكل عن مقاومة الذوبان أثناء تبخر المعدن بسبب أوقات الترسيب الطويلة أو المشكلات المتعلقة بإجراء الرفع (الشكل 4 والشكل 5).
9. ربع رقاقة السيليكون وضعها في غرفة ترسيب البخار الكيميائي المعزز بالبلازما بالتيار المباشر (dc-PECVD) مع خليط الأسيتيلين / الأمونيا. تحسين معلمات النمو للتحكم في طول وتفتق الألياف النانوية (نصائح <200 نانومتر).
   1. استخدم تيارا من 1-1.5 أمبير ونطاق جهد 440-560 فولت. عند زراعة الألياف ، استخدم مرحلة المعالجة المسبقة مع تدفق الأمونيا بينما تسخن الماكينة والركيزة حتى 620 درجة مئوية. تأكد من تشغيل مصدر الكربون (الأسيتيلين) 10 ثوان قبل بدء تشغيل البلازما.
      ملاحظة: يتم استخدام رقائق ربع سنوية في حالة الحاجة إلى تحسين معلمات تشغيل آلة PECVD. لإنتاج ألياف بأطوال أكبر من 40 ميكرومتر وأطراف قطرها أقل من 200 نانومتر ، يتم اقتراح المعلمات التالية: بسمك محفز Ni يبلغ 130 نانومتر ، استخدم تيارا يبلغ 1.75 أمبير ، ووقت نمو 70 دقيقة ، وأسيتيلين: نسبة الأمونيا 45 سنتيمترا مكعبا قياسيا في الدقيقة (SCCM): 100 sccm. بسمك Ni يبلغ 150 نانومتر ، استخدم تيارا يبلغ 1.5 أمبير ، ووقت نمو يبلغ 80 دقيقة ، والأسيتيلين: نسبة الأمونيا 48 sccm: 100 sccm. استخدم المعلمات التالية لزراعة VACNFs بغض النظر عن سمك المحفز: درجة حرارة النمو 620 درجة مئوية ، وضغط 10 تور أثناء البلازما ، وارتفاع رأس الدش 20 مم (الشكل 6).
10. قم بتقييم هندسة الألياف الناتجة باستخدام SEM عند إمالة 30 درجة مع إمكانية تسارع تبلغ 1 كيلو فولت.
    ملاحظة: الألياف المثلى ستكون مستقيمة وغير متفرعة. من المستحيل التحكم في الاتجاه البلوري لمحفز Ni باستخدام مبخر شعاع الإلكترون. نتيجة لذلك ، سيكون هناك بعض الألياف التي تتفرع بسبب إزالة الرطوبة من المحفز⁹. أيضا ، يتسبب الاتجاه البلوري في نمو VACNFs إلى ارتفاعات مختلفة ، لذلك من الصعب الحصول على ارتفاعات موحدة على جميع VACNFs.
11. قم بلف طبقة من مقاومة الضوء (SPR955) على الألياف عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. ثم قم بتقطيع الرقاقة إلى مكعبات 3 مم × 3 مم باستخدام منشار تقطيع. قم بتخزين الألياف في هذه المرحلة لاستخدامها لاحقا.
    ملاحظة: لا تقم بإجراء الخطوة 1.11 إذا كنت تخطط لنقل الألياف إلى ركيزة مرنة.

2. Transfering VACNFs إلى ركيزة مرنة (الشكل 7 والشكل 8)

1. بعد تصنيع الألياف ، يقاوم العمود الفقري SU-8 2015 الضوء على الرقائق أو الرقائق الربعية عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية.
2. اخبزي الرقاقة لمدة 3 دقائق على حرارة 95 درجة مئوية.
3. باستخدام مصفف تلامس ، قم بفضح الرقاقة بقناع منقوش مصفوفة 3 مم 3 مم يتماشى مع النمط المحدد من الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون عند 95 مللي جول / سم².
   ملاحظة: استخدم وضع تلامس القرب مع وجود فجوة تعرض أكبر بمقدار 20 ميكرومتر من أطول ألياف. هناك احتمال أن يتم ضرب الألياف خلال هذه الخطوة في العملية.
4. قم بإجراء خبز ما بعد التعرض لمدة 6 دقائق على درجة حرارة 95 درجة مئوية.
5. قم بتطوير الرقاقة في مطور SU-8 لمدة 15 ثانية ، وشطفها باستخدام IPA ، وجفف الرقاقة باستخدام N₂ ، وانتقل من أعلى إلى أسفل.
   ملاحظة: عند تطوير الرقاقة ، تأكد من غمرها بالكامل.
6. رقائق منقوشة بطبقة واقية من مقاومة الضوء الرقيقة (SPR 955 سم 0.7) عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية وخبز ناعم لمدة 30 ثانية عند 90 درجة مئوية.
7. قم بإيداع طبقة رقيقة من أكسيد السيليكون في الرقاقة (2-3 نانومتر) عن طريق وضعها في ترسيب الطبقة الذرية لمدة 22 دورة عند 100 درجة مئوية.
8. استخدم منشار تقطيع لتقطيع الرقاقة إلى مربعات 3 مم × 3 مم. قم بمحاذاة منشار التقطيع مع النمط الموجود مسبقا على الرقاقة.
9. قم بتقييم هندسة الألياف الناتجة باستخدام SEM عند إمالة 30 درجة مع إمكانية تسارع تبلغ 3 كيلو فولت.
10. توقف هنا إذا كان تخزين الرقائق للاستخدام طويل الأمد (>1 أسبوع). تخزين رقائق في الظلام.
11. لفصل الركائز المرنة عن الركائز الصلبة ، ضع الرقائق الفردية في الأسيتون لمدة 30 دقيقة أو حتى يبدأ SU-8 في التجعيد.
12. اغسل أفلام SU-8 (إما متصلة أو منفصلة عن ركائز صلبة) باستخدام IPA لمدة 5 دقائق ثم بالماء لمدة 5 دقائق. ضع الرقائق في صندوق تجاري مع وسادة لاصقة عند نقلها.
13. اختياري: ضع الجانب الخالي من الألياف من فيلم SU-8 على شريط قابل للذوبان في الماء أو فوق مطاط السيليكون الرقيق مع دعامة رقيقة من البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) (بسمك 12.5 ميكرومتر).
    1. استخدم زوجا من الملقط لنقل فيلم SU-8. اضغط على حواف مربع SU-8 لمساعدته على الالتصاق بالشريط / مطاط السيليكون PET ؛ هذا لتجنب كسر الألياف. في هذه المرحلة ، تكون أفلام VACNF جاهزة للاستخدام الفوري.
    2. لتحضير حامل مطاط السيليكون / PET ، قم بما يلي: باستخدام مجموعة من 2 جزء لمطاط السيليكون ، امزج الجزأين معا (المطاط الصناعي والرابط المتقاطع). بعد ذلك ، قم بقطع مربع من PET وقم بلصقه في طبق بلاستيكي شفاف. صب طبقة رقيقة جدا من مطاط السيليكون فوق PET ومعالجتها عند 80 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.

