בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

Abstract

מערכת העיכול מבצעת מגוון תפקודים חיוניים לחיים. פגמים מולדים המשפיעים על התפתחותה יכולים להוביל להפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, המדגישות את החשיבות להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי. במחקר זה, אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה כדי להשיג תאים חיים וברי קיימא אשר יכולים לשמש לניתוח ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). פרוטוקול זה מבוסס על דיסקציה ידנית של המעי של דג הזברה, ואחריה דיסוציאציה אנזימטית עם פפאין. לאחר מכן, תאים נשלחים למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ותאים בני קיימא נאספים עבור scRNA-seq. בשיטה זו הצלחנו לזהות בהצלחה סוגים שונים של תאי מעי, כולל תאי אפיתל, סטרומה, דם, שרירים ומערכת החיסון, כמו גם תאי עצב אנטריים ותאי גליה. לכן, אנו רואים את זה להיות משאב יקר ערך לחקר הרכב מערכת העיכול בבריאות ומחלות, באמצעות דג הזברה.

Introduction

מערכת העיכול (GI) היא מערכת מורכבת הממלאת תפקיד חיוני בבריאות וברווחה הכללית. הוא אחראי על העיכול והספיגה של חומרים מזינים, כמו גם חיסול של מוצרי פסולת ^1,2. מערכת העיכול מורכבת ממספר סוגי תאים, כולל תאי אפיתל, תאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון ומערכת העצבים האנטרית (ENS), אשר מתקשרים באופן הדוק זה עם זה כדי לווסת ולשמור על תפקוד מעיים תקין ^3,4,5. לפגמים בהתפתחות מערכת העיכול יכולות להיות השפעות מרחיקות לכת על היבטים שונים כגון ספיגת חומרים מזינים, הרכב המיקרוביוטה, ציר המעי-מוח וה-ENS, מה שמוביל למספר הפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, כגון מחלת הירשפרונג וחסימת מעיים כרונית ^6,7. הפרעות אלה מאופיינות בחוסר תנועתיות חמור של המעי הנגרם על ידי שינויים בתאי מפתח שונים, כגון תאי interstitial של Cajal, תאי שריר חלק, ואת ENS ^6,8,9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי עדיין אינם מובנים היטב.

דג הזברה הוא אורגניזם מודל רב ערך לחקר התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי שלה בשל התפתחותה העוברית המהירה, שקיפותה בשלבים עובריים וזחליים, ויכולת גנטית 10,11,12,13,14. קיימים קווי דגי זברה טרנסגניים רבים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. דוגמה לקו כזה היא דג הזברה tg(phox2bb:GFP), המשמש בדרך כלל לחקר ENS, שכן כל תאי phox2bb+, כולל נוירונים אנטריים, מסומנים^15,16. כאן, באמצעות קו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים של זחלי 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) לצורך ניתוח ריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) (איור 1).

Protocol

כל גידול דגי הזברה והניסויים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות של ארסמוס MC וחקיקת רווחת בעלי חיים. השימוש בזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה נופל תחת הקטגוריה של ניסויים שאינם דורשים אישור אתי רשמי, כפי שנקבע בתקנות ההולנדיות.

1. השגת 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי בר ו-tg (phox2bb:GFP)

1. הקימו רבייה של דגי זברה פראיים ואספו 50 ביצים בתווך E3 חוצץ HEPES (להלן E3) בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ. השתמשו בדגים אלה כבקרה שלילית למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FAC).
2. הקימו רבייה של דגי זברה tg (phox2bb:GFP) ואספו כ-300 ביצים ב-E3 בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ.
3. יש לשמור ביצים מופרות ב-E3 (מקסימום 50 ביצים לצלחת) במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות, באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.
4. ב 1 dpf, להסיר ביצים מופרות ולתת אלה מופרות להתפתח ל 5 dpf.
5. בחר זחלי tg (phox2bb:GFP) ב- 1 dpf.

2. דיסוציאציה של זחלים שלמים

1. מרדימים 5 זחלי dpf עם 0.016% טריקאין.
2. קוצצים 30 דגי זברה לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח בצלחת פטרי המכילה 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA 10x.
3. מעבירים את דג הזברה הקצוץ לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח כולל של 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA 10x ומשאירים על קרח למשך 3 שעות. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 כל שעה כדי לעורר דיסוציאציה.

