בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

Abstract

מערכת העיכול מבצעת מגוון תפקודים חיוניים לחיים. פגמים מולדים המשפיעים על התפתחותה יכולים להוביל להפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, המדגישות את החשיבות להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי. במחקר זה, אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה כדי להשיג תאים חיים וברי קיימא אשר יכולים לשמש לניתוח ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). פרוטוקול זה מבוסס על דיסקציה ידנית של המעי של דג הזברה, ואחריה דיסוציאציה אנזימטית עם פפאין. לאחר מכן, תאים נשלחים למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ותאים בני קיימא נאספים עבור scRNA-seq. בשיטה זו הצלחנו לזהות בהצלחה סוגים שונים של תאי מעי, כולל תאי אפיתל, סטרומה, דם, שרירים ומערכת החיסון, כמו גם תאי עצב אנטריים ותאי גליה. לכן, אנו רואים את זה להיות משאב יקר ערך לחקר הרכב מערכת העיכול בבריאות ומחלות, באמצעות דג הזברה.

Introduction

מערכת העיכול (GI) היא מערכת מורכבת הממלאת תפקיד חיוני בבריאות וברווחה הכללית. הוא אחראי על העיכול והספיגה של חומרים מזינים, כמו גם חיסול של מוצרי פסולת ^1,2. מערכת העיכול מורכבת ממספר סוגי תאים, כולל תאי אפיתל, תאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון ומערכת העצבים האנטרית (ENS), אשר מתקשרים באופן הדוק זה עם זה כדי לווסת ולשמור על תפקוד מעיים תקין ^3,4,5. לפגמים בהתפתחות מערכת העיכול יכולות להיות השפעות מרחיקות לכת על היבטים שונים כגון ספיגת חומרים מזינים, הרכב המיקרוביוטה, ציר המעי-מוח וה-ENS, מה שמוביל למספר הפרעות נוירומוסקולר....

Protocol

כל גידול דגי הזברה והניסויים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות של ארסמוס MC וחקיקת רווחת בעלי חיים. השימוש בזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה נופל תחת הקטגוריה של ניסויים שאינם דורשים אישור אתי רשמי, כפי שנקבע בתקנות ההולנדיות.

1. השגת 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי בר ו-tg (phox2bb:GFP)

1. הקימו רבייה של דגי זברה פראיים ואספו 50 ביצים בתווך E3 חוצץ HEPES (להלן E3) בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ. השתמשו בדגים אלה כבקרה שלילית למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FAC).
2. הקימו רבייה של דגי זברה tg (phox2bb:GFP) ואספו כ-300 ביצים ב-E3 בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ.
3. יש לשמור ביצים מופרות ב-E3 (מקסימ....

תוצאות

בעזרת פרוטוקול זה השגנו בידוד ודיסוציאציה מוצלחים של מעיים שלמים מ-5 זחלי dpf. באמצעות שימוש בפפאין כאנזים דיסוציאציה, שיפרנו באופן משמעותי את יכולת הקיום של התא, ואפשרנו לכידה של 46,139 אירועים המערבים תאים יחידים בני קיימא (6.4% מכלל התאים) מתוך 244 מעי מבודדים (איור 2A). זחלי הבר ה?.......

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה לבידוד ודיסוציאציה של המעיים של 5 זחלי דגי זברה dpf באמצעות FACS. בשיטה זו, סוגי תאי מעיים שונים נאספו ונותחו בהצלחה על ידי scRNA-seq, תוך שימוש בפלטפורמת 10x Genomics Chromium. בחרנו בקו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), מאחר שרצינו אינדיקציה לכך שגם תאי ENS בני קיימא יבודדו (איור 2D).......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154