Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Abstract

Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l'importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell'intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.

Introduzione

Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell'assorbimento dei nutrienti, nonché dell'eliminazione dei prodotti di scarto ^1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale ^3,4,5. I difetti nello sviluppo del tratto gastrointestinale possono avere effetti di vasta portata su vari aspetti come l'assorbimento dei nutrienti, la composizione del microbiota, l'asse intestino-cervello e l'ENS, portando a diversi disturbi neuromuscolari enterici, come la malattia di Hirschsprung e la pseudo-ostruzione intestinale cronica ^6,7. Questi disturbi sono caratterizzati da una grave dismotilità intestinale causata da alterazioni in varie cellule chiave, come le cellule interstiziali di Cajal, le cellule muscolari lisce e l'ENS ^6,8,9. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale sono ancora poco compresi.

Il pesce zebra è un prezioso organismo modello per lo studio dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale grazie al suo rapido sviluppo embrionale, alla trasparenza durante le fasi embrionali e larvali e alla trattabilità genetica 10,11,12,13,14. Sono disponibili numerose linee di zebrafish transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Un esempio di tale linea è il pesce zebra tg(phox2bb:GFP), comunemente usato per studiare l'ENS, poiché tutte le cellule phox2bb+, compresi i neuroni enterici, sono marcate^15,16. Qui, utilizzando la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale di larve 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) (Figura 1).

Protocollo

Tutti gli allevamenti e gli esperimenti di zebrafish sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali dell'Erasmus MC e la legislazione sul benessere degli animali. L'uso di larve di pesce zebra a 5 giorni dalla fecondazione rientra nella categoria degli esperimenti che non richiedono un'approvazione etica formale, come delineato dalle normative olandesi.

1. Ottenimento di 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) wildtype e larve di tg (phox2bb: GFP)

1. Avviare l'allevamento di zebrafish wildtype e raccogliere 50 uova in terreno E3 tamponato con HEPES (di seguito denominato E3) in una capsula di Petri da 15 cm. Utilizzare questi pesci come controllo negativo per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FAC).
2. Impostare l'allevamento di pesce zebra tg(phox2bb:GFP) e raccogliere circa 300 uova in E3 in una capsula di Petri da 15 cm.
3. Conservare gli ovuli fecondati in E3 (massimo 50 uova/piatto) con un ciclo di luce/buio di 14 ore/10 ore, in un'incubatrice a 28,5 °C.
4. A 1 dpf, rimuovere gli ovuli non fecondati e lasciare che quelli fecondati si sviluppino fino a 5 dpf.
5. Selezionare le larve di tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.

2. Dissociazione di larve intere di tipo selvatico

1. Anestetizzare 5 larve dpf con lo 0,016% di tricaina.
2. Tritare 30 zebrafish in piccoli pezzi usando una lama di rasoio in una capsula di Petri contenente 1 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA.
3. Trasferire il pesce zebra tritato in una provetta per microcentrifuga con un volume totale di 2 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA e lasciare sul ghiaccio per 3 ore. Pipettare su e giù con una pipetta P1000 ogni ora per stimolare la dissociazione.

3. Isolamento intestinale

1. Posizionare 6-10 larve da 5 dpf anestetizzate con tricaina allo 0,016% in fila, su una piastra di agarosio all'1,8% (0,45 g di agarosio in 25 mL di E3), sotto un microscopio da dissezione
2. Metti uno spillo per insetti nella testa del pesce zebra.
3. Rimuovere tutto l'E3 rimanente utilizzando un fazzoletto.
4. Isolare l'intestino usando un altro spillo per insetti, senza disturbare gli altri organi. Assicurarsi che il tuorlo sia stato rimosso (Figura supplementare S1A).
5. Una volta isolato, ispezionare l'intestino e rimuovere tutto il materiale non intestinale (ad es. pelle, grasso, fegato) se necessario.
6. Raccogliere l'intestino con una pinzetta e metterlo in una provetta per microcentrifuga, contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), su ghiaccio.
   NOTA: È necessario isolare un minimo di 244 intestini, mantenendo il tempo totale di dissezione a 3 ore. Questo è fattibile con due persone che lavorano in parallelo.

4. Dissociazione intestinale

1. Subito dopo la dissezione di tutti gli intestini, centrifugare la provetta per microcentrifuga alla massima velocità (13.800 × g) per 30 s.
2. Rimuovere il PBS/10% FCS ma lasciarne una piccola quantità (~100 μL) per evitare che l'intestino si secchi. Aggiungere 500 μL di papaina 2,17 mg/mL in HBSS contenente CaCl₂ e MgCl₂ per dissociare le cellule.
3. Attivare la papaina con 2,5 μL di cisteina (1 M).
4. Incubare le budella a bagnomaria a 37 °C per 10 min. Pipettare su e giù a metà (dopo 5 minuti) per stimolare la digestione enzimatica dei tessuti.
5. Trasferire le cellule in una provetta FACS utilizzando un filtro cellulare da 35 μm, prebagnato con 0,5 mL di PBS/10% FCS.
6. Lavare il filtro aggiungendo un totale di 2 mL di PBS/10% FCS con incrementi di 0.5 mL.
7. Centrifugare a 700 × g per 5 minuti a 4 °C.
8. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 300 μL di PBS/10% FCS.
9. Aggiungere 1 μg/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per marcare le cellule morte (1:1.000) e incubare per 5 minuti per consentirne l'esclusione durante la FACS.

5. Arricchimento FACS

1. Utilizzare il campione wildtype per impostare le porte della popolazione cellulare ordinata registrando 3.000 cellule sul citometro a flusso (Figura supplementare S1B-E).
2. Utilizzare un ugello da 100 μm, impostare la precisione di ordinamento sulla purezza e inserire la provetta di raccolta contenente 200 μL di PBS/5% FCS nella macchina FACS.
3. Caricare la sospensione cellulare dell'intestino e selezionare le singole cellule vive (DAPI-negative) nella provetta di raccolta (Figura 2C), escludendo i doppietti (Figura 2B) e le cellule morte (Figura 2C).
   NOTA: Per il pesce zebra tg(phox2bb), la proporzione di cellule GFP⁺ viene controllata solo come riferimento, poiché tutte le singole cellule vive vengono ordinate.
4. Tenere la provetta di raccolta su ghiaccio dopo lo smistamento delle cellule.
5. Contare la sospensione cellulare con un emocitometro, incluso un controllo di vitalità con blu di tripano. Se la fattibilità è almeno dell'80%, continuare con il passaggio successivo.
6. Le cellule sono ora pronte per l'elaborazione per scRNAseq (cioè la piattaforma 10x Genomics Chromium). Utilizzare circa 20.000 cellule per campione.

Risultati

Con questo protocollo, abbiamo ottenuto con successo l'isolamento e la dissociazione di interi intestini da 5 larve dpf. Utilizzando la papaina come enzima di dissociazione, abbiamo migliorato significativamente la vitalità cellulare, consentendo la cattura di 46.139 eventi che coinvolgono singole cellule vitali (6,4% di tutte le cellule) su 244 intestini isolati (Figura 2A). Le larve intere di tipo selvatico sono state utilizzate come controllo per garantire che il processo di selezione fo...

Discussione

Qui, presentiamo un metodo per l'isolamento e la dissociazione dell'intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un'indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154