3. طريقة على النبات (حيث يتم وضع قطرة من المحلول لتوصيلها على سطح النبات) باستخدام الألياف في ركيزة صلبة (الشكل 1 أ)

1. قم بإزالة المقاوم للضوء بغسلات متزايدة من الأسيتون (100٪ ، 5 دقائق) ، IPA (100٪ ، 5 دقائق) ، و ddH₂O (5 دقائق) قبل الاستخدام.
2. ضع الأنسجة النباتية المراد خوزقها على سطح صلب للحصول على الدعم.
3. ضع قطرة 1 ميكرولتر من الصبغة أو الحمض النووي (200 نانوغرام) على سطح الأنسجة النباتية.
4. ضع شريحة VACNF مع ركيزة صلبة في الجزء العلوي من القطرة ، مع توجيه الألياف بحيث تتلامس مع القطرة.
   ملاحظة: يمكن تحديد اتجاه الرقائق من خلال "لمعان" الرقاقة. يحتوي الجانب اللامع من الشريحة على ألياف ، والجانب غير الشفاف لا يحتوي على ألياف.
5. باستخدام الجانب المسطح لزوج من الملقط ، انقر فوق الشريحة. حدد منطقة النبات التي لامست الشريحة لها باستخدام علامة ذات رؤوس ناعمة. قم بإزالة رقائق VACNF بعد التسليم.
   ملاحظة: يختلف مقدار القوة المطبقة عند النقر حسب نوع الأنسجة النباتية المستخدمة. يوصى بممارسة التنصت على الرقائق قبل إجراء عملية تشبع الألياف. تجنب تلف الأنسجة النباتية. يظهر الضرر عندما يمكن للمرء أن يرى الخطوط العريضة لشريحة VACNF في الأنسجة النباتية.
6. كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.5 لعناصر التحكم (+صبغ/DNA، -ألياف؛ -صبغ/DNA، +ألياف؛ و-صبغ/DNA، -ألياف). -الألياف هي الجانب الخالي من الألياف من الشريحة.
7. قم بتخزين النباتات السليمة أو أعضاء النبات المستأصلة في غرف رطبة في ظروف اليوم الطويل (16 ساعة خفيفة ، 8 ساعات مظلمة) إذا لزم الأمر. بالنسبة للأعضاء المستأصلة ، استخدم طبق بتري البلاستيكي مع مناشف ورقية مبللة.

4. طريقة على الرقاقة (حيث يتم وضع قطرة من المحلول للتسليم على شريحة VACNF) ، ركيزة صلبة (الشكل 1 ب)

1. قم بإزالة المقاوم للضوء بغسلات متزايدة من الأسيتون (100٪ ، 5 دقائق) ، IPA (100٪ ، 5 دقائق) ، و ddH₂O (5 دقائق) قبل الاستخدام.
2. قطرة صب 1 ميكرولتر قطرة من الصبغة أو الحمض النووي البلازميد (200 نانوغرام) على جانب الألياف من رقاقة VACNF مع ركيزة صلبة. تأكد من وضع القطرة في وسط الشريحة وتغطية العديد من الألياف. اترك القطرة تجف لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن تحديد اتجاه الرقائق من خلال "لمعان" الرقاقة. يحتوي الجانب اللامع من الشريحة على ألياف ، والجانب غير الشفاف لا يحتوي على ألياف.
3. عند العمل مع الأوراق أو الأعضاء الأخرى المستأصلة ، ضعها فوق سطح صلب. عند العمل مع النباتات السليمة ، ضع سطحا صلبا أسفل العضو الذي يتم تطبيق VACNFs عليه.
4. بعد خطوة التجفيف لمدة 15 دقيقة ، ضع شريحة VACNF بحيث يتلامس جانب الألياف مع الأنسجة النباتية. اضغط على الشريحة ذات النهاية الخلفية لزوج من الملقط.
   ملاحظة: يختلف مقدار القوة المطبقة عند النقر حسب نوع الأنسجة النباتية المستخدمة. يوصى بممارسة رقائق التنصت.
5. كرر الخطوات 3.6-3.7 من الطريقة على النبات.

5. تطبيق VACNFs في أفلام SU-8 على الأنسجة النباتية باستخدام طريقة الرقاقة (الشكل 1C)

1. ضع قطرة 1 ميكرولتر من الصبغة أو الحمض النووي (200 نانوغرام) على جانب الألياف من فيلم SU-8 واتركها تجف لمدة 10 دقائق. تأكد من وضع القطرة في وسط الشريحة.
   ملاحظة: هناك أوقات تجفيف مختلفة حسب الركيزة المستخدمة.
2. باستخدام زوج من الملقط الحاد ، ضع فيلم VACNF على سطح النبات.
   ملاحظة: كلما طالت مدة ترك أفلام SU-8 في الهواء ، أصبحت الأفلام أكثر هشاشة. للحد من مخاطر فقدان أفلام SU-8 ، تأكد من وجود جميع المصانع / العينات والمعدات بالقرب من أفلام SU-8.
3. قومي بلف أداة وضع مكياج صغيرة برفق فوق فيلم VACNF. حدد المناطق التي توضع فيها الركائز المرنة بعلامة ناعمة. قم بإزالة الركائز المرنة من سطح النبات باستخدام الشريط اللاصق.
   ملاحظة: سيختلف مقدار القوة المطبقة عند لف أداة وضع المكياج بين الأنسجة النباتية المستخدمة. تدرب على تطبيق أفلام VACNF قبل إجراء توصيل الجزيئات الحيوية أو الصبغة. يظهر الضرر المرئي للأنسجة النباتية عندما يمكن للمرء أن يرى الخطوط العريضة لفيلم VACNF في الأنسجة النباتية.
4. كرر الخطوات 5.1-5.3 لعناصر التحكم وتخزين النباتات كما هو مذكور في الخطوة 3.7 من الطريقة على المصنع.