3. בידוד המעי

1. מניחים 6-10 5 זחלי dpf מורדמים עם 0.016% טריקאין ברציפות, על צלחת אגרוז 1.8% (0.45 גרם אגרוז ב 25 מ"ל של E3), תחת מיקרוסקופ דיסקציה
2. שים סיכת חרק אחת בראשו של דג הזברה.
3. הסר את כל E3 הנותרים באמצעות רקמה.
4. בודדו את המעי באמצעות סיכת חרקים אחרת, מבלי להפריע לאיברים אחרים. ודאו שהחלמון מוסר (איור משלים S1A).
5. לאחר הבידוד, בדוק את המעי והסר את כל החומר שאינו מעיים (למשל, עור, שומן, כבד) במידת הצורך.
6. אספו את המעי בפינצטה והניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה, המכיל מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 10% נסיוב עגל עוברי (FCS), על קרח.
   הערה: יש לבודד לפחות 244 מעיים, תוך שמירה על זמן הדיסקציה הכולל על 3 שעות. זה אפשרי עם שני אנשים שעובדים במקביל.

4. דיסוציאציה של המעי

1. מיד לאחר הדיסקציה של כל המעיים, צנטריפוגה את צינור microcentrifuge במהירות מלאה (13,800 × גרם) במשך 30 שניות.
2. הסר את PBS / 10% FCS אך השאר כמות קטנה (~ 100 μL) כדי למנוע מהמעיים להתייבש. הוסף 500 μL של 2.17 מ"ג / מ"ל פפאין HBSS המכיל CaCl₂ ו MgCl_2, כדי לנתק תאים.
3. הפעל פפאין עם 2.5 μL של ציסטאין (1 M).
4. לדגור את המעיים באמבט מים ב 37 ° C במשך 10 דקות. פיפטה למעלה ולמטה באמצע הדרך (לאחר 5 דקות) כדי לעורר עיכול רקמות אנזימטי.
5. העבר תאים לצינור FACS באמצעות מסננת תאים של 35 מיקרומטר, שהורטבה מראש עם 0.5 מ"ל של PBS / 10% FCS.
6. שטפו את המסננת על ידי הוספת סך של 2 מ"ל PBS / 10% FCS בשלבים של 0.5 מ"ל.
7. צנטריפוגה ב 700 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
8. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 300 μL של PBS / 10% FCS.
9. הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לתייג תאים מתים (1:1,000) ודגר במשך 5 דקות כדי לאפשר את הוצאתם במהלך FACS.

5. העשרת FACS

1. השתמשו בדגימת wildtype כדי לקבוע את השערים של אוכלוסיית התאים הממוינת על-ידי רישום 3,000 תאים על ציטומטר הזרימה (איור משלים S1B-E).
2. השתמש בפייה של 100 מיקרומטר, קבע דיוק מיון על טוהר, והכניס את צינור האיסוף המכיל 200 μL של PBS / 5% FCS, למכונת FACS.
3. העמיסו את תרחיף התאים של המעי ומינו תאים בודדים חיים (DAPI-שליליים) לתוך צינור האיסוף (איור 2C), על-ידי אי הכללת תאים כפולים (איור 2B) ותאים מתים (איור 2C).
   הערה: עבור דגי הזברה tg(phox2bb), היחס בין תאי GFP⁺ נבדק רק לצורך סימוכין, מכיוון שכל התאים החיים הבודדים ממוינים.
4. שמור את צינור האיסוף על קרח לאחר מיון תאים.
5. ספרו את תרחיף התא עם המוציטומטר, כולל בדיקת כדאיות עם טריפאן כחול. אם הכדאיות היא לפחות 80%, המשך לשלב הבא.
6. תאים מוכנים כעת לעיבוד עבור scRNAseq (כלומר, פלטפורמת כרום גנומיקה 10x). השתמש בכ- 20,000 תאים לדגימה.

תוצאות

בעזרת פרוטוקול זה השגנו בידוד ודיסוציאציה מוצלחים של מעיים שלמים מ-5 זחלי dpf. באמצעות שימוש בפפאין כאנזים דיסוציאציה, שיפרנו באופן משמעותי את יכולת הקיום של התא, ואפשרנו לכידה של 46,139 אירועים המערבים תאים יחידים בני קיימא (6.4% מכלל התאים) מתוך 244 מעי מבודדים (איור 2A). זחלי הבר ה?...

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה לבידוד ודיסוציאציה של המעיים של 5 זחלי דגי זברה dpf באמצעות FACS. בשיטה זו, סוגי תאי מעיים שונים נאספו ונותחו בהצלחה על ידי scRNA-seq, תוך שימוש בפלטפורמת 10x Genomics Chromium. בחרנו בקו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), מאחר שרצינו אינדיקציה לכך שגם תאי ENS בני קיימא יבודדו (איור 2D)...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154