Выделение кишечника из личинок данио-рерио для секвенирования одноклеточной РНК

Резюме

Здесь мы опишем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для анализа секвенирования РНК одной клетки.

Аннотация

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) выполняет ряд функций, необходимых для жизни. Врожденные дефекты, влияющие на его развитие, могут привести к нервно-мышечным расстройствам кишечника, что подчеркивает важность понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для получения живых, жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Этот протокол основан на ручном рассечении кишечника данио-рерио с последующей ферментативной диссоциацией папаином. Затем клетки подвергают флуоресцентно-активированной клеточной сортировке, а жизнеспособные клетки отбирают для scRNA-seq. С помощью этого метода мы смогли успешно идентифицировать различные типы кишечных клеток, включая эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные и иммунные клетки, а также кишечные нейроны и глию. Поэтому мы считаем его ценным ресурсом для изучения состава желудочно-кишечного тракта в норме и при заболеваниях, используя рыбок данио.

Введение

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) — это сложная система, которая играет жизненно важную роль в общем здоровье и благополучии. Он отвечает за переваривание и усвоение питательных веществ, а также за выведение продуктов жизнедеятельности ^1,2. Желудочно-кишечный тракт состоит из нескольких типов клеток, включая эпителиальные клетки, гладкомышечные клетки, иммунные клетки и энтеральную нервную систему (ЭНС), которые тесно взаимодействуют друг с другом, регулируя и поддерживая надлежащую функцию кишечника ^3,4,5. Дефекты развития желудочно-кишечного тракта могут иметь далеко идущие последствия для различных аспектов, таких как всасывание питательных веществ, состав микробиоты, ось кишечник-мозг и ЭНС, приводя к ряду кишечных нервно-мышечных заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга и хроническая кишечная псевдообструкция ^6,7. Эти расстройства характеризуются тяжелой дисмоторикой кишечника, вызванной изменениями в различных ключевых клетках, таких как интерстициальные клетки Кахаля, гладкомышечные клетки и ENS ^6,8,9. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта, до сих пор плохо изучены.

Рыбка данио-рерио является ценным модельным организмом для изучения развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта благодаря своему быстрому эмбриональному развитию, прозрачности на эмбриональной и личиночной стадиях, а также генетической трактовке 10,11,12,13,14. Существуют многочисленные трансгенные линии данио-рерио, экспрессирующие флуоресцентные белки. Примером такой линии является рыбка данио-рерио tg(phox2bb:GFP), обычно используемая для изучения ЭНС, поскольку все клетки phox2bb+, включая энтеральные нейроны, помечены^15,16. Здесь, используя линию данио-рерио tg(phox2bb:GFP), мы представляем метод кишечной изоляции личинок через 5 дней после оплодотворения (dpf) для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) (рис. 1).

протокол

Все разведение рыбок данио и эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами Erasmus MC и законодательством о благополучии животных. Использование личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения подпадает под категорию экспериментов, которые не требуют формального этического одобрения, как указано в голландских правилах.

1. Получение личинок дикого типа и tg(phox2bb:GFP) через 5 дней после оплодотворения (dpf)

1. Наладьте разведение рыбок данио-рерио дикого типа и соберите 50 яиц в среде E3 с буфером HEPES (далее E3) в чашке Петри диаметром 15 см. Используйте этих рыб в качестве отрицательного контроля для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FAC).
2. Наладьте разведение данио-рерио tg(phox2bb:GFP) и соберите около 300 икринок в E3 в чашке Петри диаметром 15 см.
3. Храните оплодотворенные яйца в E3 (максимум 50 яиц в чашке) в течение 14 ч/10 ч светлый/темный, в инкубаторе при температуре 28,5 °C.
4. При 1 dpf удалите неоплодотворенные яйцеклетки и дайте оплодотворенным развиться до 5 dpf.
5. Выберите личинки tg(phox2bb:GFP) при 1 dpf.

2. Диссоциация целых личинок дикого типа

1. Обезболивайте личинки 5 dpf 0,016% трикаином.
2. Измельчите 30 рыбок данио на мелкие кусочки с помощью лезвия бритвы в чашке Петри, содержащей 1 мл 10-кратного раствора трипсина-ЭДТА.
3. Переложите измельченных данио-рерио в микроцентрифужную пробирку общим объемом 2 мл 10-кратного раствора трипсина-ЭДТА и оставьте на льду на 3 ч. Пипетка вверх и вниз пипеткой P1000 каждый час, чтобы стимулировать диссоциацию.