6. الفحص المجهري وتحليل الصور لجميع طرق التسليم

1. قم بتصوير العينات باستخدام مجهر متحد البؤر باستخدام أطوال موجية للانبعاث والإثارة مناسبة لمسبار / مراسل الفلورسنت الذي تم تسليمه.
   ملاحظة: يختلف الوقت اللازم للتحول العابر باختلاف الأنواع النباتية والعلامة التي تم تسليمها. على سبيل المثال ، تم الكشف عن التعبير عن علامات الفلورسنت بعد 48 ساعة في أرابيدوبسيس مقابل 96 ساعة في أوراق الخس⁷.
2. عند التصوير ، حاول التركيز على منطقة بها ألياف منفصلة. سيكون للألياف اتجاهات مختلفة. لا يعتمد نجاح التسليم على ظهور الألياف المكسورة.
   ملاحظة: ستكون الألياف فلورية مع إعدادات الإثارة / الانبعاث الأكثر شيوعا بسبب تكوين طبقة نيتريد السيليكون الناتجة عن تكوين الألياف في PECVD¹⁸.
3. التقط 5 صور على الأقل لكل عينة. سوف تختلف الإشارة الناتجة.
4. قم بقياس قيم التألق كمضان كلي (كثافة متكاملة) في مناطق صورة متحدة البؤر 20 ميكرومتر × 20 ميكرومتر⁷ باستخدام ImageJ¹⁹.

النتائج

الميزة المميزة لرقائق VACNF على ركائز صلبة أو مرنة هي القدرة على توصيل الجزيئات الحيوية أو الأصباغ إلى مواقع محددة في النبات (الشكل 1). هنا ، استخدمنا قراءات مضان لتقييم التسليم. باستخدام نباتات وركائز وطرق توصيل مختلفة (على الرقاقة أو على النبات) ، يمكن أن تكون هناك اختلافات في توقيت ظهور صبغة الفلوريسين. لتحديد ما إذا كانت رقائق / أفلام VACNF تعمل للتسليم ، فإن النهج السريع هو استخدام الألياف لتوصيل الصبغة (الشكل 9). الصور المشار إليها بأوقات مختلفة في الشكل 9 هي مجالات رؤية مختلفة عن العينات نفسها. عند استخدام طريقة النبات ، يمكن ملاحظة صبغة الفلوريسئين مباشرة بعد الولادة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تصوير نفس مجال الرؤية بمرور الوقت بعد توصيل صبغة الفلوريسئين إلى النبات ، فإن شدة الإشارة تصبح أقل سطوعا بمرور الوقت (الشكل 10). من المحتمل أن تنتقل صبغة الفلوريسئين من مجال الرؤية إلى مناطق أخرى من الورقة من خلال البلازموديزما^20,21. بالمقارنة مع الطريقة على النبات ، في طريقة الرقاقة مع الألياف على الركيزة الصلبة ، تتحرك الصبغة بشكل أبطأ في جميع أنحاء المنطقة المخوزة (الشكل 9). قد يكون هذا نتيجة انفصال الصبغة عن الألياف / إعادة الترطيب في الخلايا وبالتالي أخذ المزيد من الوقت للتحرك.

كانت الألياف في الركيزة المرنة مناسبة لتوصيل الصبغة إلى الأسطح المنحنية مثل الفراولة والتفاح (الشكل 11 والشكل 12). باستخدام ركيزة مرنة مع الفراولة ، لوحظت إشارة فلوريسئين قوية على الفور (الشكل 11) ، بينما استغرق الأمر 2 ساعة لرؤية إشارة فلوريسئين قوية في التفاح (الشكل 12B ، D). يمكن تحديد التسليم الناجح للبلازميدات التي تشفر علامات الفلورسنت باستخدام المجهر الفلوري للعثور على الإشارة الناتجة (الشكل 12F والشكل 13 والشكل 14). الضوابط ضرورية لتحديد ما إذا كان النبات المختار ليس له تألق ذاتي مشابه لعلامة الفلورسنت التي نريد توصيلها بالألياف. يعد استخدام الألياف وحدها مفيدا لتحديد ما إذا كانت قوة التأثير المطبقة بالملاقط تؤدي إلى تلف الأنسجة النباتية أو إذا كان التألق المرصود داخل العينة يرجع إلى VACNFs ، والتي تكون بطبيعتها فلورية بسبب طبقة نيتريد السيليكون¹⁸ (الشكل 13C-D). الألياف المخوزة في الأنسجة النباتية لا تحفز استجابة الجرح كما تم تقييمها بواسطة إنتاج H₂O^{2 6}. أخيرا ، باستخدام التحكم في + DNA ، -الألياف ضروري لتأكيد أن الحمض النووي لا يدخل إلى النبات من خلال النقر وحده ويؤكد أن الألياف ضرورية للتوصيل إلى الخلايا النباتية (الشكل 13E-F). يجب ألا يكون هناك فرق واضح عند استخدام طرق التسليم في المصنع أو على الرقاقة باستخدام VACNFs على ركيزة صلبة ، كما يتضح من عدم وجود فرق كبير في قيم التألق (الشكل 13I). أدى استخدام أفلام VACNF المرنة مع توصيل الحمض النووي على الرقاقة إلى تحول عابر ناجح لخلايا البشرة في التفاح والبصل الذي يتم شراؤه من المتجر (الشكل 12F والشكل 14).

قد تحتوي التجارب الفاشلة على ألياف مقطوعة في مجالات رؤية مختلفة ، ولكن لن تكون هناك إشارة مضان ناتجة عن محاولة توصيل الحمض النووي أو البلازميد أو الصبغة. إذا تم الضغط بشدة على النبات ، فسيكون هناك تلف واضح في الأنسجة (الشكل 15). قد يبدو هذا الضرر الميكانيكي مثل ثقوب صغيرة أو مناطق شفافة في النبات كما لو تمت إزالة طبقة من الخلايا عند النظر إلى النبات تحت المجهر. في بعض الأحيان تكون بصمات الشريحة مرئية. قد تكون التجربة التي لا يتم فيها اكتشاف تعبير البروتين الفلوري بعد توصيل الحمض النووي ناتجة أيضا عن استخدام حمض نووي منخفض الجودة ، لذلك قد يكون من المفيد تحضير حمض نووي جديد.

