シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

要約

ここでは、ゼブラフィッシュ仔魚の受精後5日目の腸管分離法について、シングルセルRNAシーケンシング解析法について述べる。

要約

消化管は、生命に不可欠なさまざまな機能を果たしています。その発達に影響を与える先天性欠損は、腸管性神経筋障害につながる可能性があり、消化管の発達と機能障害の根底にある分子メカニズムを理解することの重要性を強調しています。本研究では、ゼブラフィッシュ仔魚を受精後5日目に腸管から分離し、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)解析に使用できる生細胞を採取する方法を紹介します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腸の手動解剖と、それに続くパパインとの酵素解離に基づいています。その後、細胞を蛍光活性化セルソーティングにかけ、生細胞をscRNA-seq用に収集します。この方法により、上皮細胞、間質細胞、血液細胞、筋肉細胞、免疫細胞、腸神経細胞、グリアなど、さまざまな種類の腸細胞を同定することに成功しました。したがって、ゼブラフィッシュを使用して、健康と病気における消化管の組成を研究するための貴重なリソースであると考えています。

概要

消化管は、全体的な健康と幸福に重要な役割を果たす複雑なシステムです。それは栄養素の消化と吸収、そして老廃物の除去に関与しています^1,2。消化管は、上皮細胞、平滑筋細胞、免疫細胞、腸神経系(ENS)など、複数の細胞タイプで構成されており、これらは密接に通信して適切な腸機能を調節および維持しています^3,4,5。消化管の発達における欠陥は、栄養吸収、微生物叢組成、腸脳軸、ENSなどのさまざまな側面に広範囲に影響を及ぼし、ヒルシュスプルング病や慢性腸偽閉塞などのいくつかの腸管性神経筋障害につながる可能性があります^6,7。これらの障害は、カハールの間質細胞、平滑筋細胞、ENS ^6,8,9などのさまざまな主要細胞の変化によって引き起こされる重度の腸管運動障害を特徴としています。しかし、消化管の発達と機能障害の根底にある分子メカニズムはまだよく....

プロトコル

すべてのゼブラフィッシュの飼育と実験は、エラスムスMCおよび動物福祉法の制度的ガイドラインに従って行われました。受精後5日目のゼブラフィッシュ幼生の使用は、オランダの規制で概説されているように、正式な倫理的承認を必要としない実験のカテゴリーに分類されます。

1. 受精後5日(dpf)野生型とtg(phox2bb:GFP)幼虫の獲得

1. 野生型ゼブラフィッシュの繁殖を設定し、15cmのシャーレに入れたHEPES緩衝E3培地(以下、E3)に50個の卵を採取します。これらの魚を蛍光活性化細胞選別(FAC)のネガティブコントロールとして使用してください。
2. tg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュの繁殖を設定し、E3で約300個の卵を15cmシャーレに集めます。
3. 受精卵をE3(最大50個/皿)で14時間/10時間の明暗サイクルで、28.5°Cのインキュベーターで保管します。
4. 1dpfで、未受精卵を取り除き、受精卵を5dpfに成長させます。
5. tg(phox2bb:GFP)幼虫を1dpfで選別します。

2. 野生型幼虫全体の解離

1. 5 dpfの幼虫に0.016%トリカインを麻酔します。....

ディスカッション

ここでは、FACSを用いた5dpfゼブラフィッシュ仔魚の腸内分離・解離法について紹介する。この方法では、10x Genomics Chromium プラットフォームを使用して、scRNA-seq によるさまざまな腸細胞の収集と解析に成功しました。tg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュ系統を選択したのは、生存可能なENS細胞も単離されることを示すためでした(図2D)。ただし、phox2bbゲーティングは神経?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154