3. Изоляция кишечника

1. Помещают 6-10 личинок 5 dpf, обезболинных 0,016% трикаином, в ряд, на 1,8% агарозную пластину (0,45 г агарозы в 25 мл Е3), под микроскопом для вскрытия
2. Вставьте одну булавку для насекомых в голову рыбки данио.
3. Удалите все оставшиеся E3 с помощью салфетки.
4. Изолируйте кишечник с помощью другого булавки от насекомых, не потревожив другие органы. Убедитесь, что желток удален (дополнительный рисунок S1A).
5. После изоляции осмотрите кишечник и при необходимости удалите весь некишечный материал (например, кожу, жир, печень).
6. Соберите кишечник пинцетом и поместите его в микроцентрифужную пробирку, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS) с 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует изолировать минимум 244 кишечника, сохраняя общее время вскрытия 3 ч. Это возможно при параллельной работе двух человек.

4. Диссоциация кишечника

1. Сразу после вскрытия всех кишечников центрифугировать микроцентрифужную пробирку на полной скорости (13 800 × г) в течение 30 с.
2. Удалите PBS/10% FCS, но оставьте небольшое количество (~100 мкл), чтобы предотвратить высыхание кишечника. Добавьте 500 мкл папаина 2,17 мг/мл в HBSS, содержащий CaCl₂ и MgCl_2, для диссоциации клеток.
3. Активируйте папаин 2,5 мкл цистеина (1 М).
4. Кишки инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 мин. Пипетка вверх и вниз на полпути (через 5 минут) для стимуляции ферментативного переваривания тканей.
5. Пересадите клетки в пробирку FACS с помощью ситечка для клеток 35 мкм, предварительно смочив 0,5 мл PBS/10% FCS.
6. Промойте ситечко, добавив в общей сложности 2 мл PBS/10% FCS с шагом 0,5 мл.
7. Центрифугу при 700 × г в течение 5 мин при 4 °С.
8. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл PBS/10% FCS.
9. Добавьте 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для мечения мертвых клеток (1:1000) и инкубируйте в течение 5 мин, чтобы обеспечить их исключение во время FACS.

5. Обогащение FACS

1. Используйте образец дикого типа, чтобы установить ворота отсортированной клеточной популяции, записав 3000 клеток на проточный цитометр (дополнительный рисунок S1B-E).
2. Используйте сопло 100 мкм, установите точность сортировки по чистоте и поместите сборную пробирку, содержащую 200 мкл PBS/5% FCS, в машину FACS.
3. Загрузите клеточную суспензию кишечника и отсортируйте живые (DAPI-отрицательные), одиночные клетки в пробирку для сбора (Рисунок 2C), исключив дублеты (Рисунок 2B) и мертвые клетки (Рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для рыбок данио-рерио tg(phox2bb) пропорция клеток GFP⁺ проверяется только для справки, так как все одиночные живые клетки сортируются.
4. После сортировки клеток держите сборную пробирку на льду.
5. Подсчитывают клеточную суспензию гемоцитометром, включая проверку жизнеспособности трипановым синим. Если жизнеспособность составляет не менее 80%, переходите к следующему шагу.
6. Теперь клетки готовы к обработке scRNAseq (т.е. 10-кратной платформы Genomics Chromium). Используйте примерно 20 000 клеток на образец.

Результаты

С помощью этого протокола мы добились успешной изоляции и диссоциации всего кишечника от 5 личинок dpf. Используя папаин в качестве фермента диссоциации, мы значительно повысили жизнеспособность клеток, позволив зафиксировать 46 139 событий, связанных с одиночными жизнеспособными клетка?...

Обсуждение

В данной работе мы представляем метод выделения и диссоциации кишечника личинок данио-рерио 5 dpf с использованием FACS. С помощью этого метода различные типы клеток кишечника были успешно собраны и проанализированы с помощью scRNA-seq с использованием платформы 10x Genomics Chromium. Мы выбрали линию ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154