الشكل 1: رسم تخطيطي لتوصيل الصبغة/الحمض النووي (DNA) إلى الأنسجة النباتية باستخدام الألياف على ركائز صلبة ومرنة. (أ) توصيل الصبغة/الحمض النووي (DNA) بوساطة الألياف. يتم وضع قطرة 1 ميكرولتر من محلول الصبغة / الحمض النووي على سطح الورقة ويتم وضع شريحة VACNF فوق القطرة. باستخدام زوج من الملقط ، يتم النقر على الشريحة برفق في الأنسجة. تتم إزالة الركيزة الصلبة تاركة الألياف النانوية داخل الأنسجة. (ب) توصيل الحمض النووي بوساطة الألياف على الرقاقة. يتم صب قطرة 1 ميكرولتر من الصبغة أو محلول الحمض النووي على شريحة VACNF وتجفيفها لمدة 15 دقيقة. توضع الرقاقة التي تحتوي على الحمض النووي شبه المجفف أعلى سطح الورقة وتنقر في الأنسجة كما في اللوحة (أ). (ج) توصيل الحمض النووي لفيلم SU-8 على الرقاقة. يتم نقل الألياف من ركيزة السيليكون الصلبة إلى دعم SU-8 المرن. يتم صب قطرة 1 ميكرولتر من محلول الصبغة / الحمض النووي على فيلم VACNF وتجفيفها لمدة 10 دقائق. ثم يتم لف فيلم VACNF مع الصبغة شبه المجففة / الحمض النووي على سطح نبات منحني باستخدام قضيب مكياج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: سير العمل لصنع صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا. لإنتاج VACNFs ، يتم طلاء طبقة مزدوجة من بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA 495 A4 متبوعة ب PMMA 950 A2) بالدوران على رقاقة السيليكون. تستخدم الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون لتحديد مجموعة من النقاط قطرها 300 نانومتر. ثم يتم تطوير المقاومة في ميثيل إيزوبوتيل كيتون / إيزوبروبانول (MIBK / IPA) ، 1: 3 لمدة 1.5 دقيقة. باستخدام مبخر معدني ، يتم تطبيق طبقة لاصقة من Ti (10 نانومتر) على الرقاقة ، تليها طبقة من Ni (130 نانومتر أو 150 نانومتر). ثم تتم إزالة المقاومة المتبقية عن طريق الرفع (صوتنة الحمام في الأسيتون). يتم فحص هندسة نقاط المحفز عبر SEM. إذا كانت المحفزات تشبه كرات الهوكي وكانت مسطحة ، يتم وضعها في آلة ترسيب البخار الكيميائي المعزز بالبلازما (PECVD) وتزرع الألياف. ثم تم فحص الألياف باستخدام SEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: صور SEM لألياف الكربون النانوية المثالية المحاذية رأسيا . (أ) صورة مجهرية إلكترونية ل VACNFs بميل ~ 35 ميكرومتر وارتفاع 10-15 ميكرومتر ، مصورة بزاوية 30 درجة. هذه الصورة مكررة في الشكل 7C. (ب) صورة مجهرية إلكترونية ل VANCFs بميل ~ 20 ميكرومتر وارتفاع 20-30 ميكرومتر ، وتصويرها بزاوية 30 درجة. (C) صورة مجهرية إلكترونية ل VANCFs بميل ~ 35 ميكرومتر ، ارتفاع 50-60 ميكرومتر ، وتصويرها بزاوية 30 درجة. (د) صورة مجهرية إلكترونية لطرف VACNF قطرها <200 نانومتر. هناك اختلاف في أقطار طرف الألياف (150-300 نانومتر). نظرا لأن الألياف تم تصويرها بزاوية 30 درجة ، يبدو أن الارتفاعات أصغر من الارتفاع الفعلي بعامل الخطيئة (30 درجة) = 1/2. أعيد طبع اللوحتين ألف وباء بإذن من Morgan et ^al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: صور SEM لهندسة العامل الحفاز قبل نمو VACNFs . (أ) صورة SEM للمحفز بعد الإقلاع. لاحظ أن المقاومة الضوئية موجودة حول حافة العامل الحفاز ، مما ينتج عنه شكل بركان. (ب، ج) تظهر صور SEM الأشكال البركانية للمحفز بعد استخدام مقاومة PMMA أحادية الطبقة. (د) شكل محفز عفريت الهوكي المطلوب مصنوع من طبقات مزدوجة من PMMA. نظرا لأن الألياف تم تصويرها بزاوية 30 درجة في اللوحات A و B و D ، فإن الارتفاعات تبدو أصغر من الارتفاع الفعلي بعامل الخطيئة (30 درجة) = 1/2. تمثل أشرطة المقياس 100 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تأثير حجم نقطة المحفز على نمو الألياف: لتحديد القطر الأمثل لمادة المحفز ، نمت الألياف من أحجام نقطية تتراوح من 200-600 نانومتر. أدت أحجام النقاط التي تتراوح من 400-600 نانومتر إلى إزالة رطوبة المحفز ونمو ألياف متعددة. تم إنتاج أفضل هندسة للألياف بقطر 300 نانومتر. أدت النقاط الأصغر إلى عدم كفاية ارتفاع الألياف. نظرا لحقيقة أن الألياف تم تصويرها بزاوية 30 درجة ، يبدو أن الارتفاعات أصغر من الارتفاع الفعلي بعامل الخطيئة (30 درجة) = 1/2. تم التقاط الصور باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: رسم تخطيطي لنظام ترسيب البخار الكيميائي المعزز بالبلازما (dc-PECVD) المستخدم في مختبر أوك ريدج الوطني (ORNL). يحتوي النظام المخصص في ORNL على رأس دش كبير يعمل كمفاعل لغازات التغذية وإخراج البلازما. تم الحفاظ على رأس الدش عند جهد تيار مستمر يبلغ 300 فولت بالنسبة للمرحلة الساخنة للركيزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: سير عمل نقل الألياف من ركيزة صلبة إلى ركيزة مرنة. بعد تخليق الألياف النانوية وفحصها ، يتم طلاء كل رقاقة بالدوران باستخدام SU-8 2015 عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. ثم تخبز الرقاقة طرية لمدة 3 دقائق على حرارة 95 درجة مئوية. ثم تتعرض الرقاقة لضوء الأشعة فوق البنفسجية ومنقوشة في تقويم قناع عند 95 مللي جول / سم². بعد الخبز لمدة 6 دقائق عند 95 درجة مئوية ، يتم تطوير الرقاقة في مطور SU-8 لمدة 15 ثانية ، وتشطف ب IPA ، وتجفف بغاز N₂ . طبقة مقاومة واقية من SPR 955 سم 0.7 مغلفة بالدوران على الرقاقة عند 3000 دورة في الدقيقة ومخبوزة طرية عند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. ثم تضاف طبقة أكسيد السيليكون (2-3 نانومتر) إلى الرقاقة عن طريق ترسيب الطبقة الذرية (ALD) (22 دورة عند 100 درجة مئوية) لجعل الركيزة المرنة محبة للماء¹⁵. ثم يتم تقطيع الرقاقة إلى مربعات 3 مم × 3 مم بمنشار تقطيع. في وقت الاستخدام ، يتم وضع الرقائق الفردية في الأسيتون حتى يبدأ SU-8 في حليقة ويصبح مقعرا (>30 دقيقة). في هذا الوقت ، يمكن إمساك طبقة SU-8 على معظم الرقائق عند الحافة بملاقط حادة وتقشيرها من ركيزة السيليكون الأساسية كفيلم مربع سليم 3 مم. ثم يتم غسل الفيلم على التوالي في IPA والماء لمدة 5 دقائق لكل منهما واستخدامه على الفور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: صور SEM لنقل الألياف من ركيزة صلبة إلى ركيزة مرنة. الصور المعروضة تمثيلية ولكنها تأتي من عينات مختلفة. (أ) ألياف طويلة بعد نمو PECVD (نفس الصورة كما في الشكل 2C). (ب، ج) الألياف بعد تطبيق SU-8. يتدفق الإيبوكسي حول قاعدة الألياف. تراوح طول الألياف المكشوفة من 5 ميكرومتر إلى 30 ميكرومتر. (د) احتفظت الألياف المضمنة في Su-8 بعد الإقلاع بهندستها. نظرا لحقيقة أن الألياف تم تصويرها بزاوية 30 درجة ، يبدو أن الارتفاعات أصغر من الارتفاع الفعلي بعامل الخطيئة (30 درجة) = 1/2. أعيد طبع اللوحة A بإذن من Morgan et ^al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: توصيل الصبغة إلى أوراق أرابيدوبسيس باستخدام طرق على الرقاقة وعلى النبات مع ألياف على ركائز صلبة. (أ-ب) تم الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر. طريقة الرقاقة (A-H): تم تجفيف 1 ميكرولتر من صبغة الفلوريسئين 10 ميكرومتر لمدة 15 دقيقة على رقائق VACNF ، ثم تم النقر على الرقائق في الجانب المحوري من أوراق Arabidopsis بملاقط. (أ-د) يترك الصورة في غضون 5-15 دقيقة بعد التسليم. (ه-ح) يترك صورة 1 ساعة بعد الولادة. (أ ، ه) + صبغة ، + ألياف. الضوابط: (ب ، و) - صبغ ، - ألياف ؛ (ج ، ز) - صبغ ، + ألياف ؛ (د ، ح) + صبغ ، -ألياف. (I-P) طريقة على النبات: تم وضع 1 ميكرولتر من صبغة الفلوريسئين 10 ميكرومتر على سطح النبات ، وتم وضع الرقائق بحيث تتلامس مع القطرة ، وتم استخدام الملقط للاستفادة من الشريحة في الجانب المحوري من أوراق Arabidopsis. (I-L) تم تصويره في غضون 5-15 دقيقة بعد التسليم و (M-P) تم تصويره بعد 1 ساعة من التسليم. (أنا ، م) + صبغ ، + ألياف. الضوابط: (J ، N) - صبغ ، - ألياف ؛ (K ، O) - صبغ ، + ألياف ؛ (L ، P) + صبغ ، -ألياف. اللوحات A-P هي صور مستوية مفردة من مكدسات z. قضبان المقياس 20 ميكرومتر. الألياف لها 35 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: المسار الزمني لتسليم الصبغة في أرابيدوبسيس بطريقة على النبات مع ركيزة صلبة. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر. باستخدام الطريقة على النبات ، تم وضع قطرة 1 ميكرولتر من محلول صبغة الفلوريسئين (10 ميكرومتر) على سطح الورقة ، وتم وضع شريحة VACNF فوق القطرة. باستخدام زوج من الملقط ، تم النقر على الشريحة برفق في الأنسجة. + صبغ ، + تم الحصول على صور الألياف لنفس المنطقة كل 5 دقائق. قضبان المقياس 20 ميكرومتر. الألياف لها 35 ميكرومتر. اللوحات عبارة عن صور مستوية مفردة من مكدسات z. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 11: توصيل الصبغة إلى فاكهة الفراولة باستخدام أفلام VACNF . (أ-ح) تم الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر. باستخدام طريقة الرقاقة ، تم تجفيف قطرات الصبغة على أفلام VACNF ، والتي تم لفها بعد ذلك على أسطح الفاكهة باستخدام أداة وضع المكياج. تم تسليم صبغة الفلوريسئين (10 ميكرومتر) إلى خلايا الفراولة وتصويرها بعد (أ) 10 دقائق و (ب) 1 ساعة (ج ، د) لا توجد ضوابط معالجة (-صبغ ، -ألياف). (E ، F) -صبغ ، + ألياف يتحكم بعد 10 دقائق و 1 ساعة على التوالي. (G ، H) + صبغ ، -تتحكم الألياف بعد 10 دقائق و 1 ساعة على التوالي. قضبان المقياس 40 ميكرومتر. الألواح A-H هي أقصى إسقاطات تبلغ 188 ميكرومتر z-stacks. الألياف لها 35 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 12: توصيل الصبغة والتحول العابر للتفاح عبر أفلام VACNF. (A-F) تم إنشاء الصور باستخدام المجهر متحد البؤر. باستخدام طريقة الرقاقة ، تم تجفيف قطرات 1 ميكرولتر من صبغة الفلوريسئين (10 ميكرومتر ، B و D) أو 1 ميكرولتر من ترميز البلازميد pUBQ₁₀: YFP (DNA − YFP) (200 نانوغرام) على أفلام VACNF ، والتي تم لفها بعد ذلك على أسطح الفاكهة باستخدام قضيب ماكياج. تم تسليم صبغة الفلوريسئين إلى بشرة التفاح وتصويرها بعد (ب) 10 دقائق و (د) 2 ساعة. (د) استغرقت الصبغة بعض الوقت لتنتشر في الخلايا بعد الولادة. توصيل الحمض النووي YFP والتعبير عنه عبر أفلام VACNF بعد (F) 48 ساعة (A ، C ، E) لا توجد ضوابط معالجة (-صبغ / DNA-YFP ، -ألياف). قضبان المقياس 40 ميكرومتر. اللوحات A-D هي صور مستوية مفردة من مكدسات z. اللوحات E و F هي الحد الأقصى لإسقاط مداخن z 53 ميكرومتر. الملعب الألياف هو 35 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى إشارات الفلوريسئين أو YFP. * يشير إلى الألياف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 13: التحول العابر لأوراق أرابيدوبسيس باستخدام طرق VACNFs على النبات أو على الرقاقة. (أ-H) تم الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر بعد 48 ساعة من تسليم الحمض النووي. (أ، ج، ه، ز) طريقة على النبات: تم وضع 1 ميكرولتر من ترميز البلازميد pUBQ₁₀: YFP (DNA−YFP) (200 نانوغرام) على الجانب المحوري لأوراق Arabidopsis. تم وضع الرقائق بحيث تتلامس مع القطرة ، وتستخدم أدوات الملقط للاستفادة من الشريحة في أنسجة الأوراق. (ب ، د ، و ، ح) طريقة الرقاقة: تم تجفيف 1 ميكرولتر من DNA−YFP (200 نانوغرام) لمدة 15 دقيقة على رقائق VACNF ثم تم النقر على أدوات الرقائق في الجانب المحوري من أوراق Arabidopsis بالملاقط. + DNA-YFP ، + ألياف ل (A) على النبات و (B) على الرقاقة. الضوابط: (C ، D) -DNA-YFP ، + الألياف ؛ (E,F) +DNA-YFP, -Fibers; و (G ، H) -DNA ، − الألياف. (I) رسم بياني لمتوسط كثافة إشارة التألق النسبي لمناطق 25 20 × 20 μm من صور 5 مكررات بيولوجية مجتمعة من 2-3 تجارب باستخدام مضان من قناة YFP. تم استبعاد المناطق التي تحتوي على الثغور (*) بسبب التألق الذاتي. تم طرح متوسط شدة التألق من حالة -DNA-YFP ، -Fiber من كل متوسط. تم استخدام 2-way ANOVA (واختبار Tukey) لاختبار الأهمية ، وتمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. تظهر الحروف المختلفة اختلافات كبيرة بين العلاجات (P < 0.0001). جميع الصور المعروضة هي إسقاطات قصوى تبلغ 40 ميكرومتر z−stacks. قضبان المقياس 20 ميكرومتر. تشير الأسهم البيضاء إلى الألياف في الصور. الملعب الألياف هو 35 ميكرومتر. أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Morgan et ^al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 14: التحول العابر للبصل باستخدام أفلام VACNF. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر بعد 48 ساعة من تسليم الحمض النووي. باستخدام طريقة الرقاقة ، تم تجفيف قطرات 1 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد المشفر pUBQ 10: YFP (DNA-YFP) (200 نانوغرام) على أفلام VACNF لمدة₁₀ دقائق ، والتي تم دحرجتها بعد ذلك على أسطح أعضاء النبات. (أ) تم تسليم الحمض النووي YFP إلى ، وتم التعبير عن YFP في بشرة البصل. (ب) عدم وجود رقابة على العلاج؛ (ج) التحكم (+ DNA-YFP ، -الألياف) و (د) التحكم (-DNA-YFP ، + الألياف). قضبان المقياس 40 ميكرومتر. الألياف لها 35 ميكرومتر. الصور هي إسقاطات قصوى تبلغ 115 ميكرومتر z-stacks. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 15: تلف الأنسجة في الخس من تطبيق فيلم VACNF . (A-D) تم إنشاء الصور باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. (أ) تم استخدام طريقة الرقاقة لتوصيل الحمض النووي إلى أوراق الخس عبر أفلام VACNF. pUBQ 10: تم تجفيف قطرات الحمض النووي YFP (200 نانوغرام) لمدة₁₀ دقائق على أفلام VACNF ، والتي تم لفها بعد ذلك على الجانب المحوري من أوراق الخس المنفصلة وتخزينها في غرفة الرطوبة لمدة 4 أيام. (ب) التحكم (-DNA-YFP ، + الألياف). (ج) التحكم (+ DNA-YFP ، -الألياف) ، و (د) عدم العلاج (-DNA-YFP ، -الألياف). قضبان المقياس 40 ميكرومتر. VACNFs لها 35 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى تلف النبات الناتج عن دحرجة الركيزة المرنة بقوة كبيرة. لاحظ أن تسليم الحمض النووي بوساطة VACNF بنجاح في الخس تم تحقيقه في تجارب أخرى⁷. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 16: سير عمل التسليم بوساطة VACNF في المصانع. في المرحلة الأولى ، تحقق من هندسة الألياف باستخدام SEM. للتسليم السليم ، تحتاج الألياف إلى طرف بقطر <200 نانومتر. في حالة استخدام الألياف على ركيزة مرنة ، ستكون الخطوة التالية هي التأكد من نقل الألياف إلى SU-8 والتحقق من ارتفاع الألياف المكشوفة عبر SEM. في المرحلة الثانية ، اختبرنا فائدة الألياف من خلال محاولة توصيل الصبغة إلى النبات / العضو المختار باستخدام ركيزة صلبة أو مرنة. استخدم قطرة 1 ميكرولتر ، إما وضعها على سطح النبات أو تجفيفها لفترة وجيزة على الرقاقة / الفيلم. مع هذه الخطوة وجميع الخطوات الأخرى ، من الضروري استخدام عناصر التحكم المناسبة (-صبغ ، -ألياف ؛ -صبغ ، + ألياف ؛ و + صبغ ، -ألياف) لتكون واثقا من أن الإشارة تأتي من تسليم صبغة حسن النية . في المرحلة الثالثة ، تأكد من وجود الجين محل الاهتمام في البلازميد ، وحدد تركيز الحمض النووي لتسليمه ، واختبر المقدار الأمثل من الوقت بعد الولادة للتحقق من التعبير. في المرحلة الرابعة ، تم تقييم النتيجة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للتحقق من تعبير العلامة المسلمة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Morgan et ^al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه الورقة ، قدمنا طرقا لبناء صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذاة رأسيا ، ونقل الألياف إلى ركيزة مرنة ، وتطبيق الألياف إما في ركيزة صلبة أو مرنة على النباتات لاستخدامها في توصيل الجزيئات الحيوية أو الأصباغ إلى النباتات. وصفنا طريقتين عامتين ، الطريقة على الرقاقة والطريقة على النبات ، لترسب المواد المدخلة وأظهرنا نتائج ناجحة في الألياف على ركيزة صلبة بالإضافة إلى طريقة الرقاقة باستخدام أفلام VACNF. تطبيق هذه الألياف أبسط في الممارسة والنظرية من طرق تحويل النبات التقليدية (قصف الجسيمات ، تحويل البروتوبلاست عن طريق PEG أو التثقيب الكهربائي) ويمكن استخدامها للنباتات المتمردة على التحول بوساطة Agrobacterium. ومع ذلك ، يتم تحويل عدد قليل من الخلايا فقط.

تم إنتاج ألياف الكربون النانوية المحاذاة رأسيا في مركز مختبر أوك ريدج الوطني لعلوم المواد النانوية من خلال برنامج المستخدم الخاص بهم. يمكن للمستخدمين التقدم بطلب لاستخدام هذا المرفق لإنتاج VACNFs. بدلا من ذلك ، يمكن إنتاج رقائق VACNF في غرف نظيفة مع آلات ترسيب البخار الكيميائي المحسنة بالبلازما بالتيار المباشر مع مصدر كربون^22,23. مع الطرق الموصوفة ، هناك بعض الخطوات التي تعتبر حاسمة لإنتاج الألياف ونقل الألياف وتطبيق رقائق / أفلام VACNF. لكي يعمل تطبيق الألياف ، يجب أن تكون الألياف مستقيمة ولها قطر مستدق يبلغ <200 نانومتر عند الطرف للتسليم في الخلايا النباتية لتكون ناجحة ^6,7 (الشكل 3). لإنشاء ألياف نانوية كربونية ذات حجم ودرجة معينة ، هناك مجموعة متنوعة من المعلمات التي يمكن تغييرها ، بما في ذلك حجم النقطة ، والملعب الجانبي ، وكمية المحفز المودعة. لتحديد حجم النقطة الأمثل لاستخدامه في إنتاج ألياف الكربون النانوية ، تمت زراعة الألياف من أحجام نقطية مختلفة (كما هو موضح في الشكل 5). وجدنا أن أقطار 300 نانومتر أنتجت أفضل الألياف ، ومن ثم تم اختيار حجم النقطة هذا (الشكل 5). بعد العثور على المعلمات الصحيحة ، تطلعنا إلى استخدام الرقائق التي تحتوي على >50٪ من الألياف ذات الهندسة المثالية (مستقيم وقطر طرف <200 نانومتر). للتحقق من هندسة الألياف ، استخدمنا المجهر الإلكتروني الماسح لتصوير مجالات الرؤية العشوائية على عينة من رقائق / أفلام VACNF.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون للألياف حد أدنى معين للطول لتحقيق التسليم داخل الخلايا النباتية. تكمن أهمية إنتاج ألياف ذات أطوال مختلفة في أنه يمكن استخدام ألياف أطول لاختراق طبقات الأنسجة العميقة. تعتبر الألياف الأطول (>40 ميكرومتر في الطول) ضرورية للأغشية المرنة حيث يعمل نقل الألياف عن طريق كسر الألياف من قاعدتها ويتطلب وضع طبقات SU-8 فوق الألياف. سمك العمل لطبقة SU-8 المستخدمة لهذا البروتوكول هو 20-35 ميكرومتر. الحد الأدنى للارتفاع اللازم لإنجاز التسليم داخل البشرة من النباتات المختلفة (منحنية أو مسطحة) هو 10-15 ميكرومتر ^6,7. نتيجة لذلك ، فإن الألياف ذات الأطوال >40 ميكرومتر ضرورية لأفلام VACNF. هناك العديد من المعلمات المختلفة التي يجب مراعاتها عند إنتاج ألياف الكربون النانوية: مادة المحفز ، وهندسة المحفز ، وسمك مادة المحفز بالإضافة إلى الظروف داخل غرفة PECVD (نسبة الغاز ، والضغط ، ودرجة الحرارة ، والتيار ، وارتفاع رأس الدش ، ووقت النمو) ⁸،⁹،^24،25. لإنتاج ألياف الكربون النانوية أطول من 25 ميكرومتر المستخدمة من قبل Morgan et ^al.7 و Davern et ^al.6 ، قمنا بزيادة كمية محفز Ni ، وقمنا بتغيير نسبة الأسيتيلين : الأمونيا ، وزدنا التيار ووقت النمو. بالإضافة إلى ذلك، أولينا المزيد من الاهتمام لهندسة المادة الحفازة. لإنتاج ألياف مستقيمة طويلة ، يجب أن يكون للمحفز المترسب شكل عفريت هوكي بدلا من شكل يشبه البركان (الشكل 4). تنشأ هياكل البركان من بقايا مقاومة الضوء بعد الإقلاع. لمنع تكوين البراكين ، تم استخدام طبقة مزدوجة من PMMA لإنشاء تقويض أثناء الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون²⁶. يساعد التقويض في رفع المحفز المعدني المترسب (الشكل 2). الطبقة السميكة من المحفز مهمة لنمو VACNFs الطويلة. تم فحص مورفولوجيا VACNFs بواسطة Merkulova et ^al.24. ترجع المحاذاة الرأسية ل VACNFs إلى كل من نمو طرف محفز Ni ومحاذاة جهد DC عموديا على الركيزة (الشكل 6). يصف رأس الدش هندسة مفاعل PECVD (الشكل 6) ويعمل كمصدر لإمكانات المجال الكهربائي²⁷.

لتحديد مجموعة النقاط الحفازة باستخدام الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون ، قمنا بتطبيق مقاومة شعاع الإلكترون (polymethyl methacrylate) ، ثم استخدمنا الحزمة الإلكترونية لعمل ثقوب صغيرة في المقاومة بشكل معين وفي مواقع محددة على الرقاقة. تم وضع ثقوب بالقطر المطلوب على شبكة منتظمة مع التباعد المحدد (الملعب) وتم تحميل ملف يحدد النمط المطلوب في أداة الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون قبل تحميل الركيزة في الجهاز. بالإضافة إلى ارتفاع الألياف ، هناك معلمة مهمة أخرى لنقل الألياف بنجاح وهي مقدار الوقت الذي يقضيه في حمام الأسيتون. يجب ترك أفلام VACNF في حمام الأسيتون لفترة كافية بحيث تبدأ حوافها في التجعد ؛ إذا تركت في حمام الأسيتون لفترة قصيرة جدا ، فمن الصعب رفع الرقائق وقد تنكسر. كلما كانت الرقائق أقدم ، كلما طالت مدة بقائها في حمام الأسيتون. بعد حمام الأسيتون ، تم وضع الأفلام / الرقائق في الأيزوبروبانول والماء لإزالة الأسيتون الوصول وكذلك لإزالة مقاومة الضوء الواقية على الألياف.

لأداء طلاء الدوران ، يتم وضع الرقائق أو قطع الويفر على ظرف فراغ في طلاء الدوران ، ويتم التحقق من الموضع المركزي للرقاقة باستخدام وظيفة الاختبار الخاصة بطلاء الدوران. يتم تطبيق بركة صغيرة (~ 2.5 سم في القطر) من المقاومة على مركز الرقاقة ونسج (3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية) يتم تضمين صور الألياف قبل وبعد طلاء الدوران في الشكل 8 الذي يوضح الحفاظ على هندسة الألياف (الارتفاع والاتجاه ودرجة الصوت). يؤدي وجود الألياف إلى مقاومة جيدة في قاعدة الألياف وينتج عنها طبقات أكثر سمكا من المتوقع. تم استكشاف الطلاء الدوار بعد نمو VACNF من قبل مجموعات أخرى^11,18.

خطوة أخرى في العملية ذات أهمية حيوية هي ضمان تطبيق القدر المناسب من القوة على رقائق / أفلام VACNF. تعتمد آلية التوصيل على الألياف التي تصنع ثقوبا صغيرة في جدران الخلايا عبر القوة الدافعة للملقط الذي ينقر على ركائز صلبة ^6,7 أو يتدحرج باستخدام قضيب المكياج الصغير على ركائز مرنة. قد تنفصل الألياف أو لا تنفصل وتظل مضمنة في الخلايا النباتية ^6,7 دون التأثير على النتيجة ، ولكن الممارسة جنبا إلى جنب مع فحص امتصاص الصبغة وتلف الأنسجة ضرورية للحصول على الضغط الصحيح. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم اختيار نقاط زمنية مناسبة للتصوير بعد تسليم الحمض النووي باستخدام رقائق / أفلام VACNF حيث يختلف وقت التعبير القابل للكشف بين الأنواع النباتية وأنواع النواقل التي يتم تسليمها⁷ (الشكل 16).

على الرغم من أن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على النباتات ، إلا أن لها بعض القيود. على سبيل المثال ، لا تؤدي إضافة طبقة رقيقة من أكسيد السيليكون إلى أفلام VACNF دائما إلى أن تكون الأفلام محبة للماء تماما بسبب الطبقة الواقية من مقاومة الضوء المضافة أعلى SU-8. إذا تحققت هذه المشكلة ، يمكن تطبيق طبقات أكثر سمكا من أكسيد السيليكون على VACNFs. لاختبار ما إذا كانت الأفلام كارهة للماء أو محبة للماء ، يمكن وضعها في الماء. إذا غرقت الأفلام ، فهي محبة للماء ، وإذا طفت ، فهي كارهة للماء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون هناك اختلاف بين دفعات الألياف المنتجة. هناك العديد من المعلمات التي يمكن تغييرها عند زراعة الألياف في آلة dc -PECVD ؛ ما هو موضح في هذا البروتوكول هو مجموعة من المعلمات لكميتين مختلفتين من محفز النيني. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن التحكم في الاتجاه البلوري لمحفز Ni²⁸ وستؤدي بعض التفرعات حتما إلى الألياف.

بينما أظهرنا توصيل صبغة الفلوريسئين والحمض النووي إلى الخلايا النباتية باستخدام ركائز صلبة ومرنة لهذه الورقة ، يجب أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الجزيئات الحيوية الأخرى ونهج التعديل الوراثي ، على سبيل المثال ، إسكات RNAi للأنظمة النباتية مثل التفاح أو الفواكه الأخرى حيث يستغرق الأمر سنوات لإنتاج خطوط معدلة وراثيا مستقرة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الألياف لتقديم مواد التحرير الجيني أو للتحولات المستقرة في النباتات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct	Fastenal	690535
2-Propanol (IPA)	Fischer Scientific	A451-4
4" Lid	Entegris	H22-401-0615	Wafer Carriers
4" tray	Entegris	H22-40-0615	Wafer Carriers
Accretech SS10 dicing saw	Accreteck	SS10
Acetone	Fischer Scientific	A18-4
Acetone used in the cleanroom at ORNL	JT Baker	9005-05
Apples	Grocery store	No product number
Arabidopsis thaliana	Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago	No product number
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine	Oak Ridge National Laboratory	Custom-built
Cobham Green lettuce	Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis	No product number	Butterhead lettuce
Fluorescein dye	Sigma Aldrich	F2456-2.5G
Gel-box	Gel-Pak	AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool	Heidelberg	DWL 66
ImageJ	National Institues of Health	No product number
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL	Doe and Ingalls	CMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system	JEOL	8100
Kimwipes	Kimtech	Kimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish	VWR	11019-554
Layout Editor	juspertor GmbH	No product number
LSM 710 confocal microscope	Zeiss	No product number
LSM 800 confocal microscope	Zeiss	No product number
Make-up applicator	Amazon	G2PLUS	500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS
Merlin field emission scanning electron microscope	Zeiss	Merlin
MIBK/IPA  (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)	Microchem	M089025
Onions	Grocery store	No product number
Oxford FlexAl atomic layer deposition	Oxford	FlexAl
PMMA 495 A4	Microchem	M130004
PMMA 950 A4	Microchem	M230004	Can dilute down to A2
Polyethylene terephthalate (PET)	Amazon	KS-6304-21-11	Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc
Precision tweezers	Aven Inc.	18032TT
pUBQ10:YFP-GW	Arabidopsis Biological Resource Center	CD3-1948
Silicon etcher (used for descum)	Oxford	Plasmalab
Silicon rubber kit	Smooth-On Inc	Ecoflex 00-20
Silicon wafers	Pure Wafer	4N0.001-.005SSP-INV
Spin coater	Brewer Sciences	Model 100CB
SPR 955cm 0.7	Megaposit	10018314
Strawberries	Grocery store	No product number
SU-8 2015	Microchem	SU-8 2000 Series	Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 developer	Microchem	SU-8 2000 Series	Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Suss MicroTec contact aligner	Suss MicroTec	MA6/BA6
Table top microscope	Phenom XL	used for checking Ni catalysts after metal deposition
Thermionics VE-240 e-beam evaporator	Thermionics	VE-240